李妙媛，唐坤泉，李映妮，熊 磊

（1.柳州市婦幼保健院/廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

直腸給藥是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)外治法，此方法應(yīng)用范圍廣泛，見效快，療效可靠，操作簡便，兒童較易接受。但目前直腸給藥多為中藥煎劑或中成藥稀釋液，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)與要求，除了個別中成藥栓劑外，尚缺乏中成藥灌腸專用制劑，影響了灌腸療法的普及和推廣。熱毒寧注射液是兒科臨床常用的中成藥，是由中藥青蒿、金銀花、梔子制成的現(xiàn)代中藥制劑，具有清熱、疏風(fēng)、解毒功效，有研究提示熱毒寧具有退熱、抗病毒、抗感染及提高免疫力的作用[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)熱毒寧注射液對單純皰疹病毒HSV、腸道病毒71 型、流感病毒H1N1、柯薩奇病毒等均有抑制作用[4-7]。熱毒寧也是中醫(yī)兒科臨床診療指南中治療手足口病的A級推薦用藥，中藥灌腸療法是中醫(yī)兒科臨床診療指南中治療手足口病的B 級推薦療法。為了明確熱毒寧注射液直腸給藥的安全性，本研究進行幼年大鼠的急性毒性實驗及直腸黏膜刺激實驗。

1 資料與方法

1.1 實驗藥物 熱毒寧注射液（10 mL/支）：由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。批號：國藥準(zhǔn)字Z20050217。

1.2 實驗動物 SPF 級SD 5 周齡幼鼠40 只，體質(zhì)量（140±10）g，雌雄各半，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證編號為SCXK（湘）2019-0004。室溫：（23±2）°C，相對濕度：（60±10）%，光暗周期：12 h。經(jīng)過1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后開始實驗。

1.3 急性毒性實驗 取5 周齡SPF 級幼鼠20 只，雌雄各半，將雌雄幼鼠按性別隨機分為4 組，每組5 只，將4 組幼鼠不同性別之間隨機組合為2 組，每組10只，雌雄各半，分為對照組和實驗組。因熱毒寧注射液濃度和幼鼠腸道體積限制，且熱毒寧注射液藥物毒性低，單次灌腸給藥無法測定半數(shù)致死量（LD50），故據(jù)大鼠直腸容納最大量（20 mL/kg）予以最大給藥量實驗。實驗組每次以熱毒寧注射液最大濃度（35 g 生藥/10 mL）和最大容積20 mL/kg 灌腸，對照組以等量0.9%生理鹽水灌腸。灌腸時，經(jīng)幼鼠肛門置入導(dǎo)管，深度約5 cm，推注受試液，限制幼鼠活動，2 h 后再分別給幼鼠重復(fù)給藥，藥物用量均同第1 次，共灌腸3次，相當(dāng)于幼兒臨床給藥量30 倍。灌腸后放入籠中，在室溫：（23±2）°C，相對濕度：（60±10）%，光暗周期：12 h 條件下飼養(yǎng)。觀察并記錄給藥后30 min、2 h及隨后7 d 幼鼠外觀、四肢活動、飲食、排泄、體質(zhì)量等情況。每日觀察幼鼠毒性反應(yīng)情況，記錄癥狀出現(xiàn)、加重、減輕或死亡的時間和出現(xiàn)反應(yīng)的幼鼠數(shù)量，計算幼鼠死亡率，出現(xiàn)死亡幼鼠立即解剖，觀察其內(nèi)臟病理變化。

1.4 直腸黏膜刺激實驗 取5 周齡SPF 級幼鼠20只，雌雄各半，將雌雄幼鼠按性別隨機分為4 組，每組5 只，將4 組幼鼠不同性別之間隨機組合為2 組，每組10 只，雌雄各半，分為對照組和實驗組。實驗組使用熱毒寧注射液2 mL/kg 灌腸給藥，對照組以等量0.9%生理鹽水灌腸，每日1 次。給藥后，限制幼鼠活動2 h，以保證藥液與直腸黏膜接觸，連續(xù)灌腸7 d。每日觀察幼鼠外觀、體質(zhì)量、飲食、肛門、四肢活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等情況。第8 d 脫頸處死后檢查直腸黏膜，并取該部位（距肛門2～10 cm）的腸段，經(jīng)固定、切片、HE 染色等處理后，進行光鏡觀察，了解其組織結(jié)構(gòu)狀況，觀察局部黏膜刺激情況，具體黏膜刺激分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 局部黏膜刺激及反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)

表2 熱毒寧注射液灌腸急性毒性實驗對小鼠死亡情況的影響

表3 灌腸前后2 組幼鼠體質(zhì)量變化

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件處理資料，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，屬于正態(tài)分布采用t 檢驗，屬于非正態(tài)分布采用秩和檢驗方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

2.1.1 幼鼠一般情況及死亡率 實驗組在首日連續(xù)灌腸30 min 后出現(xiàn)短暫活動減少、進食減少及輕度反應(yīng)冷漠外無明顯的其他毒性反應(yīng)，約當(dāng)日灌腸結(jié)束2 h 后恢復(fù)，灌腸后實驗組大鼠口鼻及肛門無異常分泌物，與對照組幼鼠無明顯差異。連續(xù)觀察7 d，動物一般情況良好，活動自如，皮毛光滑，飲食及大小便均未見明顯異常；無死亡幼鼠，實驗結(jié)束處死所有幼鼠，解剖后肉眼觀察幼鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟未見異常。

