張 欣 霍浩然 秦瑞峰 胡建奇 袁增江

奧沙利鉑是胃癌化療一線用藥,但胃癌細(xì)胞獲得性耐藥所致化療敏感度降低是導(dǎo)致治療失敗的重要原因[1]。因此,尋找高效低毒的奧沙利鉑耐藥逆轉(zhuǎn)劑對改善胃癌患者預(yù)后具有重要意義。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PI3K/Akt/mTOR)是調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬的關(guān)鍵信號通路,抑制PI3K/Akt/mTOR通路能夠逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥、乳腺癌他莫昔芬耐藥、結(jié)腸癌氟尿嘧啶耐藥[2～4]。紫草素是紫草的主要活性成分,有研究發(fā)現(xiàn)紫草素通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等凋亡和自噬[5,6]。但紫草素能否通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥尚鮮見報(bào)道,本研究以人胃癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞(MGC803/L-OHP)做為受試細(xì)胞,探討紫草素對人胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1.材料：(1)細(xì)胞：MGC803/L-OHP細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)。(2)藥物與試劑：紫草素(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所;奧沙利鉑購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;IGF-1(PI3K激活劑)購自美國Cell Signaling公司;CCK-8試劑盒、BCA 法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Sigma公司;GFP-LC3質(zhì)粒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自南京謹(jǐn)庭生物有限公司;Annexin V-FITC/PI試劑盒購自美國Invitrogen公司;p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、caspase-3、cleaved caspase-3抗體購自美國Cell Signaling公司;LC3、Beclin1、β-actin抗體購自英國Abcam公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：MGC803/L-OHP細(xì)胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后,接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2、飽和濕度)中培養(yǎng),隔天換液1次,細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)按1∶4傳代培養(yǎng)。

3.CCK-8法檢測不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率及半抑制濃度(IC50)：取對數(shù)生長期MGC803/L-OHP細(xì)胞,0.25%胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液,1×104個(gè)/孔接種于96孔板,設(shè)0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L紫草素組,各10個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24h后,各組分別更換含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,20微升/孔加入CCK-8試劑,避光孵育4h,通過酶標(biāo)儀檢測450nm處吸光度值(A),增殖抑制率(%)=(A空白對照組-A藥物組)/A空白對照組×100%,計(jì)算IC50,重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。計(jì)算IC50為9.58μmol/L,后續(xù)實(shí)驗(yàn)紫草素濃度設(shè)定為10μmol/L。

4.分組與給藥：取對數(shù)生長期MGC803/L-OHP細(xì)胞,1×104個(gè)/孔接種于96孔板和1×105個(gè)/孔接種于6孔板,設(shè)空白對照組、奧沙利鉑(25μmol/L)組、紫草素+奧沙利鉑(10μmol/L+25μmol/L)組、紫草素+奧沙利鉑+IGF-1(10μmol/L+25μmol/L+10μmol/L)組[7,8]。培養(yǎng)24h后,各組分別更換含藥培養(yǎng)基(空白對照組更換無藥培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)24h。

5.CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率：每組隨機(jī)取10孔(96孔板)藥物干預(yù)24h后的MGC803/L-OHP細(xì)胞,通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：每組隨機(jī)取10孔(6孔板)藥物干預(yù)24h后的MGC803/L-OHP細(xì)胞,不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞,按照試劑盒操作說明,5微升/孔加入Annexin V-FITC染液、5微升/孔加入PI染液混勻后,避光孵育15min,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡狀況。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。

7.GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后觀察自噬小體：取GFP-LC3質(zhì)粒4μg加入RPMI1640培養(yǎng)基250μl,取Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑10μl加入RPMI1640培養(yǎng)基250μl,然后將二者加在一起輕輕混勻。每組隨機(jī)取10孔(6孔板)藥物干預(yù)24h后的MGC803/L-OHP細(xì)胞,2毫升/孔更換新培養(yǎng)基,500微升/孔逐滴加入GFP-LC3質(zhì)粒/Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑混合液,輕輕混勻,避光培養(yǎng)5h,更換常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后,通過熒光顯微鏡觀察自噬小體形成狀況(綠色熒光點(diǎn)即為自噬小體)。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

8.Western blot法檢測蛋白表達(dá)：每組隨機(jī)取10孔(6孔板)藥物干預(yù)24h后的MGC803/L-OHP細(xì)胞,消化后收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液冰上靜置30min,4℃、12000r/min離心20min取上清,BCA法檢測蛋白濃度,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)PVDF膜、5%封閉液室溫封閉1h后,滴加稀釋后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、caspase-3、cleaved caspase-3、LC3、Beclin1、β-actin一體4℃孵育過夜,洗膜后滴加二抗室溫孵育1.5h,ECL顯影,以目標(biāo)蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值做為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值。

