張錚惠，李 霞,張建華，陳旭清，倪利曉

（1. 無錫市河湖治理和水資源管理中心，江蘇 無錫 214071；2.江蘇省水利廳生態(tài)河湖處，江蘇 南京 210029；3. 河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；4.河海大學(xué)淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，江蘇 南京 210098）

0 引言

近年來水體富營養(yǎng)化問題已經(jīng)成為世界環(huán)境的巨大挑戰(zhàn)之一，特別是在歐洲[1-5]和中國[6-9]，情況更加嚴(yán)峻。 根據(jù)聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署的最新報告《第五次全球環(huán)境展望(GEO-5)》[10]，全世界超過40%的水體正遭受中度或重度富營養(yǎng)化。 高濃度的P 和N直接在湖泊、河流和其他生態(tài)系統(tǒng)中造成藻類水華（藍(lán)藻），同時導(dǎo)致植物和藻類的過度生長[5]。藍(lán)藻水華能夠嚴(yán)重消耗自然水系統(tǒng)中的O2，同時大量的藻細(xì)胞生物阻礙了光對沉水植被的照射穿透，導(dǎo)致水生植物死亡，水環(huán)境群落受到嚴(yán)重破壞[11-12]。除了上述危害之外，藍(lán)藻水華還會產(chǎn)生大量的次生代謝物質(zhì)，如藻毒素，這些藻毒素可以被其他水生生物攝取并累積，使藍(lán)藻水華對其他生物生命的危害變得更加致命[13]，同時，藻毒素被釋放到水體中并進(jìn)入公共供水系統(tǒng)，一旦飲用了含有藻毒素的飲用水，將嚴(yán)重危害人類的生命健康[14]。

藍(lán)藻水華的存在造成的直接、間接經(jīng)濟(jì)損失不計其數(shù)[15]，控制藍(lán)藻水華十分必要。 目前，生物化感效應(yīng)因其無二次污染和經(jīng)濟(jì)性等優(yōu)點受到研究者的廣泛關(guān)注。青蒿素是一種由植物黃花蒿產(chǎn)生和釋放的化感物質(zhì)，因其優(yōu)秀的抗瘧效果而被人們知曉。 據(jù)報道，青蒿素及其衍生物不僅具有抗瘧的功效而且還具有潛在的植物毒性，在一些單子葉和雙子葉植物中，顯示出抑制幼苗生長的作用[16]。 因此，不少研究者開始關(guān)注青蒿素對藻類的化感效應(yīng)。BHARATI A 等[17]發(fā)現(xiàn)青蒿素作為藻細(xì)胞的PSII 系統(tǒng)中次級醌（QB）的抑制劑，可以抑制光合系統(tǒng)中的電子傳遞效率。 NI L X 等[18-19]從黃花蒿中分離鑒定出抑藻活性物質(zhì)青蒿素，并通過抑藻試驗證實青蒿素能夠引起藻細(xì)胞生理功能紊亂。 由此可見，青蒿素對藍(lán)藻具有較強(qiáng)的抑制效果。本文通過離子交聯(lián)法制備了青蒿素緩釋微粒，并通過測定在青蒿素緩釋微粒脅迫下藻細(xì)胞生物量，光合色素合成，胞外電導(dǎo)率變化、核酸和蛋白質(zhì)含量變化，胞內(nèi)活性氧（ROS）活性，研究其對銅綠微囊藻的抑制機(jī)理，為藍(lán)藻水華的治理提供了新的方法和思路。

1 方法和材料

1.1 銅綠微囊藻的培養(yǎng)

銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，F(xiàn)ACHB905）由中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻類培養(yǎng)庫提供 （中國武漢）。 接種前，將所有培養(yǎng)基和燒瓶于121 ℃高壓滅菌30 min。 供試銅綠微囊藻接種到BG-11 培養(yǎng)基中在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中明、暗比為14 ∶10，光照強(qiáng)度為3 000 lux。所有樣品1式3 份，每天搖動3 次，隨機(jī)更換位置以避免沉淀和光照不均。

