化春曉 薛淑文 郭依琳 楊宇霞 孔祥東

遺傳病是指由遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能改變所引起的疾病。目前臨床上遺傳病主要通過替代療法、飲食藥物干預(yù)、手術(shù)矯正、器官移植等方法減輕患者癥狀,但并未從根本上解決問題,因此大部分嚴(yán)重遺傳性疾病的最終有害結(jié)局不能改變?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn)為遺傳病的治療帶來了希望。近年來,成簇規(guī)律的間隔短回文重復(fù)相關(guān)蛋白[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated proteins,CRISPR/Cas]基因編輯技術(shù)發(fā)展非常迅速,目前已應(yīng)用于多種人類疾病治療的臨床試驗(yàn)中,如HIV、遺傳病及腫瘤的治療等[1]。

CRISPR/Cas系統(tǒng)根據(jù)Cas蛋白的不同可分為3種類型,其中Ⅰ型和Ⅲ型依靠多個效應(yīng)蛋白共同發(fā)揮作用,Ⅱ型僅需單一效應(yīng)蛋白。其中Cas9蛋白與CRISPR組成的CRISPR/Cas9 Ⅱ型基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛[2]。Cas9蛋白具有多種同源物,其中最常用的是來自化膿性鏈球菌的Cas9 (streptococcus pyogenes Cas9,SpCas9) 和來自金葡球菌的Cas9 (staphylococcus aureus Cas9,SaCas9)。由于SaCas9蛋白的體積較小,可以克服腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體插入大小的限制,更易包裝成AAV載體,故SaCas9蛋白主要用于體內(nèi)基因編輯[3]。然而,與所有的新技術(shù)一樣,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)也面臨著巨大挑戰(zhàn)。臨床應(yīng)用面臨的主要問題包括基因編輯的特異性和準(zhǔn)確性、CRISPR/Cas9系統(tǒng)的免疫原性和基因編輯的長期有效性等。

既往研究發(fā)現(xiàn),在正常成人體內(nèi)預(yù)先存在對Cas9蛋白的體液免疫反應(yīng),因此CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在成人體內(nèi)應(yīng)用可能會產(chǎn)生免疫反應(yīng),從而影響基因治療的效果[4,5]。但關(guān)于胎兒體內(nèi)SaCas9蛋白抗體的研究情況較少,本研究通過檢測孕婦血清、羊水、胎兒臍帶血樣本中是否存在SaCas9蛋白抗體,觀察成人及胎兒體內(nèi)針對SaCas9蛋白的特異性體液免疫情況,從而研究更為合適的遺傳病治療方法。

對象與方法

1.研究對象：本研究為回顧性研究,隨機(jī)選取2020年11月1日～12月20日于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心就診的75例孕婦的產(chǎn)前篩查或診斷樣本,其中孕婦血清42例,羊水23例,胎兒臍帶血10例。所有孕婦均為健康個體且產(chǎn)前篩查或診斷結(jié)果正常,采血前未使用過血液制品、皮質(zhì)激素和免疫制劑等,也無急慢性感染或腫瘤等疾患。所有孕婦均簽署知情同意書,本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核通過(倫理學(xué)審批號：KS-2018-KY-36)。

2.樣本收集與處理：取孕婦外周血和胎兒臍帶血各2ml,EDTA(美國Thermo Fisher公司)抗凝;孕婦行羊水穿刺術(shù)后抽取羊水2ml。所有樣本均離心后取上清用于檢測。

3.ELISA法檢測抗體：人黃色葡萄球菌的Cas9蛋白抗體試劑盒購自上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司,檢測步驟按照說明書進(jìn)行具體操作：設(shè)置樣本孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔,分別加入50μl待測樣本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,空白孔不加;除空白孔外,各微孔中加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μl;于37℃恒溫箱中進(jìn)行溫育60min后;向微孔中加入350μl洗滌液,充分洗滌5次;然后向微孔中加入底物A、B各50μl,再溫育15min后,向微孔中加入50μl終止液,于15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的吸光度(A)值,使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中的SaCas9蛋白抗體濃度。

