于少飛 張佳美 周凌浩 曹麗美 柴少卿 馮萬(wàn)禹 李兆涵

過(guò)敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura,HSP)是兒童期常見(jiàn)與自身免疫相關(guān)的疾病,兒童中發(fā)生率為135/100萬(wàn)[1]。HSP的發(fā)病機(jī)制尚不明確,普遍認(rèn)為機(jī)體免疫功能失衡以及大量炎性細(xì)胞因子表達(dá)失衡在HSP、紫癜性腎炎(Henoch-Sch?nlein purpura nephritis,HSPN)發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。而且腎臟受損的嚴(yán)重程度是決定患兒預(yù)后的關(guān)鍵因素[2]。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box-1,HMGB1)是核DNA結(jié)合蛋白,一種促進(jìn)炎癥發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞因子,在體內(nèi)參與多種炎癥相關(guān)性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展。Chen等[3]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在HSP患兒血清中表達(dá)明顯升高,在HSPN患兒血清中表達(dá)升高更為顯著,促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生和釋放多種炎性細(xì)胞因子,使內(nèi)皮細(xì)胞受損。另有研究證實(shí)HMGB1是miR-218-5p的直接靶標(biāo)[4,5]。miRNA是不能翻譯為蛋白質(zhì)的RNA,在胞質(zhì)中發(fā)育成熟且具有生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn),miRNA在免疫性疾病中占據(jù)著重要地位[6]。國(guó)內(nèi)研究者對(duì)45例HSP兒童和27例健康對(duì)照組兒童進(jìn)行microRNA微陣列分析,發(fā)現(xiàn)miR-1-3p、miR-19b-1-5p和miR-29b-1-5p上調(diào),而miR-483-5p和miR-1246下調(diào)。本研究旨在對(duì)HSP、HSPN患兒外周血中miR-218-5p和HMGB1進(jìn)行定量檢測(cè),并與臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行分析,探討miR-218-5p及HMGB1在HSP患兒發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用。

材料與方法

1.研究對(duì)象：本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取2019年11月～2020年8月于內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院兒科住院診治的HSP及HSPN患兒各30例作為實(shí)驗(yàn)組,HSP組患兒男性17例,女性13例,平均年齡為5.93±3.70歲,HSPN組患兒男性14例,女性16例,平均年齡為5.87±2.93歲。選取同期于筆者醫(yī)院兒科門(mén)診體檢健康兒童30例作為對(duì)照組,男性16例,女性14例,平均年齡為6.67±3.56歲。本研究通過(guò)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理學(xué)審批號(hào)：202206002L)。

2.檢測(cè)指標(biāo)及方法：取上述3組兒童(HSP、HSPN均在起病急性期,入院24h內(nèi))外周靜脈血4ml分裝于EDTA抗凝管中,使用離心機(jī)3500r/min予以離心10min,取上清液血清置于-80℃冰箱保存,一管用于RT-PCR檢測(cè)miR-218-5p水平,取出-80℃冰箱儲(chǔ)存血清樣本,室溫下融化,取出試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取。然后取5μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,以檢測(cè)miRNA的完整性。用First Strand cDNA Synthesis Kit(with gDNA Eraser),Genenode Biotech LTD (編號(hào)：4203)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用FS384 real-time PCR system型熒光定量PCR儀,采用 RQ/2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。另一管用于ELISA法檢測(cè)HMGB1水平,從準(zhǔn)備試劑開(kāi)始按照實(shí)驗(yàn)步驟逐步進(jìn)行,最后繪制HMGB1標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)曲線方程式計(jì)算各個(gè)樣品的濃度值。同時(shí)收集HSP組、HSPN組兒童的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo),包括血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell,WBC)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(absolute neutrophil count,ANC)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(absolute lymphocyte count,ALC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell,RBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet,PLT)、尿素(urea,UREA)、肌酐(creatinine,CRE)、尿酸(uric acid,UA)。

結(jié) 果

1.一般資料比較：3組間兒童的年齡、性別比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,表1),3組基線資料數(shù)據(jù)具有可比性。

2.miR-218-5p、HMGB1的表達(dá)水平：3組間miR-218-5p和HMGB1比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且組間兩兩比較結(jié)果顯示,miR-218-5p為對(duì)照組顯著高于HSP組和HSPN組,HMGB1為HSPN組顯著高于HSP組和對(duì)照組(表2、圖1、圖2)。過(guò)敏性紫癜患兒的miR-218-5p和HMGB1呈顯著負(fù)相關(guān)(r<0,P<0.05,圖3)。

