李 明 劉甜甜 朱含汀 方 勇 倪 濤

內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境中功能受損,增殖、遷移等功能下降,創(chuàng)面新生血管形成受阻,氧氣以及各種營養(yǎng)物質(zhì)等無法及時(shí)運(yùn)送到創(chuàng)面,是阻礙糖尿病創(chuàng)面愈合的重要因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)胰島素可作為一種“類生長(zhǎng)因子”樣激素,傷口外用可促進(jìn)肉芽組織的生長(zhǎng)發(fā)育和傷口愈合[2]。然而,糖尿病患者中約90%為2型糖尿病患者,組織存在胰島素抵抗,使胰島素作用的效果減弱。LED紅光價(jià)格低廉、安全性高,在臨床上應(yīng)用廣泛[3]。研究證實(shí)紅光可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,促進(jìn)血管新生進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,這似乎提示紅光可減弱細(xì)胞胰島素抵抗,兩者聯(lián)用可起到增效作用[4]。

PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的胰島素信號(hào)通路,并且在正常組織修復(fù)過程中至關(guān)重要[5,6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)由受O2調(diào)節(jié)的活性亞基HIF-α和結(jié)構(gòu)型亞基HIF-1β組成,是氧穩(wěn)態(tài)的主要控制器,Akt/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)HIF-1α的表達(dá),HIF-1介導(dǎo)編碼多種血管生成因子的基因轉(zhuǎn)錄增加,包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived facter-1,SDF-1)和血管生成素(angiopoietin,Ang)等,高血糖會(huì)抑制與HIF-1相關(guān)的靶基因的表達(dá)[7,8]。本研究構(gòu)建了糖尿病大鼠模型,進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn),以期能為L(zhǎng)ED紅光聯(lián)合胰島素外用治療糖尿病創(chuàng)面治療提供更多理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑、儀器：動(dòng)物購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,4周齡SPF級(jí)SD大鼠40只,體質(zhì)量為100±4g,倫理學(xué)審批號(hào)：SH9H-2019-A173-1,所有大鼠自由飲水以及進(jìn)食60%高脂飲食。STZ購自美國Sigma公司,短效胰島素購自丹麥諾和諾德公司,蘇木精-伊紅染液購自武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司,兔抗大鼠CD34、VEGF一抗購自美國Thermo Fisher Scientific公司,兔抗大鼠Akt、p-Akt、HIF-1α抗體購自美國美國Affinity Biosciences公司,山羊抗兔熒光二抗購自美國CST公司。LED紅光治療儀購自深圳普門公司。

2.動(dòng)物分組、造模：高脂飲食4周后,將大鼠隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組、紅光組、胰島素組、紅光聯(lián)合胰島素組,每組10只,對(duì)大鼠腹腔注射10mg/L的STZ進(jìn)行糖尿病造模,每千克劑量為50mg。造模成功后高脂飼養(yǎng)2周,麻醉大鼠,在背部對(duì)稱地制造4個(gè)1.5cm×1.5cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面,放置標(biāo)尺拍攝創(chuàng)面照片,在第7、10、14、21天,麻醉大鼠后,拍照。

3.創(chuàng)面處理：每?jī)商鞂?duì)紅光組及紅光聯(lián)合胰島素組大鼠運(yùn)用LED紅光對(duì)創(chuàng)面照射5min,能量密度為20J/cm2,對(duì)照組及胰島素組大鼠不進(jìn)行照射,對(duì)胰島素組及紅光聯(lián)合胰島素組大鼠每個(gè)創(chuàng)面滴加0.1ml 5U/ml的胰島素,對(duì)照組及紅光組滴加0.1ml 0.9%氯化鈉溶液。

4.創(chuàng)面取材：在第10、14天,每組隨機(jī)抽取2只大鼠,CO2處死后,剪取大鼠創(chuàng)緣組織,固定后制作切片。

5.創(chuàng)面新生血管情況：取創(chuàng)面組織進(jìn)行HE染色,觀察新生毛細(xì)血管及膠原等情況。

6.免疫組織化學(xué)染色：取石蠟組織,經(jīng)過組織脫蠟、抗原修復(fù)等步驟,滴加已稀釋的兔抗大鼠Akt、p-Akt、HIF-1α一抗(1∶100),在4℃冰箱中過夜,第2日滴加二抗孵育,滴加DAB顯色液顯色,再經(jīng)過復(fù)染、脫水、透明、封片等,在光學(xué)顯微鏡下觀察,拍攝照片。