4.評價指標(biāo)：陽性：SaCas9蛋白抗體≥1ng/ml;陰性：SaCas9蛋白抗體<1ng/ml。本實(shí)驗(yàn)檢測樣本A值與空白對照A值進(jìn)行對比,低于空白對照A值的樣本認(rèn)為是陰性,抗體濃度為0ng/ml。

結(jié) 果

1.樣本中的SaCas9蛋白抗體檢測結(jié)果：75例孕婦年齡為18～44歲,平均年齡為26.74±4.98歲,孕周16～28周,平均孕周為19.31±3.81周。42例血清中均檢測出SaCas9蛋白抗體,血清抗體陽性率為100%。23例羊水及10例臍血樣本中均未檢測出SaCas9蛋白抗體,抗體陽性率均為0。樣本的檢測結(jié)果如表1。

表1 75例孕婦樣本中的SaCas9蛋白抗體檢測結(jié)果

2.42例血清樣本中的SaCas9蛋白抗體水平與年齡的關(guān)系：42例孕婦年齡為18～36歲,平均年齡為26.57±5.63歲。將孕婦根據(jù)年齡分為6組,分析血清抗體濃度與孕婦年齡的關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,血清抗體水平與孕婦年齡無相關(guān)性(P>0.05),詳見圖1。

圖1 42例血清樣本中的SaCas9蛋白抗體檢測結(jié)果

討 論

基因編輯技術(shù)近年來蓬勃發(fā)展,相繼出現(xiàn)了鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)、CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)、單堿基編輯器(base editing,BE)和先導(dǎo)編輯器(prime editing,PE) 等基因編輯技術(shù),其中CRISPR/Cas系統(tǒng)因其應(yīng)用難度小,準(zhǔn)確性高和構(gòu)建時間較短等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域中,因此也是研究最為深入的基因編輯方法[6]。CRISPR/Cas系統(tǒng)存在于約50%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌基因組中,是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng),用來保護(hù)細(xì)菌免受外源遺傳物質(zhì)的入侵。目前最常用的Cas9蛋白同源物之一是SaCas9蛋白[3]。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然環(huán)境中,大約有40%的人口存在金黃色葡萄球菌感染,人體預(yù)先暴露于該菌中可能會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,從而產(chǎn)生針對Cas9蛋白的抗體。

在CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因治療過程中,AAV載體攜帶Cas9蛋白進(jìn)入機(jī)體并介導(dǎo)Cas9蛋白在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)。若患者體內(nèi)預(yù)先存在針對Cas9蛋白的抗體,體內(nèi)免疫系統(tǒng)將會識別并清除Cas9蛋白,影響治療效果,甚至有可能引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng),導(dǎo)致器官衰竭,CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的安全性和有效性難以得到保證。在先前的基因治療試驗(yàn)中,體內(nèi)對Cas9蛋白抗體具有適應(yīng)性免疫的患者由于抗體的中和作用,基因治療沒有產(chǎn)生相應(yīng)的效果。Charlesworth等[4]通過ELISA法檢測健康成人體內(nèi)Cas9蛋白抗體的存在情況,結(jié)果在78%的樣本中檢測到針對SaCas9蛋白的抗體。在此之前,Simhadri 等[5]使用ELISA檢測法對200份美國人的血清樣本進(jìn)行篩查,發(fā)現(xiàn)SaCas9蛋白抗體的存在率為10%。全球罕見病患者約3.6億人,其中我國罕見病患者超2000萬,且每年新增人數(shù)超過20萬。我國罕見病患者數(shù)量龐大,因此中國人群中Cas9蛋白的適應(yīng)性免疫情況更值得關(guān)注。本研究通過收集成人外周血、羊水、胎兒臍帶血樣本,經(jīng)ELISA法檢測樣本中是否存在針對SaCas9蛋白的抗體。為進(jìn)一步評價CRISPR/Cas9系統(tǒng)臨床應(yīng)用的安全性和治療策略提供依據(jù),并為遺傳病的治療提供新方案。

