曹巍巍 劉晨萍 袁晨越 薛永鵬

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是各類心血管疾病遷延不愈發(fā)展到后期的轉(zhuǎn)歸。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,中國(guó)心血管疾病患病率處于持續(xù)上升狀態(tài),心血管病病死率仍居首位,目前患病人數(shù)為3.30億,其中心力衰竭890萬(wàn),2012～2015年≥35周歲的成年人中,心力衰竭的患病率為1.3%,較2000年增加了44.0%[1,2]。具有溫陽(yáng)利水功效的強(qiáng)心方是經(jīng)臨床驗(yàn)證治療CHF的有效方劑,但其改善CHF癥狀的具體機(jī)制尚未明確[3]。本研究擬通過(guò)腹腔注射阿霉素(doxorubicin,Dox)建立CHF模型,以正常及高劑量的強(qiáng)心方進(jìn)行干預(yù),觀察強(qiáng)心方對(duì)小鼠心功能的影響,為闡明強(qiáng)心方對(duì)CHF的保護(hù)及治療機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[4～6]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)5～6周齡C57小鼠,雄性,42只,體質(zhì)量為20±2g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(滬)2014-0008。飼養(yǎng)于上海市中醫(yī)醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,自由攝食飲水。所有實(shí)驗(yàn)均按照上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)和國(guó)際動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

2.主要試劑與儀器：ELISA試劑盒(貨號(hào)ml102853)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;OCT包埋劑(貨號(hào)4583)購(gòu)自美國(guó)SAKURA公司;Masson 三色染色液(貨號(hào)BP-DL022)購(gòu)自森貝伽生物技術(shù)有限公司;RNA提取液(貨號(hào)G3013)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;三氯甲烷(貨號(hào)10006818)、異丙醇(貨號(hào)80109218)、無(wú)水乙醇(貨號(hào)10009218)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HyPure TMMolecular Biology Grade Water(貨號(hào)SH30538.02)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(貨號(hào)#K1622)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(貨號(hào)04 913 914 001)購(gòu)自瑞士Roche公司;引物(NM_008084.2;NM_008725.3;NM_001361607.1)購(gòu)自武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司;酶標(biāo)儀(352)購(gòu)自芬蘭Labsystems Multiskan MS公司;洗板機(jī)(AC8)購(gòu)自芬蘭Thermo Labsystems公司;臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(D3024R)購(gòu)自美國(guó)DragonLab公司;熒光定量PCR儀(7300)購(gòu)自美國(guó)ABI公司;超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;冷凍切片機(jī)(HM525)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;倒置熒光顯微鏡(IX51)購(gòu)自日本Olympus公司。

3.模型建立及實(shí)驗(yàn)分組：正常組(n=6)、模型組(n=8)、強(qiáng)心方低劑量組(n=12)、強(qiáng)心方高劑量組(n=11)。參考文獻(xiàn)[7,8]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn),將48只SPF級(jí)5～6周齡,體質(zhì)量為20～25g,雄性C57小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)選取6只小鼠為正常組,將余下42只小鼠采用腹腔注射阿霉素0.005mg/g,每隔3天間隔注射,共計(jì)30天?？傆?jì)腹腔注射阿霉素0.05mg/g,制作小鼠CHF模型(造模過(guò)程中死亡11只,造模成功31只),正常組小鼠腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。將造模成功的31只小鼠隨機(jī)分為模型組(n=8),強(qiáng)心方低劑量組(n=12),強(qiáng)心方高劑量組(n=11)。強(qiáng)心方低劑量組給于中藥強(qiáng)心方低劑量(正常劑量)每日灌胃,強(qiáng)心方高劑量組給于中藥強(qiáng)心方高劑量(2倍正常劑量)每日灌胃,模型組及正常組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃,每天灌胃1次,共計(jì)30天后取材。

4.中藥強(qiáng)心方藥物組：附子15g、茯苓15g、補(bǔ)骨脂15g、車前子15g、川芎15g、黃芪30g、黨參15g、桂枝9g、鹿角片15g、女貞子15g、肉桂6g、葶藶子30g、桃仁15g、太子參15g、豬苓15g(飲片購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司),普通水煎1小時(shí),桃仁、肉桂后下,得到濃度為含生藥量2.7g/ml的水煎液。實(shí)驗(yàn)時(shí)加蒸餾水分別配置成含生藥量1.25g/ml和2.5g/ml的藥液。