1.2 青蒿素緩釋微粒的制備

通過離子交聯(lián)制備青蒿素緩釋微粒[20]。 步驟如下：①在質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的海藻酸鈉溶液中加入青蒿素（純度98%，上海阿拉丁生化科技有限公司），得到混合液； ②將混合液滴入含體積分?jǐn)?shù)為1%的殼聚糖（脫乙酰度≥95%，粘度為100 ～ 200 mPa·s，上海阿拉丁生化科技有限公司）和質(zhì)量濃度為6 mg/mL 的CaCl2（AR，上海國藥化學(xué)試劑有限公司)酸性水溶液中；③將懸浮液離心（8 000 r/min,30 min），清洗并冷凍干燥，以獲得青蒿素緩釋微粒。

1.3 青蒿素緩釋微粒對銅綠微囊藻抑制效果

參考ISO8692—2012 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抑藻試驗。初始藻密度為1.6 ×106cells/mL，同時設(shè)置1 個空白對照組和1 個青蒿素緩釋微粒處理組（投加之前課題組研究出具有最佳抑藻效果的青蒿素緩釋微粒質(zhì)量濃度為0.2 g/L），每組3 個平行，連續(xù)培養(yǎng)30 d。定期用紫外分光光度計在680 nm 處測定各組培養(yǎng)液中銅綠微囊藻的藻密度。前期試驗獲得藻密度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線公式如下：

式中：Y 為藻細(xì)胞密度，× 105cells/mL；X 為680 nm波長處的光密度。

抑制率計算公式為：

式中： IR 為抑制率（Inhibition Ratio），%；N0為空白對照組藻細(xì)胞密度，×105cells/mL；N 為處理組藻細(xì)胞密度，×105cells/mL。

1.4 葉綠素a 濃度的測定

測定葉綠素a 濃度具體步驟如下：①取20 mL青蒿素處理后的銅綠微囊藻置于離心管內(nèi)低速離心（3 000 r/min，10 min），棄上清液,再用蒸餾水重復(fù)步驟清洗2 遍；②向剩下的固體中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容至5 mL，然后將樣品冷凍，再將冷凍好的樣品放置于避光的環(huán)境下融化，重復(fù)操作3 次； ③將樣品進(jìn)行高速離心后 （12 000 r/min，3 min），倒出上清液，以體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇為空白對照在波長665 和750 nm 測定其吸光度，根據(jù)公式計算葉綠素a 含量。

式中：ρ 為葉綠素a 的質(zhì)量濃度，mg/L；A665和A750分別為乙醇萃取液于波長665 和750 nm 的吸光度。

1.5 藻液蛋白、核酸、電導(dǎo)率、活性氧的測定

藻液蛋白、核酸、電導(dǎo)率的測定方法如下[21]：取20 mL 藻液，將其置于高速離心機(jī)中于6 000 r/min下離心10 min，取上清液。 一部分用于測定在其280 nm 處的吸光度值，即為藻液中的蛋白含量，測定260 nm 處的吸光度值即為藻液中核酸含量，剩余部分用于測定電導(dǎo)率和活性氧自由基。

用流式細(xì)胞儀測定活性氧（ROS）活性，流式細(xì)胞儀的參數(shù)為λ激發(fā)= 488 nm，λ發(fā)射= 525 nm，根據(jù)熒光強(qiáng)度的均值來表征ROS 的活性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

在表型數(shù)據(jù)分析中，數(shù)據(jù)分析采用Excel 2019和SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件，并采用單因素方差分析（ANOVA），然后應(yīng)用鄧肯后驗 （Duncan Post-hoc test）處理組間的顯著差異（p < 0.05）。 數(shù)值均采用均值± 誤差值，均值為3 組平行數(shù)據(jù)的均值，最后用Origin 2019 繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 青蒿素緩釋微粒對銅綠微囊藻的抑制率

在最佳投放劑量下，研究單次投放青蒿素緩釋微粒對初始密度為1.6 × 106cells/mL 的銅綠微囊藻的生長抑制作用。青蒿素緩釋微粒對銅綠微囊藻藻密度與抑制率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 青蒿素緩釋微粒對銅綠微囊藻的影響