SaCas9蛋白抗體在成人體內(nèi)廣泛存在,而在羊水和臍血中均未檢出,證明胎兒體內(nèi)可能不存在針對CRISPR/SaCas9系統(tǒng)的特異性體液免疫,因此對胎兒進(jìn)行宮內(nèi)基因治療可能避免因產(chǎn)生針對SaCas9蛋白的體液免疫反應(yīng)而造成的不良后果。

此外對胎兒進(jìn)行宮內(nèi)基因治療還具有以下幾個方面的優(yōu)點(diǎn)：(1)與幼兒或成人比較,胎兒個體較小,可最大限度地提高每公斤體重內(nèi)的載體效價,從而可有效促進(jìn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo),且較小的個體可避免需要大規(guī)模構(gòu)建體所造成的時間與經(jīng)濟(jì)限制[7]。(2)妊娠早期的胎兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟,此時胎兒不會對外源抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng),并誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受[8]。若在此時對胎兒進(jìn)行基因治療,則可避免機(jī)體產(chǎn)生針對載體系統(tǒng)或基因編輯產(chǎn)物的免疫反應(yīng),從而避免對正常組織產(chǎn)生損傷,且無需使用免疫抑制藥物作預(yù)處理。(3)胎兒體內(nèi)具有豐富的干細(xì)胞群體,因其在發(fā)育過程中具有很高的增殖能力成為基因治療的理想靶點(diǎn),可對載體進(jìn)行長期有效的轉(zhuǎn)導(dǎo),且減少了再次給藥的必要性[9]。而在成人體內(nèi)絕大多數(shù)干細(xì)胞都處于靜止?fàn)顟B(tài),這大大降低了基因治療的效率和持續(xù)時間。(4)胎兒的獨(dú)特解剖結(jié)構(gòu)可有助于通過各種給藥途徑將基因治療載體輸送到特定組織,如在妊娠早期對胎兒直接進(jìn)行心內(nèi)注射、在妊娠中晚期通過超聲引導(dǎo)下的臍靜脈穿刺術(shù)或直接向羊水中進(jìn)行注射從而將載體輸注到特定的組織[10]。(5)血-腦脊液屏障的功能隨著年齡增長而逐漸完善,胎兒血-腦脊液屏障的高通透性使宮內(nèi)基因治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為可能,且可防止大腦發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的病理變化。

Chan等[11]在超聲引導(dǎo)下對患有B型血友病的食蟹猴胎兒進(jìn)行基因編輯病毒載體的心內(nèi)注射,出生后的食蟹猴體內(nèi)表達(dá)的凝血因子Ⅸ可達(dá)到治療水平,體內(nèi)沒有產(chǎn)生特異的免疫反應(yīng),并且在其出生后的4年內(nèi)也沒有因載體的存在或基因編輯產(chǎn)物的表達(dá)而產(chǎn)生不良影響。Massaro等[12]利用帶有表達(dá)重組神經(jīng)元葡糖腦苷脂酶的AAV9病毒載體對患有戈謝病的胎兒小鼠進(jìn)行治療,出生后小鼠的致死性神經(jīng)退行性變被逆轉(zhuǎn),小鼠的壽命顯著延長。且有研究人員利用經(jīng)腹胚胎胎兒鏡觀察人類早期胚胎,認(rèn)為鏡下經(jīng)胎兒臍靜脈穿刺可作為未來宮內(nèi)基因治療載體注射的可靠途徑[13]。這些都為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用于宮內(nèi)基因治療提供了可能。

