李文倩 鄭仕杰 萬少枝 李冊興 孫培媛 呂建峰

長期的焦慮是動脈粥樣硬化的一個獨立風險因素,肥胖對動脈粥樣硬化的發(fā)展和隨之而來的心血管疾病有重大影響[1,2]。流行病學還指出,焦慮與一系列心血管事件的發(fā)生呈正相關[3]。研究表明,過度肥胖的人群與冠心病等心血管疾病的患病率會更高[4]。通常情況下認為,一個人可同時發(fā)生焦慮和肥胖,更重要的是,影響一個因素可能會對另一個因素產生協(xié)同作用。既往的研究大都是基于慢性壓力對情緒反應、心肌細胞功能、心臟代謝標志物及其他系統(tǒng)如肝臟和腸道的影響的分析[5～8]。之前沒有關于焦慮和肥胖這兩個風險因素引發(fā)的共同作用對動脈粥樣硬化的研究。

研究發(fā)現(xiàn),慢性壓力可引起炎性細胞因子升高使機體產生應激反應,脂肪組織的慢性低度炎癥介導肥胖等代謝性疾病的發(fā)展機制[9,10]。Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)是介導天然免疫反應的模式識別受體,在炎癥和免疫應答過程中具有重要作用,其廣泛分布于免疫器官和心臟、腦、腎臟等器官組織內[11]。TLR4可以識別病原體相關分子模式和損傷相關分子模式來激活下游相關信號通路,導致炎癥過程的級聯(lián)反應。鑒于這些事實,筆者假設TLR4介導的炎癥作用可作為焦慮和肥胖導致動脈粥樣硬化不利影響的潛在指標。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級雄性C57BL/6J小鼠由三峽大學實驗動物中心提供,體質量為18～19g。本實驗經三峽大學實驗動物中心倫理學委員會批準(倫理學審批號：2020010A)。將小鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下,自由進食水,飼養(yǎng)1周適應環(huán)境。隨機將32只小鼠分為對照組(普通飲食)、焦慮組[慢性不可預測輕度應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)]、肥胖組(高脂飲食)和焦慮+肥胖組(CUMS+高脂飲食),每組各8只,干預16周。

2.試劑與儀器：高脂飼料(TP23300)購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司、酶標儀(ELx808 Biotek)、移液器(EPPendorf)、化學發(fā)光儀(CLINX6300)、灰度分析軟件(美國AlPha Innotech公司)、圖像分析軟件(Adobe)、ELISA試劑盒(武漢云克隆科技股份有限公司)、兔多抗tlr4 95kDa(武漢三鷹生物技術有限公司)、β-actin 42kDa(武漢賽維爾生物科技有限公司)。

3.焦慮模型的建立：以慢性輕度不可預見刺激,配合孤養(yǎng)建立焦慮模型[12]。造模方法：冰水游泳(4℃,5min),熱水游泳(45℃,5min),禁食、禁水24h,夾尾1min,晝夜顛倒24h,居住環(huán)境改變(空墊料或潮濕墊料),傾斜鼠籠24h等。

4.肥胖模型的建立：普通飲食含有20%蛋白質,70%碳水化合物,10%脂肪,高脂飲食含有20%蛋白質,20%碳水化合物,60%脂肪。肥胖組小鼠的平均體質量高出對照組小鼠的20%,表示肥胖模型的成功建立[13]。

5.行為學評估：(1)曠場實驗：曠場裝置為長寬各50cm、高30cm的木箱。將小鼠放入中心方格內,觀察小鼠在5min內總運動距離、中央活動距離、中央區(qū)活動時間百分比。(2)高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮為兩條開臂(50cm長×10cm寬×40cm高)和兩條閉臂(50cm長×10cm寬×40cm高)及中心區(qū)(10cm×10cm)連接而成。觀察小鼠在5min內進入開臂的次數(shù)及時間百分比。以上實驗中每只小鼠觀察結束后,噴灑75%的乙醇并清洗裝置。