5.參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]計(jì)算小鼠給藥劑量：按給藥30天,共31只小鼠,每只給藥0.2ml,計(jì)算所需藥量：0.2ml×31只×30天=186ml。強(qiáng)心方低劑量、高劑量組分別按照正常濃度1.25g/ml,2倍濃煎2.5g/ml的梯度設(shè)置,正常組、模型組同等體積0.9%氯化鈉注射液,每天灌胃1次,共30天。

6.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)及取材：使用設(shè)備品牌型號(hào)為百勝M(fèi)yLab 8 eXP。灌胃30天結(jié)束后,采用異氟烷麻醉小鼠,通過(guò)高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)M模式測(cè)定5個(gè)心動(dòng)周期左心室舒張期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter,LVIDd)、左心室收縮期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume,LVESV),計(jì)算短軸縮短率(FS%)及射血分?jǐn)?shù)(EF%)。FS%=(LVIDd-LVIDs)/LVIDd;EF%=(LVEDV-LVESV)/LVEDV。檢測(cè)完成后于麻醉下眼眶取血并處死小鼠,取心臟稱重,并使用脛骨長(zhǎng)度矯正相對(duì)值。沿心臟橫軸切取一半心臟-80℃冷凍用于RNA檢測(cè),另一半用于Masson檢測(cè)。

7.ELISA：檢測(cè)儀器為酶標(biāo)分析儀Rayto RT-6100。將各組小鼠眼眶取血,并于4℃、5000×g離心5～10min,取上清。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行ELISA檢測(cè),在450nm的波長(zhǎng)下測(cè)定A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本中BNP含量。

8.Masson三色染色：取各組冰凍切片,用PBS稍洗。將Bouin液滴加在組織上,放于37℃烘箱2h,進(jìn)行媒染,然后流水沖洗切片至黃色消失。滴加100μl天青石藍(lán)染色液,染色2～3min。稍水洗,滴加Mayer蘇木精染色液,染色2～3min。稍水洗,酸性乙醇分化液處理1～2min。流水沖洗10min,滴加麗春紅品紅染色液,染色10min。蒸餾水稍沖洗,磷鉬酸溶液處理約10min。傾去上液,直接滴加苯胺藍(lán)染色劑襯染5min。蒸餾水稍沖洗,脫水和透明后中性樹脂封片。

9.RT-qPCR：采用Trizol法提取小鼠心肌組織總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,配置如下反應(yīng)體系：2×qPCR Mix 12.5μl,7.5μm基因引物 2.0μl,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.5μl,ddH2O 8.0μl,PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min,95℃變性15s、60℃退火20s、75℃延伸20s共40個(gè)循環(huán),75℃延伸5min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì)Ct值采用2-ΔΔCt法進(jìn)行定量分析。引物序列：Anp上游引物：5′-TGCCCTCTTGAAAAGCAAACTG- 3′,下游引物5′-CTGGGCTCCAATCCTGTCAAT- 3′。β-MHC上游引物：5′-ATCAAATCATCCAAGCCAACCC- 3′,下游引物5′-GCATAATCGTAGGGGTTGTTGGT- 3′。Gapdh上游引物5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG- 3′,下游引物5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT- 3′。以Gapdh為內(nèi)參,計(jì)算Anp,β-MHC mRNA表達(dá)量。

結(jié) 果

1.小鼠生存情況：CHF發(fā)生后,正常組小鼠行動(dòng)敏捷、反應(yīng)迅速、毛發(fā)有光澤、體質(zhì)量持續(xù)穩(wěn)定上升,30天灌胃過(guò)程中未出現(xiàn)死亡;模型組小鼠反應(yīng)遲緩、毛發(fā)稀疏無(wú)光澤、飲食飲水量減少、體質(zhì)量消瘦,30天灌胃過(guò)程中出現(xiàn)較多死亡;經(jīng)強(qiáng)心方干預(yù)治療后,相較于模型組,強(qiáng)心方低劑量及高劑量組小鼠行動(dòng)相對(duì)自如、毛發(fā)恢復(fù)部分光澤,30天灌胃過(guò)程中僅出現(xiàn)較少死亡,詳見表1。

