袁 丹, 袁茂莎, 石婷婷, 蒙澤飛, 劉英渠

(1. 貴州大學動物科學學院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

不同品種的香豬毛色和皮膚顏色各有差異,有“六白”或“不完全六白”的從江香豬、“兩頭烏”的劍白香豬、“全黑”“六白”或“不完全六白”的久仰香豬、“全黑”的環(huán)江香豬4個類型[1]。毛色和皮膚顏色的遺傳在家畜育種過程中一直備受關注,毛色和皮膚顏色被視為1個品種的主要特征。基因控制色素的形成和類型,從而決定動物的毛色和皮膚顏色。不同種屬動物的毛色和皮膚顏色由多個基因決定,并且能夠通過彼此間相互作用控制色素的產(chǎn)生[2]。MicroRNA(miRNA)是1類約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA序列,在生物體內(nèi)以多種方式存在[3]。miRNA通過與其靶基因的3’UTR端位點相結合,抑制或降解靶基因的表達,從而參與多種生物學過程的調(diào)控[4]。Quah S等[5]發(fā)現(xiàn)miR-615的主要產(chǎn)物可參與生長調(diào)節(jié)和一系列發(fā)育過程。鄭舒丹等[6]研究表明,存在少量miR-615的靶基因與色素沉著有關,其中色素沉著通路中篩選到TYR03、OCA2、IRF4、PLA2G6基因,對于研究miR-615調(diào)控毛色的機制有重要意義。目前對于miR-615的研究大量集中在人類疾病方面,在豬皮膚組織中的研究較少。本研究采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)研究miR-615在香豬不同顏色皮膚組織中的表達情況,為進一步研究miR-615調(diào)控豬皮膚色素沉積的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集貴州大學豬場的健康香豬耳部黑色皮膚組織和背部白色皮膚組織,剪成2 cm×2 cm大小,用錫箔紙包好置于液氮中,帶回實驗室后置于 -80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒(美國Life Technologies公司)。熒光定量PCR儀(型號:CFX96,美國ABI公司)、PCR擴增儀(型號:GeneAmp9600,美國ABI公司)。

1.3 引物

通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)的miRBase檢索豬miR-615序列,以miR-615的成熟序列為參考序列(Gene ID:100628344;miRBase:MI0017995),使用miRprimer 2.0 PCR測序引物軟件設計miR-615特異引物,并引用5S rRNA[7]基因為內(nèi)參基因,將設計的引物送北京擎科生物公司合成。引物信息見表1。

表1 qRT-PCR引物信息

1.4 皮膚組織總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol法分別提取香豬白色和黑色皮膚組織樣品的RNA,根據(jù)miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(KR211)操作指南反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應體系20 μL:Total RNA 4 μL,2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL,miRNA RT Enzyme Mix2 μL,RNase-Free ddH2O 4 μL。

1.5 qRT-PCR反應

采用miRcute 增強型 miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)進行qRT-PCR反應。反應體系20 μL:2×miRcute Plus miRNA Premix 10 μL,50×ROX Reference Dye 2 μL,Forward Primer 0.4 μL,Reverse Primer 0.4 μL,miRNA第一鏈 cDNA 1 μL,ddH2O 6.2 μL。每個樣品設3個重復。反應程序:95 ℃預變性15 min;94 ℃變性20 s,60 ℃退火 34 s,共40個循環(huán)。PCR反應結束后進行熔解曲線分析,分析條件:65 ℃ 5 s,95 ℃ 50 s。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將qRT-PCR的Ct值用Microsoft Excel 2019進行統(tǒng)計,應用 2-△△CT法進行miR-615相對表達量分析。以5S rRNA作為內(nèi)參基因,以黑色為對照組,采用SPSS17.0軟件的單因素方差分析,計算miR-615在香豬黑色和白毛色皮膚組織中的相對表達量。計算公式:△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因),△△Ct=△Ct(實驗組)-△Ct(對照組),2-△△Ct=相對表達量。

2 結果與分析

2.1 miR-615的擴增曲線和熔解曲線

由圖1可見:miR-615的擴增曲線拐點清晰,斜率較高,說明miR-615的擴增效率高;熔解曲線均為光滑的單峰曲線,且退火溫度附近無明顯雜峰,表明miR-615的qRT-PCR結果可信,符合實驗要求。由圖 2 可見:5S rRNA基因曲線整體平行性較好,曲線拐點清楚,基線平而無明顯上揚趨勢,擴增曲線符合標準的S形增長曲線;熔解曲線均為單峰,沒有出現(xiàn)非特異性擴增及引物二聚體,表明引物特異性良好,反應體系適合。

圖1 miR-615 qRT-PCR擴增曲線和熔解曲線

圖2 5S rRNA qRT-PCR擴增曲線和熔解曲線

2.2 miRNA-615在香豬不同顏色皮膚組織中的表達情況

由圖3可見:通過qRT-PCR的CT值分析,miR-615在香豬白色皮膚組織中的相對表達量較高,比黑色皮膚組織中的相對表達量高26倍左右,差異極顯著(P<0.01)。

圖3 miR-615在香豬黑色和白色皮膚組織中的相對表達量注:**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結論

本研究通過 qRT-PCR技術分析香豬不同顏色皮膚組織中miR-615的表達情況,結果表明miR-615在香豬白色皮膚組織中的表達量極顯著高于黑色皮膚,推測miR-615可抑制黑色素的生成,與香豬白色皮膚的形成有關。

4 討論

miRNAs是調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達的重要因子,參與多種重要的生理過程,如發(fā)育、代謝和疾病的發(fā)生[8]。miRNA參與皮膚、毛囊的發(fā)育和表皮穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),可以介導毛囊循環(huán)調(diào)節(jié)機制。大量研究表明,在人、豬、小鼠、山羊、綿羊的毛發(fā)生成周期的不同階段,皮膚中的miRNA表達發(fā)生顯著變化[9～12]。miR-615與生物體內(nèi)許多生理功能息息相關,有研究表明,miRNAs在細胞生長和凋亡、血細胞分化、同源基因調(diào)控、胰島素分泌、腦形態(tài)發(fā)生、心臟發(fā)育及胚胎發(fā)育后期過程中發(fā)揮重要作用[13]。Chunshu Hao等[14]研究表明,miR-221可抑制人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)表達,通過激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT信號通路,從而減輕心肌細胞(CMs)凋亡。S.Mardente等[15,16]發(fā)現(xiàn)在人乳頭狀癌衍生的長期細胞系中,miR-221在甲狀腺乳頭狀癌apd中過量表達。吳鴻福等[17]研究發(fā)現(xiàn),miR-615可能是創(chuàng)傷性神經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的潛在治療靶點。對于miR-615在豬皮膚組織中扮演的角色和作用還需要進一步探索研究。