6.ELISA檢測：行為學檢測后當天將小鼠摘眼球取血,提取血清,參照武漢云克隆科技股份有限公司小鼠白細胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6 (interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA分析試劑盒使用說明書步驟進行實驗操作,每孔均做3個復孔以減少誤差。

7.全自動生化分析儀器檢測血脂變化：利用全自動生化分析儀器檢測血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholestrol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholestrol,HDL-C)的水平。

8.HE染色檢測主動脈斑塊情況：行為學檢測后當天將小鼠斷頭取腦,固定腦組織,經脫水、包埋、切片、染色,觀察結果并拍照存檔。

9.IHC檢測主動脈斑塊中TLR4的表達：行為學檢測后當天將取出小鼠主動脈,固定主動脈,經脫水、包埋,加入固定抗體,顯色、復染、脫水,封片后將其放在光鏡下觀察并拍照存檔,用Image Pro Plus 7.0圖像分析系統(tǒng)做圖像數(shù)字采集及半定量分析。

結 果

1.曠場實驗結果：4組小鼠在曠場實驗中總運動距離比較,差異無統(tǒng)計學意義。與對照組比較,焦慮組、肥胖組中央運動距離下降(P<0.05),中央活動時間百分比明顯下降(P<0.001)。與焦慮組、肥胖組比較,焦慮+肥胖組小鼠中央運動距離下降(P<0.01),中央活動時間百分比明顯下降(P<0.001 vs 肥胖組,P<0.01 vs 焦慮組);其中焦慮和肥胖對中央運動距離的主效應顯著(F=36.012,P<0.001;F=34.813,P<0.001),對中央活動時間百分比的主效應顯著(F=324.802,P<0.001;F=204.074,P<0.001),焦慮聯(lián)合肥胖對中央運動距離沒有交互作用(F=1.918,P=0.203),對中央活動時間百分比的交互作用顯著(F=57.614,P<0.001,圖1)。

圖1 各組小鼠曠場實驗結果與對照組比較,*P<0.05,**P<0.001;與肥胖組比較,#P<0.01,##P<0.001;與焦慮組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.高架十字迷宮結果：與對照組比較,焦慮組、肥胖組小鼠進入開臂的時間和次數(shù)百分比明顯下降(P<0.001);與焦慮組、肥胖組比較,焦慮+肥胖組小鼠進入開臂的次數(shù)百分比明顯下降(P<0.01 vs 肥胖組,P<0.05 vs 焦慮組)、進入開臂的時間百分比明顯下降(P<0.001);其中焦慮和肥胖對小鼠進入開臂次數(shù)百分比的主效應顯著(F=89.561,P<0.001;F=57.711,P<0.001),對小鼠進入開臂時間百分比的主效應顯著(F=257.134,P<0.001;F=110.201,P<0.001),焦慮聯(lián)合肥胖對小鼠進入開臂的次數(shù)百分比交互作用顯著(F=8.167,P<0.05),對進入開臂的時間百分比沒有交互作用(F=4.907,P=0.058,圖2)。

圖2 各組小鼠高架十字迷宮實驗結果與對照組比較,*P<0.001;與肥胖組比較,#P<0.01,##P<0.001;與焦慮組比較,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001

3.體質量變化結果：與對照組(28.81±1.23g)和焦慮組(27.05±0.53g)比較,肥胖組(34.84±1.24g)和焦慮+肥胖組(32.53±0.80g)在第16周的體質量增加(P<0.001),表示肥胖模型建立成功(肥胖組體質量大于對照組的20%);與對照組比較,焦慮組在第4周、第8周、第12周、16周的體質量下降(P分別為<0.001、<0.001、<0.05、<0.01)。然而,與焦慮+肥胖組比較,肥胖組在第8周、第12周、16周表現(xiàn)出更高的體質量(P<0.001)。與第0周比較,對照組在第16周也顯示出體質量增加(P<0.001)。其中時間、焦慮、肥胖對體質量沒有交互作用(F=1.715,P=0.178);焦慮與時間的交互作用(F=11.981,P<0.001)、肥胖與時間的交互作用(F=40.356,P<0.001)、焦慮的主效應(F=75.417,P<0.001)、肥胖的主效應(F=325.615,P<0.001)顯著;焦慮聯(lián)合肥胖對體質量沒有交互作用(F=0.917,P=0.347,圖3)。