表1 各組小鼠治療期間死亡情況

2.超聲心動(dòng)圖心功能水平：CHF發(fā)生后,相較于正常組,模型組小鼠心功能水平明顯下降,超聲心圖提示模型組小鼠左心室舒張期、收縮期內(nèi)徑均顯著上升,短軸縮短率及射血分?jǐn)?shù)顯著下降。強(qiáng)心方干預(yù)治療后,相較于模型組,強(qiáng)心方低劑量及高劑量組小鼠心功能明顯改善,左心室舒張期、收縮期內(nèi)徑明顯下降,短軸縮短率及射血分?jǐn)?shù)明顯上升,詳見圖1、表2。

圖1 超聲心動(dòng)圖A.正常組;B.模型組;C.強(qiáng)心方低劑量組;D.強(qiáng)心方高劑量組

表2 超聲心動(dòng)圖M模式評(píng)價(jià)各組小鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能

3.心力衰竭指標(biāo)BNP水平：ELISA檢測(cè)小鼠血清發(fā)現(xiàn),相較于正常組,模型組小鼠血清BNP指標(biāo)顯著升高。經(jīng)強(qiáng)心方干預(yù)治療后,強(qiáng)心方低劑量及高劑量組小鼠血清BNP指標(biāo)明顯下降,詳見表3。

表3 各組小鼠血清BNP指標(biāo)比較

4.Masson三色染色心肌纖維化程度：心肌組織切片按Masson三色染色試劑盒步驟操作,使用Imagine-ProPlus軟件鏡下觀察拍照,并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。顯微鏡下,心肌組織為紅色,膠原纖維為藍(lán)色。CVF(%)=膠原纖維染色面積/切片總面積×100%。Masson三色染色顯示,模型組小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯纖維化,與正常組比較,模型組可見藍(lán)色染色的膠原纖維增多。與模型組比較,強(qiáng)心方低劑量及高劑量組膠原纖維面積明顯減少,心肌細(xì)胞纖維化程度減輕,詳見圖2、表4。

圖2 各組小鼠心肌組織病理圖(Masson三色染色,×40)A.正常組;B.模型組;C.強(qiáng)心方低劑量組;D.強(qiáng)心方高劑量組

表4 各組小鼠心肌纖維化率

5.心肌組織Anp、β-MHC表達(dá)：RT-qPCR檢測(cè)心肌組織Anp、β-MHC mRNA表達(dá)情況顯示,相較于正常組,模型組Anp、β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上升。相較于模型組強(qiáng)心方低劑量及高劑量組Anp、β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降,詳見表5。

表5 RT-qPCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織Anp和β-MHC mRNA表達(dá)情況

討 論

CHF可歸屬于中醫(yī)“心悸”、“胸痹”、“心水”、“水腫”等病證的范疇,作為多種慢性心系疾病反復(fù)發(fā)展、遷延不愈的最終歸屬,臨床CHF患者多已氣虛及陽(yáng)。心陽(yáng)虛衰,心失所養(yǎng),故心血不運(yùn),血脈瘀阻,隨著病情的不斷發(fā)展逐漸出現(xiàn)瘀久成積、瘀血化水,其病機(jī)可概括為虛、瘀、水,病理基礎(chǔ)為心陽(yáng)虧虛,血瘀為中心病理環(huán)節(jié),痰濁、水飲主要病理產(chǎn)物[10]。本研究采用的強(qiáng)心方由真武湯及五苓散化裁而來(lái),方中使用大劑量附子為君藥,配合肉桂、補(bǔ)骨脂、鹿角片等溫陽(yáng)藥物,附子辛熱燥烈,走而不守,為通行十二經(jīng)的純陽(yáng)之品,峻補(bǔ)元陽(yáng)[11～15]。肉桂能走能守,偏溫下焦而溫腎陽(yáng),使相火歸原以攝無(wú)根之火;補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎助陽(yáng)、溫補(bǔ)脾腎;鹿角片血肉有情之品大補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、強(qiáng)筋骨。此外,方中兼顧黃芪、黨參、太子參補(bǔ)益脾肺之氣;女貞子滋補(bǔ)肝腎之陰;茯苓、豬苓、車前子利水;桃仁、川芎活血化瘀。全方重在溫補(bǔ)心腎之陽(yáng),腎陽(yáng)充盛則可上濟(jì)于心,心陽(yáng)充足也可下歸于腎,溫煦全身陽(yáng)氣,氣血得以鼓舞,氣行則血行,血脈得以溫通,血脈通則瘀血乃化,起到溫陽(yáng)益氣、活血利水之功效。