7.免疫熒光染色：取石蠟組織,經(jīng)過脫蠟、水化、抗原封閉等步驟后,孵育兔抗大鼠VEGF、CD34一抗,過夜后孵育山羊抗兔熒光二抗,DAPI復(fù)染核以及封片后,在激光共聚焦纖維鏡下觀察。

結(jié) 果

1.創(chuàng)面愈合情況：在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn),紅光聯(lián)合胰島素組創(chuàng)面愈合情況優(yōu)于其他組,在第21天時(shí)創(chuàng)面已基本愈合;胰島素組與紅光組創(chuàng)面愈合情況較為接近,而對(duì)照組創(chuàng)面愈合情況較其他組差,詳見圖1。

圖1 大鼠創(chuàng)面愈合照片及創(chuàng)面愈合率統(tǒng)計(jì)圖

對(duì)各組大鼠創(chuàng)面愈合率分別進(jìn)行比較,在第7、10、14、21天,紅光聯(lián)合胰島素組創(chuàng)面愈合率在各時(shí)間點(diǎn)均高于其他組,在第7天與胰島素組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.74,P=0.091),余下時(shí)間點(diǎn)與各組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05);在第7天,紅光組創(chuàng)面愈合率29.7%±2.9%低于胰島素組33.5%±3.2%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002),但在第10、14、21天,兩組的創(chuàng)面愈合率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);對(duì)照組與紅光組及胰島素組創(chuàng)面愈合率比較,對(duì)照組創(chuàng)面愈合率始終較小,在第7、10、14、21天,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.創(chuàng)面血管新生情況：在第10、14天,紅光聯(lián)合胰島素組的創(chuàng)面HE染色切片中可見大量新生毛細(xì)血管,細(xì)胞排列緊密,膠原排列有序;紅光組及胰島素組見較多新生毛細(xì)血管,與紅光聯(lián)合胰島素組比較,新生血管和肉芽組織均較少;對(duì)照組新生毛細(xì)血管量最少,細(xì)胞數(shù)量少,膠原排列稀疏無序,成纖維細(xì)胞增殖不明顯,詳見圖2。

圖2 創(chuàng)面血管新生染色圖(HE染色,×200)

3.創(chuàng)面CD34及VEGF表達(dá)情況：在第10、14天,創(chuàng)面取材進(jìn)行CD34以及VEGF免疫熒光染色,在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察CD34及VEGF表達(dá)情況,紅光聯(lián)合胰島素組大鼠的皮膚創(chuàng)面組織內(nèi)可見大量CD34+細(xì)胞,形成管狀結(jié)構(gòu),組織內(nèi)可見大量VEGF表達(dá),數(shù)量和強(qiáng)度高;紅光組及胰島素組皮膚創(chuàng)面組織內(nèi)亦可見較多CD34+細(xì)胞,數(shù)量較紅光聯(lián)合胰島素組少,VEGF表達(dá)強(qiáng)度較紅光聯(lián)合胰島素組弱;對(duì)照組皮膚創(chuàng)面組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量較少,CD34+細(xì)胞數(shù)量少,VEGF表達(dá)弱,詳見圖3、圖4。

圖3 CD34表達(dá)情況染色圖(IF染色,×200)

圖4 VEGF表達(dá)情況染色圖(IF染色,×200)

4.創(chuàng)面Akt、p-Akt、HIF-1α表達(dá)情況：在第10天及第14天,取創(chuàng)面組織對(duì)Akt、p-Akt、HIF-1α進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察表達(dá)情況,圖中藍(lán)色為細(xì)胞核染色,棕色為觀察指標(biāo)的染色?？梢姼鹘M在第10、14天Akt均呈強(qiáng)表達(dá),肉眼觀察無明顯差異,而紅光聯(lián)合胰島素組p-Akt、HIF-1α表達(dá)量高于其他組,紅光組和胰島素組表達(dá)量相近,均高于對(duì)照組,詳見圖5～圖7。

圖5 Akt表達(dá)情況染色圖(IHC染色,×200)

圖6 p-Akt表達(dá)情況染色圖(IHC染色,×200)

圖7 HIF-1α表達(dá)情況染色圖(IHC染色,×200)

討 論

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)年發(fā)生率約2%,終生風(fēng)險(xiǎn)為15%～25%[9]。DFU的診斷和管理對(duì)提高糖尿病患者生活質(zhì)量以及降低患者病死率至關(guān)重要[10]。