圖3 各組小鼠0、4、8、12、16周體質量變化與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;與焦慮+肥胖組比較,#P<0.01,##P<0.001

4.血脂水平：與對照組比較,肥胖組中TC、TG和LDL-C升高(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.001),而焦慮組中血脂改變差異無統(tǒng)計學意義;與肥胖組比較,焦慮+肥胖組中TC、TG和LDL-C更高(P<0.05),HDL-C無明顯改變;與焦慮組比較,焦慮+肥胖組中TC和LDL-C顯著升高(P<0.01),TG明顯升高(P<0.001),HDL-C顯著降低(P<0.001);其中焦慮對TC、TG的主效應顯著(P<0.05);焦慮對LDL-C、HDL-C的主效應不顯著;肥胖對TC的主效應顯著(P<0.01),對TG、LDL-C、HDL-C的主效應更加顯著(P<0.001);焦慮聯(lián)合肥胖干預對血脂變化沒有交互作用(表1和表2)。

表1 各組小鼠血脂變化情況

表2 各組小鼠血脂變化情況的雙因素方差分析表

5.HE染色檢測小鼠主動脈粥樣硬化結果：對照組中主動脈血管壁內膜光滑完整,血管平滑肌細胞排列整齊,未見脂質沉積及管腔狹窄;焦慮組中主動脈血管平滑肌細胞排列紊亂及部分血管內皮細胞損傷,可見少量泡沫細胞;肥胖組中主動脈血管內皮細胞損傷,可見大量泡沫細胞、少量脂質沉積及粥樣硬化;焦慮+肥胖組中主動脈血管腔嚴重狹窄,可見斑塊面積較大,且斑塊表面由薄且不穩(wěn)定的纖維帽覆蓋,其斑塊下可見壞死崩解物質及泡沫細胞等(圖4)。

圖4 各組小鼠中主動脈組織形態(tài)學變化

6.免疫組化檢測小鼠主動脈斑塊中TLR4的表達結果：與對照組比較,肥胖組TLR4在主動脈斑塊的表達明顯增多(P<0.05),焦慮組TLR4在主動脈斑塊的表達差異無統(tǒng)計學意義;與焦慮組、肥胖組比較,焦慮+肥胖組TLR4在主動脈斑塊的表達更多(P<0.01);其中焦慮和肥胖對主動脈斑塊TLR4的主效應顯著(F=14.055,P<0.01;F=24.183,P<0.001),但焦慮聯(lián)合肥胖沒有交互作用(F=0.857,P=0.366,圖5)。

圖5 各組小鼠中主動脈中TLR4的表達情況與對照組比較,*P<0.05,**P<0.001;與肥胖組比較,#P<0.01;與焦慮組比較,△P<0.01

7.ELISA檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量表達結果：與對照組比較,焦慮組、肥胖組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達明顯增多(P<0.001);與焦慮組、肥胖組比較,焦慮+肥胖組IL-1β、IL-6、TNF-α的表達增加更多(P<0.001);其中焦慮和肥胖對血清中IL-1β的主效應顯著(F=3029.620,P<0.001;F=3102.544,P<0.001),對血清中IL-6的主效應顯著(F=1203.733,P<0.001;F=1221.181,P<0.001),對血清中TNF-α的主效應顯著(F=877.930,P<0.001;F=872.725,P<0.001),且焦慮聯(lián)合肥胖對血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的交互作用顯著(F=171.555,P<0.001;F=458.255,P<0.001;F=23.877,P<0.001,圖6)。