圖1 miR-218-5p在3組間表達(dá)比較

圖2 HMGB1在3組間表達(dá)比較

圖3 miR-218-5p與HMGB1表達(dá)相關(guān)性分析

表2 3組間miR-218-5p和HMGB1比較

3.HSP組、HSPN組兒童外周血miR-218-5p、HMGB1表達(dá)水平、臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)表達(dá)水平、腎臟損傷發(fā)生的相關(guān)性分析：HSP組、HSPN組兩組間各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較,WBC、ANC、miR-218-5p、HMGB1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且HSPN組的WBC、ANC、HMGB1均顯著高于HSP組,而miR-218-5p指標(biāo)顯著低于HSP組。HSP組與HSPN組比較,ALC、RBC、PLT、尿素、肌酐、血尿酸指標(biāo)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05,表3)。

表3 HSP、HSPN兩組間患兒各實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

4.HSP患兒發(fā)生腎損傷相關(guān)指標(biāo)的二元Logistic回歸分析：為了進(jìn)一步檢驗(yàn)單因素有差異的4個(gè)觀察指標(biāo)與是否發(fā)生腎損傷的相關(guān)性,尋找它們之間的關(guān)系,選擇二元Logistic回歸模型,將是否發(fā)生腎損傷作為因變量,將WBC、ANC、miR-218-5p、HMGB1共4個(gè)觀察指標(biāo)作為自變量,把所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后做二元Logistic回歸,詳見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,miR-218-5p、HMGB1共兩個(gè)指標(biāo)與發(fā)生腎損傷之間存在顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),而且miR-218-5p是影響發(fā)生腎損傷的獨(dú)立保護(hù)因素(OR<1),HMGB1是影響發(fā)生腎損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR>1)。而WBC、ANC共2個(gè)指標(biāo)均不是影響發(fā)生腎損傷的獨(dú)立影響因素(P均>0.05)。

表4 是否發(fā)生腎損傷的二元Logistic回歸分析

5.miR-218-5p、HMGB1預(yù)測(cè)腎臟損傷的ROC曲線：為得到miR-218-5p、HMGB1共2個(gè)指標(biāo)對(duì)于是否發(fā)生腎損傷的診斷價(jià)值,選擇ROC曲線分析,詳見(jiàn)圖4。得出miR-218-5p指標(biāo)曲線下面積0.930,95% CI：0.867～0.994,說(shuō)明miR-218-5p指標(biāo)診斷疾病效果較好。miR-218-5p診斷疾病的敏感度為76.7%,特異性為100.0%,對(duì)應(yīng)的截?cái)嘀禐?.515。HMGB1指標(biāo)曲線下面積0.929,95%CI：0.856～1.000,說(shuō)明HMGB1指標(biāo)診斷疾病效果較好。診斷指數(shù)=敏感度-(1-特異性),選擇診斷指數(shù)最大值為診斷截點(diǎn),當(dāng)敏感度為86.7%,特異性為90.0%時(shí)診斷指數(shù)最大為0.767,診斷效能較好,對(duì)應(yīng)的截?cái)嘀禐?348.200。

圖4 miR-218-5p、HMGB1預(yù)測(cè)腎損傷的ROC曲線

討 論

HSP是一種常見(jiàn)于兒童的白細(xì)胞碎裂性小血管炎癥性疾病,大多數(shù)HSP病例預(yù)后良好,但腎臟受累是決定發(fā)生率和病死率的最重要預(yù)后因素[7]。HSPN患兒嚴(yán)重者可表現(xiàn)為腎衰竭和高血壓。一項(xiàng)數(shù)據(jù)顯示,HSP的復(fù)發(fā)率是16.4%,而且這種復(fù)發(fā)與腎臟受損傷是密切相關(guān)的[8]?？梢?jiàn)HSPN在疾病中占據(jù)重要的地位,目前診斷HSPN缺乏特異性生物學(xué)標(biāo)志物,金標(biāo)準(zhǔn)為腎穿刺活組織病理檢查,為有創(chuàng)性檢查,患兒及家屬不易接受。為了減少疾病產(chǎn)生的家庭負(fù)擔(dān)和更好的診斷治療HSP病例,近年來(lái)研究者致力于探索HSP、HSPN發(fā)病機(jī)制的研究。