阿霉素的心臟毒性源于其誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并促進(jìn)自由基的產(chǎn)生,當(dāng)活性氧簇的產(chǎn)生速度大于抗氧化防御系統(tǒng)的清除速度時(shí),會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、壞死和自噬,被廣泛應(yīng)用于HF動(dòng)物模型的建立。經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)研究,最后選擇了死亡率較低的小劑量、低濃度、多次給藥的方法。采用腹腔注射阿霉素0.005mg/g,每隔3天間隔注射,共計(jì)30天,該建模方法模擬了小鼠的慢性心力衰竭。

目前已基本明確心室重構(gòu)(ventricular remodeling,VR)是CHF發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制,初期CHF心肌損傷后,代償機(jī)制被激活,心臟通過(guò)心室結(jié)構(gòu)及大小的變化適應(yīng)損傷,然而心功能持續(xù)惡化,心室形態(tài)不斷增大,逐步導(dǎo)致二尖瓣關(guān)閉不全,引發(fā)血液部分回流,無(wú)法滿足機(jī)體所需的供應(yīng),導(dǎo)致CHF一系列癥狀[16]?，F(xiàn)階段VR治療效果并不理想,多數(shù)治療僅能延緩VR的進(jìn)展[17]。隨著中醫(yī)藥治療CHF研究的深入,逐步發(fā)現(xiàn)中藥治療VR具有多靶點(diǎn)、多途徑的綜合干預(yù)的優(yōu)勢(shì)[18]。本實(shí)驗(yàn)表明強(qiáng)心方能夠明顯降低CHF小鼠LVIDd、LVIDs,提高FS%和EF%水平,表明強(qiáng)心方對(duì)CHF小鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能具有一定改善作用。

心肌細(xì)胞作為終末分化的成熟細(xì)胞,目前認(rèn)為已不具有增殖功能。當(dāng)心臟損傷出現(xiàn)時(shí),其多通過(guò)引起心肌細(xì)胞肥大進(jìn)行代償應(yīng)對(duì)損傷壓力,然而隨著損傷的不斷加重,心肌細(xì)胞肥大終將走向失代償加重CHF的發(fā)生、發(fā)展[19]。Anp和β-MHC作為心肌肥厚標(biāo)志物,本實(shí)驗(yàn)表明,相較于CHF模型組,強(qiáng)心方低劑量及高劑量組Anp、β-MHC mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降,提示強(qiáng)心方能夠在一定程度上抑制心肌肥大。

心肌纖維化作為一種瘢痕形成過(guò)程是心肌重要的病理特征之一,當(dāng)損傷發(fā)生時(shí),心臟成纖維細(xì)胞大量積累并伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過(guò)量沉積,引起心肌硬化、心臟收縮舒張功能障礙,引起CHF不斷惡化,同時(shí)過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)還將增加心律不齊的風(fēng)險(xiǎn)[20]。Masson三色染色顯示,與CHF模型組比較,強(qiáng)心方治療后心肌組織膠原纖維面積明顯減少,表明強(qiáng)心方能夠有效改善心肌細(xì)胞纖維化程度。

綜上所述,中藥強(qiáng)心方可以一定程度上改善小鼠心功能水平,增加射血分?jǐn)?shù),降低血清BNP水平,調(diào)控Anp、β-MHC等心肌肥厚相關(guān)基因、減輕心肌纖維化等多途徑延緩VR進(jìn)程,對(duì)治療CHF具有一定的療效。