2.1.2 幼鼠體質(zhì)量變化 熱毒寧注射液灌腸給藥后，觀察7 d 后幼鼠體質(zhì)量變化情況。灌腸前2 組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），具有可比性；灌腸后2 組間體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），提示熱毒寧灌腸對幼鼠體質(zhì)量無影響。對照組、實驗組灌腸前后自身體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），提示2 組幼鼠體質(zhì)量均增長。

2.2 直腸黏膜刺激實驗結(jié)果

2.2.1 幼鼠一般情況 給藥后每日觀察幼鼠外觀、體質(zhì)量、飲食、肛門、四肢活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等情況均正常。2 組體質(zhì)量均呈現(xiàn)明顯增長（P＜0.05），具體見表4。

表4 灌腸前后2 組幼鼠體質(zhì)量變化

2.2.2 直腸黏膜刺激性 第8 d 脫頸處死幼鼠后檢查直腸黏膜，解剖觀察灌腸部位黏膜完整，無異常分泌物，血管走形清晰，無局部硬結(jié)。光鏡下腸黏膜完整，腺體結(jié)構(gòu)無改變，黏膜腺體間無淋巴細胞浸潤，上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，部份黏膜下血管可見輕中度充血，肌層完整。黏膜刺激分級參照見表1，評分結(jié)果見表5，切片HE 染色見圖1。

圖1 直腸黏膜刺激實驗病理切片（HE 染色×100）

3 討論

《臨證指南醫(yī)案·幼科要略》強調(diào)“小兒熱病最多者，以體屬純陽，六氣著人，氣血皆化為熱也，飲食不化，蘊蒸于里，亦從熱化矣”，從中醫(yī)學(xué)角度分析兒童疾病以熱性居多，且多與飲食不節(jié)導(dǎo)致胃腸功能受損相關(guān)，并最終引起呼吸道、泌尿系統(tǒng)等疾病發(fā)生，這與現(xiàn)代黏膜免疫系統(tǒng)理論中黏膜在局部誘導(dǎo)后各處黏膜出現(xiàn)共同免疫應(yīng)答的觀點是吻合的。即當(dāng)某處黏膜受到免疫刺激后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，可能通過黏膜免疫調(diào)節(jié)途徑將免疫信號傳達至另一處，從而將局部刺激擴大成一個系統(tǒng)或多個系統(tǒng)，甚至全身的免疫應(yīng)答[8]。我們推測此類免疫應(yīng)答是中藥灌腸療法起效的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)，但此方法是否會損傷黏膜或存在毒副作用，這是臨床人員關(guān)注的問題。熱毒寧注射液是常用清熱解毒制劑，它不僅可降低患者機體肺部的炎癥反應(yīng)、降低外周血炎癥指標(biāo)[9]，并且能降低并發(fā)癥，改善臨床指標(biāo)[10]，但臨床由于中成藥靜脈使用的過敏風(fēng)險而逐漸被限制使用或不敢使用，筆者臨床常用熱毒寧注射液直腸用藥治療手足口病、皰疹性咽峽炎等獲效，但其毒副反應(yīng)還需進一步驗證。該急性毒性實驗采用最大藥量法進行，以幼鼠腸道體積允許的最大劑量給予幼鼠熱毒寧注射液，觀察幼鼠出現(xiàn)的急性毒性反應(yīng)及體質(zhì)量變化。以幼鼠灌腸的最大體積給藥量為20 mL/kg，24 h 內(nèi)灌腸給藥3 次（相當(dāng)于兒童臨床每日等效用量的30 倍），當(dāng)日未見明顯毒性反應(yīng)，與對照組幼鼠表現(xiàn)無明顯差異；7 d 后，觀察兩組間幼鼠體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組體質(zhì)量增長幅度一致，提示安全無毒性反應(yīng)。熱毒寧注射液臨床給藥兒童每日劑量為0.6 mL/kg，對應(yīng)大鼠實驗劑量是2 mL/kg，連續(xù)給藥7 d，熱毒寧注射液直腸給藥對大鼠直腸黏膜刺激性與對照組刺激性水平相當(dāng)，黏膜未見損傷及未見分泌物，部分可見輕中度充血，評為輕度刺激性，考慮可能與多次灌腸反復(fù)刺激腸粘膜及黏膜在短時間內(nèi)超負荷吸收有關(guān)。本次實驗條件下，使用熱毒寧注射液相當(dāng)于30 倍臨床靜脈使用劑量予大鼠直腸給藥未見急毒性反應(yīng)，表明熱毒寧制劑單次灌腸毒性非常低，符合安全性要求，提示擬定的兒童臨床灌腸劑量安全無毒。臨床劑量灌腸未見對直腸黏膜明顯損傷，與既往相關(guān)中藥灌腸研究結(jié)果相符[11]。

該實驗表明：（1）熱毒寧注射液單次灌腸給藥無法測定LD50，在最大給藥量時對幼鼠無急性毒副作用，故臨床擬用熱毒寧注射液直腸給藥是安全的。（2）熱毒寧注射液多次直腸給藥對幼鼠直腸黏膜有輕度刺激性，但對黏膜組織無病理性損傷。綜上，提示熱毒寧注射液直腸給藥符合安全性要求，可供進一步臨床研究使用。