由圖1 可以看出，該微粒具有良好的抑藻性能。 在試驗的前10 d，試驗組的藻密度增大速率明顯小于空白組的，同時抑制率也驗證了這一點。 抑制率在前10 d 的迅速增加可能是由于緩釋微粒的表面附著了一定量的青蒿素，一旦將微粒放入中，這部分青蒿素就可以從微粒表面轉(zhuǎn)移到藻類溶液中，青蒿素在藻液中的積累量迅速增加[24]。 第10 ～20 d，微粒持續(xù)釋放青蒿素到藻液中，青蒿素對銅綠微囊藻的抑制率持續(xù)增大，但是增速放緩。 20 d后微粒釋放青蒿素與抑藻消耗的青蒿素均達(dá)到動態(tài)平衡，抑制率也保持穩(wěn)定，最終接近98%，此時藻液已經(jīng)近乎是透明的狀態(tài)，這與已有的抑藻試驗研究結(jié)果一致[25-26]。 以上研究表明青蒿素緩釋微粒對藻類生長的抑制具有持久性。

2.2 青蒿素緩釋微粒對藻細(xì)胞葉綠素a 含量的影響

葉綠素a 作為藻類主要色素之一，通常被用來評估藻類的光合作用。青蒿素緩釋微粒脅迫下藻細(xì)胞葉綠素a 濃度變化見圖2。

圖2 葉綠素a 濃度變化

由圖2 可以看出，空白組在0～5 d 內(nèi)葉綠素a濃度基本保持不變，從第5 天開始到試驗結(jié)束，葉綠素a 的濃度保持一定增速，與2.1 中空白組藻密度的增長趨勢一致。青蒿素緩釋微粒組在試驗周期內(nèi)，葉綠素a 濃度持續(xù)降低，在0 ～ 15 d 內(nèi)降低速率較慢，15 ～ 20 d 內(nèi)降低速率最快，20 ～ 30 d 內(nèi)濃度降低速率趨于平緩，在第30 天時葉綠素a 質(zhì)量濃度接近于0 mg/L。青蒿素緩釋微粒組的藻密度變化與葉綠素a 濃度變化趨勢一致，兩者之間有著密不可分的聯(lián)系[27]。 葉綠素a 濃度減少說明在青蒿素的脅迫下銅綠微囊藻的光合系統(tǒng)被破壞，藻細(xì)胞的光合色素生成通道受限，藻細(xì)胞光合作用被抑制，從而無法為藻細(xì)胞提供正常生理活動所需要的營養(yǎng)，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素緩釋微粒會抑制銅綠微囊藻葉綠素a 等光合色素的合成，進(jìn)而抑制藻膽蛋白的合成，最終抑制光反應(yīng)的進(jìn)行[25]。

2.3 青蒿素緩釋微粒對藻細(xì)胞膜通透性的影響

細(xì)胞膜是藻細(xì)胞的重要組成部分之一，能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)部生理環(huán)境不受外界影響。在化感物質(zhì)脅迫下銅綠微囊藻的細(xì)胞膜往往遭到破壞，藻細(xì)胞膜受損之后細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境失去保護(hù)，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)行正常生命活動。 研究通過對藻液中的電導(dǎo)率、核酸和蛋白含量的測定來評估青蒿素對銅綠微囊藻細(xì)胞膜的損傷。青蒿素緩釋微粒脅迫下銅綠微囊藻液中電導(dǎo)率核酸核酸蛋白、含量變化見圖3。

圖3 青蒿素緩釋微粒對藻細(xì)胞膜通透性的影響

由圖3（a）可以看出，空白組藻液中的電導(dǎo)率在試驗初期有輕微升高，隨后又回落并保持穩(wěn)定，總體變化較小。而青蒿素緩釋微粒組藻液的電導(dǎo)率則持續(xù)升高，從添加青蒿素后一直到試驗結(jié)束均處于升高趨勢中。 在整個試驗周期內(nèi)除BG-11 培養(yǎng)基中含有金屬鹽，會對電導(dǎo)率會有影響外，未添加其他的外源離子改變電導(dǎo)率，考慮到空白組和青蒿素緩釋微粒組中的BG-11 初始用量一致，故排除培養(yǎng)基對電導(dǎo)率測定的干擾影響。分析青蒿素緩釋微粒組的電導(dǎo)率持續(xù)升高的原因為青蒿素破壞了藻細(xì)胞膜造成細(xì)胞膜破裂，藻細(xì)胞內(nèi)的K+，Ca2+，F(xiàn)e3+和酸根離子等物質(zhì)泄露到藻液中。