LED紅光影響細(xì)胞多方面生命活動(dòng),可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、分化等,可調(diào)控炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織再生等,在臨床上可用于狼瘡、牛皮癬、關(guān)節(jié)炎等免疫相關(guān)疾病以及各種慢性創(chuàng)面等[11]。Carvalho等[12]對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠采用了660nm紅光照射,研究顯示,可改善膠原纖維沉積和調(diào)控巨噬細(xì)胞極化,有利于傷口有效愈合。Anelice等[13]研究了660nm紅光對(duì)人類糖尿病傷口的影響,顯示治療后傷口外觀顯著改善,生長(zhǎng)因子增加和炎癥標(biāo)志物減少。

胰島素在糖尿病治療中有著無可替代的作用,近年來研究證實(shí)胰島素局部外用可用于創(chuàng)面治療[14]。研究表明,皮膚傷口上局部應(yīng)用胰島素可通過PI3K/Akt/Rac1途徑增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移,加速上皮再形成,增加成纖維細(xì)胞反應(yīng)[15]。此外,局部胰島素對(duì)糖尿病傷口具有促血管生成和促血管成熟作用,可能是通過恢復(fù)PI3K/Akt和MAPK/ERK通路實(shí)現(xiàn)[16]。臨床研究證實(shí)局部外用胰島素對(duì)糖尿病創(chuàng)面具有一定療效,Zhang等[17]探討了局部胰島素注射對(duì)糖尿病足潰瘍患者全身血糖水平和傷口愈合的影響,結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,胰島素組的肉芽組織和新血管的形成顯著增加,并且兩組的空腹血糖水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

然而糖尿病患者中2型糖尿病患者占多數(shù),具有一定程度胰島素抵抗,失調(diào)的 PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)傷口愈合有顯著影響,在慢性創(chuàng)面的形成中扮演重要角色[4]。而LED紅光作用于慢性創(chuàng)面可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,預(yù)示著其可降低細(xì)胞的胰島素抵抗,其與胰島素外用聯(lián)用治療糖尿病創(chuàng)面可能起到增效作用[18]。

通過高脂飲食以及腹腔注射STZ,本課題組成功制造了糖尿病大鼠模型,隨后在大鼠背部制造了全層皮膚缺損創(chuàng)面,對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行了不同處理,結(jié)果表明,紅光聯(lián)合胰島素外用可顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合,效果優(yōu)于單用紅光或胰島素。創(chuàng)面組織免疫組化結(jié)果顯示,紅光聯(lián)合胰島素組p-Akt表達(dá)高于其他組,而紅光組及胰島素組p-Akt表達(dá)高于對(duì)照組,說明紅光可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,對(duì)胰島素起增效作用。

創(chuàng)面愈合需要充足的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì),血管化受損會(huì)導(dǎo)致新組織修復(fù)質(zhì)量不佳或慢性傷口的形成[19]。創(chuàng)面組織HE染色顯示,紅光和胰島素外用可促進(jìn)大鼠創(chuàng)面血管化,兩者聯(lián)用效果明顯增強(qiáng)。CD34在處于增殖分化狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞上呈強(qiáng)陽性表達(dá),一定程度可以代表新生血管的量[20]。創(chuàng)面組織的CD34、VEGF免疫熒光結(jié)果顯示,紅光及胰島素治療可促進(jìn)創(chuàng)面中VEGF表達(dá),促進(jìn)CD34+細(xì)胞的產(chǎn)生,其聯(lián)用可起到更優(yōu)的效果。

HIF-1二聚體可與DNA上的缺氧反應(yīng)元件位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)100多個(gè)參與缺氧適應(yīng)的基因的表達(dá)[21]。近年來,它在傷口愈合方面的作用已成為越來越多科學(xué)家的研究對(duì)象,創(chuàng)面的缺氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致HIF-1表達(dá)的上升,在分子水平上,HIF-1轉(zhuǎn)錄靶產(chǎn)物已被證明可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞存活、遷移和增殖等[22]。研究表明,HIF-1α受PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/FRAP信號(hào)通路的調(diào)節(jié),p-Akt和HIF-1α蛋白水平響應(yīng)于人間充質(zhì)干細(xì)胞中的缺氧而增加[23]。本研究中創(chuàng)面組織免疫組化結(jié)果提示紅光和胰島素可提高創(chuàng)面中HIF-1α表達(dá),進(jìn)而提高VEGF表達(dá)促進(jìn)創(chuàng)面血管化。

綜上所述,LED紅光和胰島素聯(lián)合應(yīng)用介導(dǎo)PI3K/Akt/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路可促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。