結(jié) 果

1.不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率及IC50：紫草素0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0μmol/L組細(xì)胞增殖抑制率分別為0、20.43%±2.37%、37.61%±4.08%、52.49%±6.17%、62.84%±7.36%、70.29%±7.55%。紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率呈劑量依賴性(P<0.05),IC50為9.58μmol/L,后續(xù)實(shí)驗(yàn)紫草素濃度設(shè)定為10μmol/L(圖1)。

圖1 不同濃度紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率

2.紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖和凋亡的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05,圖2、表1)。

表1 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率的影響

圖2 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞凋亡的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

3.紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞自噬的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組自噬小體數(shù)量增多;與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組自噬小體數(shù)量明顯增多;與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組自噬小體數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖3 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞自噬的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

4.紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量下調(diào)(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量下調(diào)(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)量上調(diào)(P<0.05,圖4、表2)。

表2 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

圖4 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

5.紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組caspase-3、cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào),cleaved caspase-3/caspase-3比值升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組caspase-3、cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào),cleaved caspase-3/caspase-3比值升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組caspase-3、cleaved caspase-3表達(dá)下調(diào),cleaved caspase-3/caspase-3比值降低(P<0.05,圖5、表3)。

表3 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)及cleaved caspase-3/caspase-3比值的影響

圖5 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

6.紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞LC3、Beclin1蛋白表達(dá)的影響：與空白對照組比較,奧沙利鉑組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)上調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);與奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)上調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高(P<0.05);與紫草素+奧沙利鉑組比較,紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)下調(diào),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P<0.05,圖6、表4)。

表4 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞LC3、Beclin1蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值的影響

圖6 紫草素對MGC803/L-OHP細(xì)胞LC3、Beclin1蛋白表達(dá)的影響A.空白對照組;B.奧沙利鉑組;C.紫草素+奧沙利鉑組;D.紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組

討 論

紫草素是中藥紫草的主要活性成分,具有抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理學(xué)作用[9,10]。近年來,紫草素抗腫瘤活性被發(fā)現(xiàn)并深入挖掘,已證實(shí)紫草素能夠逆轉(zhuǎn)人肺腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn),紫草素對MGC803/L- OHP細(xì)胞具有劑量依賴性的增殖抑制作用;與奧沙利鉑單藥干預(yù)比較,紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合能夠顯著提高M(jìn)GC803/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率,而紫草素+奧沙利鉑+IGF-1組細(xì)胞增殖抑制率明顯低于紫草素+奧沙利鉑組。提示紫草素可逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥,而該作用能夠被PI3K激活劑IGF-1明顯逆轉(zhuǎn)。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與自噬是鉑類藥物抗腫瘤的主要機(jī)制。caspase-3可被細(xì)胞色素C等誘導(dǎo)活化,cleaved caspase-3能夠切割細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白、核蛋白并破壞核酸、DNA等結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。LC3是細(xì)胞自噬過程發(fā)生的標(biāo)志性蛋白,具有兩種亞型(無活性LC3-Ⅰ,具有促細(xì)胞自噬活性的LC3-Ⅱ),生理狀態(tài)下LC3主要以LC3-Ⅰ亞型存在,自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ被剪切活化生成LC3-Ⅱ,所以LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值能夠反映LC3蛋白活化程度及細(xì)胞自噬水平。Akt為PI3K下游靶基因,是細(xì)胞凋亡和自噬過程重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。PI3K活化形式p-PI3K能夠誘導(dǎo)Akt磷酸化,p-Akt則能夠誘導(dǎo)cleaved caspase-3磷酸化而失去促凋亡活性[14]。

p-Akt能夠誘導(dǎo)mTOR磷酸化,p-mTOR則能夠加速細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、能夠抑制泛素蛋白表達(dá)而抑制細(xì)胞自噬[15]。Beclin1是LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,轉(zhuǎn)移LC3-Ⅱ到自噬體膜發(fā)揮促細(xì)胞自噬作用,而p-mTOR能夠誘導(dǎo)Beclin1磷酸化失活而間接抑制細(xì)胞自噬[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與奧沙利鉑單藥干預(yù)比較,紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合能夠明顯提高M(jìn)GC803/L-OHP細(xì)胞凋亡率和自噬小體數(shù)量,下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá),上調(diào)cleaved caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá),提高cleaved caspase-3/caspase-3、LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值;PI3K激活劑IGF1能夠明顯逆轉(zhuǎn)上述紫草素+奧沙利鉑聯(lián)合干預(yù)作用。提示促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬可能是紫草素逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥的重要機(jī)制,可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路而上調(diào)凋亡和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,紫草素可逆轉(zhuǎn)人胃癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥,其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)。本研究結(jié)果為紫草素做為胃癌化療輔助用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。