HMGB1在HSP發(fā)病機(jī)制中起促炎作用,研究還通過(guò)建立小鼠模型發(fā)現(xiàn),HMGB1阻斷劑明顯減輕血管炎,改善炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[9]。HMGB1是一種在細(xì)胞中普遍存在的核蛋白,它幾乎存在于所有類型的細(xì)胞中。除在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用外,還可被激活的炎性細(xì)胞、壞死的細(xì)胞、被巨噬細(xì)胞吞噬的凋亡細(xì)胞以及直接通過(guò)胞吐等方式釋放到細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用,介導(dǎo)免疫反應(yīng)的激活如炎癥趨化和細(xì)胞因子釋放[10]。上述功能也在疾病中得到證實(shí),如急性腎損傷患者腎小管上皮細(xì)胞的凋亡增加和炎性反應(yīng)的發(fā)生與HMGB1介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的釋放,如IL-6和TNF-α,具有明確相關(guān)性[11]。另外,在HSP及HSPN中,HMGB1可以通過(guò)誘導(dǎo)NF-κB的核轉(zhuǎn)位,使IL-6及TNF-α表達(dá)升高,血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)加重[3]。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探討HSP、HSPN發(fā)病機(jī)制,通過(guò)雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)到HMGB1在HSP患兒中表達(dá)增加,尤其在HSPN患兒中表達(dá)更為顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。為進(jìn)一步明確HMGB1的上游調(diào)控機(jī)制,結(jié)合以往研究結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)論證在HSP、HSPN患兒外周血中HMGB1的調(diào)控機(jī)制。

miR-218-5p是miRNA家族成員之一,miRNA可以在機(jī)體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié),對(duì)維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生重要作用。近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的miR-218有助于腎臟脈管系統(tǒng)的發(fā)育和修復(fù)[12]。另有實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析證明miR-218-5p可以靶向調(diào)控HMGB1表達(dá),在加入miR-218-5p 模擬物組雙熒光素酶活性明顯低于miR-218-5p 抑制劑組,并用Pearson分析顯示miR-218-5p與HMGB1呈明顯負(fù)相關(guān)[13]。體外實(shí)驗(yàn)證明在HSP模型中血管損傷處miR-218-5p表達(dá)明顯下降,HMGB1表達(dá)明顯升高,通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明二者之間呈明顯的負(fù)相關(guān),而且miR-218-5p靶向調(diào)控HMGB1的表達(dá),參與HSP發(fā)生、發(fā)展。miR-218-5p在HSP患兒外周血中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)miR-218-5p在HSP、HSPN患兒中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-218-5p在HSP患兒外周血中表達(dá)降低,在HSPN患兒表達(dá)中下降更為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,用Pearson相關(guān)分析miR-218-5p表達(dá)與HMGB1表達(dá)的相關(guān)性,顯示二者呈負(fù)相關(guān)。在HSP、HSPN患兒中,推測(cè)miR-218-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控HMGB1的表達(dá),影響下游炎性細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用。本研究又分析了miR-218-5p、HMGB1與臨床指標(biāo)之間預(yù)測(cè)腎損傷的可能性,得出HSP患兒是否發(fā)生腎損傷與miR-218-5p、HMGB1、WBC、ANC相關(guān),但與ALC、RBC、尿素、肌酐、血尿酸之間無(wú)顯著相關(guān)性。一項(xiàng)Meta分析數(shù)據(jù)證實(shí)中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值可作為預(yù)測(cè)HSP患者腎損傷發(fā)生的有效生物學(xué)標(biāo)志物[14]。本研究中同樣觀察到ANC與腎損傷發(fā)生存在相關(guān)性,還發(fā)現(xiàn)腎損傷與尿素、肌酐、血尿酸之間無(wú)明確相關(guān)性,可能與研究樣本量小以及選擇血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)作為預(yù)測(cè)腎損傷的發(fā)生相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Logistic回歸分析顯示,miR-218-5p是HSPN發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)性因素,HMGB1是HSPN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述,本研究對(duì)HSP、HSPN患兒體內(nèi)miR-218-5p、HMGB1的表達(dá)進(jìn)行探討,并與臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行綜合分析,得出miR-218-p可能為HSPN發(fā)生的獨(dú)立保護(hù)性因素,HMGB1可能是HSPN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。miR-218-5p、HMGB1可能為HSP患兒腎臟損傷發(fā)生的生物學(xué)標(biāo)志物,為臨床診斷、治療提供新靶點(diǎn)。