圖6 各組小鼠血清炎性細胞因子表達水平與對照組比較,*P<0.001;與肥胖組比較,#P<0.001;與焦慮組比較,△P<0.001

討 論

本研究觀察了焦慮和肥胖導致小鼠動脈粥樣硬化的形成,并探討血清炎性細胞因子及TLR4在其中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)單獨焦慮僅引起血管內皮相對紊亂,單獨肥胖可以導致動脈粥樣硬化,當合并時會明顯加劇動脈粥樣硬化程度并導致斑塊不穩(wěn)定,其中TLR4表達無交互作用,血清炎性細胞因子水平上調有顯著交互作用;焦慮或肥胖時都可以引起明顯的焦慮行為,兩者合并時會大大增加焦慮行為表現(xiàn);焦慮可明顯減少高脂飲食和普通飲食喂養(yǎng)的小鼠的體質量增加,但增加了高脂飲食組中血脂的變化。

截至目前,研究主要集中在對慢性壓力的自主神經反應和心肌功能上,而沒有研究動脈粥樣硬化程度和性質[5]。本研究表明,肥胖疊加焦慮時才會誘發(fā)明顯動脈粥樣硬化程度,同時導致不穩(wěn)定斑塊的形成。焦慮組中血管變化不明顯,只有高脂飲食后才會形成斑塊,且在焦慮作用下肥胖小鼠的動脈粥樣硬化程度最重,并形成不穩(wěn)定性斑塊。因此,筆者猜想焦慮是肥胖小鼠致不穩(wěn)定性斑塊形成的關鍵決定因素。

本研究結果還表明,定期攝入高脂飲食會增加體質量和血脂的變化,然而焦慮會減少體質量增加,反而增加了高脂飲食組中血脂的水平。壓力似乎以兩種方式影響體質量的變化,導致暴飲暴食或飲食減少,這可能是受到壓力源嚴重程度的影響,從本實驗可以看出在第4、8周時焦慮組較對照組中體質量的增加減少是最明顯,可能由于才開始接受CUMS時小鼠對食物偏好明顯受到影響,在第8、16周時體質量似乎比之前減少更為緩慢,長期慢性壓力會導致小鼠產生適應性最終導致體質量減少不明顯[14]。與對照組比較,焦慮組中血脂水平并沒有明顯改變,合并癥組中血脂水平較肥胖組中增加,這與既往研究結果一致[8]?？梢越忉尀楦咧嬍硨ρ秃ｑR膽固醇之間的關聯(lián)產生了積極的影響[15]。然而后來卻有相反的結果,甘油三酯在壓力合并高脂飲食中沒有明顯改變,甚至出現(xiàn)少許下降[6]。鑒于以上發(fā)現(xiàn),進一步研究壓力與高脂飲食之間對膽固醇代謝的相互作用,可為心血管疾病提供一個新的見解。

焦慮、肥胖和焦慮合并肥胖時都可以引起明顯的焦慮行為,這與既往研究結果一致[7]。從機制上分析,全身炎性細胞因子水平的升高是動脈粥樣硬化發(fā)展中的關鍵因素,在這項研究中,無論是單獨焦慮或肥胖或合并組都能夠導致炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)水平的升高[16]。因此,炎癥是焦慮和肥胖導致動脈粥樣硬化的橋梁。眾所周知,TLR4是天然免疫反應模式識別受體家族中的一員,在炎癥和免疫應答過程中具有重要作用,其與動脈粥樣硬化關系最為密切[11]。有研究發(fā)現(xiàn),CUMS誘導的抑郁癥小鼠海馬TLR4水平明顯升高[17]。本實驗檢測了主動脈斑塊中TLR4的表達情況,結果顯示,肥胖顯著增加了TLR4的表達,其焦慮+肥胖組中TLR4的表達更高但無交互作用,與血清炎性細胞因子的升高呈平行關系。

綜上所述,焦慮合并肥胖時會導致最為嚴重的動脈粥樣硬化并導致斑塊的不穩(wěn)定,以及最高的TLR4和炎性細胞因子水平。肥胖但無焦慮的小鼠在各組中血脂水平最高,單獨焦慮、單獨肥胖和焦慮+肥胖組都增加了焦慮行為。因此,本研究表明,焦慮聯(lián)合肥胖加劇動脈粥樣硬化程度,導致血清脂質水平異常和血清中炎性細胞因子增加,這些影響可能是通過上調TLR4介導的。