由圖3（b）～（c）可以看出，空白組藻液中的核酸含量和蛋白含量在試驗前15 d 呈下降趨勢，在第16 ～30 d 內(nèi)幾乎保持不變，而青蒿素緩釋微粒組藻液中的兩者濃度總體上均呈上升趨勢。青蒿素緩釋微粒組2 種物質(zhì)的變化趨勢說明藻細(xì)胞受到了破壞，導(dǎo)致正常情況下難以透過細(xì)胞膜的大分子大量泄露到藻液中。ZHANG T T 等[28]利用酚酸類化感物質(zhì)破壞銅綠微囊藻細(xì)胞膜，導(dǎo)致藻液中蛋白質(zhì)和核酸含量大幅上升，與本文結(jié)論一致。

2.4 青蒿素緩釋微粒對藻細(xì)胞ROS 的影響

正常條件下，藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 和被細(xì)胞抗氧化機(jī)制清除的ROS 處于平衡狀態(tài)。 然而，隨著化感物質(zhì)的脅迫，細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的ROS 過度增加[29]，這些細(xì)胞內(nèi)過量的ROS 在被破壞的光合作用電子傳遞鏈內(nèi)的電子低效轉(zhuǎn)移下產(chǎn)生[31]，或者通過分子氧和三重態(tài)激發(fā)的葉綠素之間的反應(yīng)產(chǎn)生[30]。過量的ROS 可以損壞細(xì)胞各種生理機(jī)制，因此，測定ROS 的活性可以評估青蒿素對銅綠微囊藻的抑制作用。青蒿素緩釋微粒對銅綠微囊藻活性氧的影響見圖4。

圖4 銅綠微囊藻ROS 活性變化

由圖4 可以看出，空白組的自由氧活性在實驗未開始時最高，第5 天ROS 活性開始下降，在隨后的幾次測定中ROS 活性變化較小。 銅綠微囊藻對外界環(huán)境的改變具有相當(dāng)?shù)拿翡J性，并且會做出應(yīng)激反應(yīng)[31]。 將空白微粒加入到藻類中，銅綠微囊藻感受到外界環(huán)境的改變產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)ROS 活性增強(qiáng)。 空白微粒對銅綠微囊藻無毒性，所以在很短的時間內(nèi)藻細(xì)胞適應(yīng)了添加了空白微粒的環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)的ROS 活性又恢復(fù)正常水平。 青蒿素緩釋微粒組的ROS 活性隨著處理時間加長持續(xù)增長，活性均強(qiáng)于空白組，在第30 天時，ROS 活性強(qiáng)度達(dá)到空白組的3.5 倍。 由于青蒿素抑制藻細(xì)胞葉綠素合成并破壞光合作用系統(tǒng)，推測可能是青蒿素迫使藻細(xì)胞在光合系統(tǒng)中的低效率電子傳遞過程中產(chǎn)生了過量的ROS，也可能是青蒿素直接氧化藻細(xì)胞產(chǎn)生了過量的ROS。

3 結(jié)論

（1）使用質(zhì)量濃度為0.2 g/L 的青蒿素緩釋微粒進(jìn)行為期30 d 的抑藻試驗，試驗20 d 后抑制率保持穩(wěn)定，最終接近98%，說明青蒿素具有較好的抑藻效果；

（2）對青蒿素緩釋抑藻劑的抑藻機(jī)理為其通過降低葉綠素a 濃度，阻礙藻細(xì)胞進(jìn)行光合作用；同時，通過刺激藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，致使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，對藻細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生不可逆的損傷。