保證宮內(nèi)基因治療的安全,除了要考慮免疫因素外,還需考慮以下幾個主要的因素,首先基因治療的病毒載體必須以不干擾母親和胎兒的方式進(jìn)入胎兒循環(huán),此外還應(yīng)最大限度地轉(zhuǎn)移到胎兒并最大限度地避免轉(zhuǎn)移到母親。其次,基因治療載體一旦進(jìn)入胎兒循環(huán),必須使其轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶組織。但由于發(fā)育中的胚胎組織在生理上非常接近,并且胎兒細(xì)胞對所處環(huán)境的變化非常敏感,多項(xiàng)研究結(jié)果證明,載體除轉(zhuǎn)導(dǎo)特定的細(xì)胞群外,也在其他組織中廣泛轉(zhuǎn)導(dǎo),盡管水平較低[14,15]。有研究表明,在胎兒非靶標(biāo)組織中表達(dá)基因編輯產(chǎn)物可能會產(chǎn)生致癌作用等嚴(yán)重問題[16]。所以,為避免對其他組織的意外破壞,應(yīng)嚴(yán)格控制基因治療載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)。再次要考慮胎兒對基因治療載體的清除作用,一項(xiàng)關(guān)于妊娠晚期胎兒對嗎啡攝取的研究表明,胎兒對該物質(zhì)的代謝清除率隨時間的延長而逐漸升高[17]。如果這一結(jié)果適用于基因治療載體,那么胎兒體內(nèi)的清除機(jī)制可能會降低細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的可能性并增加基因治療所需的載體劑量。因此在進(jìn)行治療之前應(yīng)進(jìn)行基因治療載體在宮內(nèi)的藥代動力學(xué)研究。最后在載體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核后,載體基因組必須在胎兒細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在,以實(shí)現(xiàn)基因治療的效果。根據(jù)載體的選擇,基因編輯產(chǎn)物可以作為一種外源DNA分子附加體存在,但隨著細(xì)胞的分裂基因編輯產(chǎn)物可能逐漸消失,也可以整合到宿主染色體中并在子細(xì)胞中持續(xù)存在。

基因療法一般使用游離型載體,如果將其遞送到相對靜止的組織中,基因編輯產(chǎn)物可以長期存在[18]。然而,鑒于胎兒細(xì)胞的高度增殖性,基因編輯產(chǎn)物可能因細(xì)胞的快速更新而丟失。雖然插入型載體可使基因編輯產(chǎn)物在靶組織內(nèi)持續(xù)表達(dá),但其有可能通過插入誘變激活或破壞附近的基因而產(chǎn)生不可預(yù)料的風(fēng)險[19]。因此,必須優(yōu)化用于宮內(nèi)基因治療的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體,最大限度地提高基因編輯產(chǎn)物表達(dá)的持久性并最大限度地降低發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險。

當(dāng)然,本實(shí)驗(yàn)也存在一定的局限性,由于納入的樣本均為孕婦,且未觀察到抗體的存在情況或效價與孕婦年齡有明顯相關(guān)性,因此不能確定男性、非孕婦女性或未成年兒童體內(nèi)的SaCas9蛋白抗體存在情況及抗體效價與性別和年齡的關(guān)系。未來需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,納入不同性別、不同年齡階段的人群進(jìn)行檢測。本研究中羊水和臍血中均未檢測出SaCas9蛋白抗體,與Charlesworth等[4]的研究比較,臍血中的SaCas9蛋白抗體檢測的陽性率較低,可能與胎兒免疫系統(tǒng)尚未成熟、檢測的人群、檢測方法等有關(guān)。未來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,收集來自不同性別、不同年齡、不同地區(qū)的健康成人及遺傳病患兒來源的外周血、遺傳病患胎來源的羊水和臍帶血進(jìn)行檢測,從而更加全面地評測SaCas9蛋白抗體在人體內(nèi)存在情況。Wagner等[20]研究發(fā)現(xiàn),成人體內(nèi)檢測到針對SaCas9的細(xì)胞免疫,而胎兒臍血內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)沒有研究胎兒體內(nèi)SaCas9蛋白抗體細(xì)胞免疫的存在情況,未來需對其進(jìn)一步的研究。

綜上所述,SaCas9蛋白抗體在成人體內(nèi)廣泛存在,而在胎兒體內(nèi)幾乎未檢出,表明胎兒體內(nèi)可能沒有針對CRISPR/SaCas9系統(tǒng)的體液免疫,從而為遺傳病的宮內(nèi)基因治療提供了一定的依據(jù)。