高惠寬 侯 斐

糖尿病心肌病是一種主要的糖尿病并發(fā)癥,是糖尿病患者的主要死因之一。心肌細胞凋亡、心肌纖維化是糖尿病心肌病的主要病理狀態(tài),可導致心臟舒張和收縮功能障礙。抑制心肌細胞凋亡的藥物可以預防糖尿病心肌病。

細胞凋亡在很大程度上受Bcl家族基因的調控,包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。既往研究表明,無論是在體內還是體外,抑制Rho激酶(Rho kinase,ROCK)活性或下調ROCK都能抑制病理刺激誘導的心肌細胞凋亡[1,2]。法舒地爾是一種ROCK抑制劑,有研究表明,其可以改善糖尿病患者蛋白尿情況,亦可以抑制過度耐力運動訓練引起的心肌細胞凋亡[3,4]。但法舒地爾對糖尿病心肌細胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。自噬是細胞能量代謝和細胞存活最重要的調節(jié)靶點之一。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病小鼠模型中,腎組織中自噬蛋白表達增多[5]。然而,自噬在促進或改善糖尿病心肌病細胞凋亡中的作用仍未得到闡明。一些研究表明,法舒地爾可增強自噬[6,7]。本研究旨在探討高糖環(huán)境下,法舒地爾對原代心肌細胞凋亡的作用及自噬在其中的作用。

材料與方法

1.主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS購自美國Gibco公司;鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、兔抗鼠P62抗體、兔抗鼠α-橫紋肌肌動蛋白(α-SA)抗體、Trizol購自美國Sigma公司;兔抗鼠肌球蛋白磷酸酶靶標亞基1(MYPT1)抗體、兔抗鼠磷酸化(p)-MYPT1抗體、兔抗鼠Bcl-2抗體、兔抗鼠Bax抗體、兔抗鼠LC3抗體購自英國Abcam公司;異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)-膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

2.乳鼠心肌細胞原代分離與培養(yǎng)：實驗方案經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院醫(yī)學倫理中心批準(倫理學審批號：16-5001)。出生2天乳鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。腹腔注射10%水合氯醛,按體質量計算用量,0.1ml/10g。無菌條件下開胸取出C57BL/6乳鼠心臟,去除心房,用PBS多次洗凈血液,之后剪碎,加入0.2%的Ⅱ型膠原酶,37℃水浴震蕩40～60min,之后吹打離心1200r/min,后DMEM完全培養(yǎng)基重懸種,采用差速貼壁獲得心肌細胞(乳鼠差速2h)。上清液吸出(內含心肌細胞),上清液用Hanks液清洗、離心,共 3次,獲得心肌細胞[8]。原代培養(yǎng)心肌細胞,第2～3代細胞用于實驗。

3.原代心肌細胞HE染色：心肌細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中;培養(yǎng)2～3天后,PBS清洗;4%多聚甲醛固定20min;蘇木精染色2～5min,水洗2min;鹽酸分化至細胞核染色清晰,水洗,并浸于水中至核變藍;伊紅液染色2min,水洗2min;脫水透明;中性樹膠封片。

4.原代心肌細胞免疫鑒定：心肌細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中;培養(yǎng)2～3天后,PBS清洗;4%多聚甲醛固定20min,PBS清洗;0.1% TritonX-100室溫孵育30min,PBS清洗;H2O2室溫孵育10min,PBS清洗;1%FBS室溫封閉1h;滴加α-SA抗體,4℃過夜;PBS清洗,滴加熒光標記的二抗,室溫避光孵育1h;PBS清洗,DAPI染核室溫避光孵育15min,PBS洗3次;熒光顯微鏡下觀察熒光。

5.細胞培養(yǎng)及分組：細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)的低糖(葡萄糖5.5mmol/L)DMEM培養(yǎng)基中,當細胞達到80%～90%融合時傳代或給藥處理。給藥前,將細胞接種于6孔板(每孔約105個細胞),于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h;后更換培養(yǎng)基為含1%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)12h。此后,按照以下分組更換培養(yǎng)基及加入藥物：對照組(LG組,培養(yǎng)基葡萄糖濃度5.5mmol/L)、高糖組(HG組,葡萄糖濃度25mmol/L)、LG+法舒地爾組(LF組,加入100μmol/L法舒地爾)、HG+法舒地爾組(HF組)、高糖+法舒地爾+3-MA組(HM組,加入5mmol/L 3-MA)。給藥處理后,各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。

6.流式細胞術實驗：把細胞培養(yǎng)液吸出至離心管內。冰PBS洗滌貼壁細胞1次,加入適量胰酶消化細胞。消化好后,加入之前收集的細胞培養(yǎng)液,輕輕吹打均勻,轉移到離心管內,1000×g離心5min;PBS洗滌細胞兩次并計數(shù),收集(1～5)×105細胞,然后1000×g離心5min;加入100μl×Binding Buffer重懸細胞;加入5μl AnnexinV-FITC、5μl PI染色液,室溫避光孵育15min;加入400μl Binding Buffer;上流式細胞儀檢測。

7.Western blot法檢測蛋白表達：各組細胞棄去培養(yǎng)上清,用PBS洗兩次,再加入150μl裂解液。冰上裂解40min,4℃下12000r/min離心15min。BCA法蛋白定量,電泳轉膜至NC膜。奶粉封閉的膜用5%BSA-TBST稀釋一抗,4℃過夜,滴加二抗,山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶1000,山羊抗鼠IgG(H+L)HRP 1∶1000室溫孵育40min。TBST洗膜后,ECL滴加到膜的蛋白面,反應2min,做化學發(fā)光。將膜放到化學發(fā)光儀中收集信號。

8.RT-PCR實驗：各組細胞棄去培養(yǎng)上清,加入Trizol變性液,提取細胞中總RNA,待RNA完全溶解后檢測其濃度。采用兩步法,以β-actin為內參體系,進行實時熒光定量PCR。反應程序：95℃ 3min,95℃ 30s,55℃ 20s,72℃ 20s共40個循環(huán);溶解曲線步驟：95℃ 15s,60℃ 15s,20min升溫,95℃ 15s。目的基因引物序列,ROCK1上游引物：5′-CAAGTCAGACCTCACAGCTT-3′,下游引物：5′-CTCATCTCTGTGTGACTCTT-3′;ROCK2上游引物：5′-AGCTGGAAAGAGAAAAGGCC-3′,下游引物：5′-TGTTTCTGGAGCTGATTGAC-3′。統(tǒng)計學分析采用相對定量,應用RQ=2-△△CT進行計算相對表達量。

結 果

1.原代心肌形態(tài)及免疫鑒定：原代心肌呈圓形或梭形(圖1A),α-SA抗原表達呈陽性反應(圖1B)。

圖1 原代心肌細胞形態(tài)及免疫鑒定(×100)A.HE染色;B.α-SA免疫熒光染色(綠色為α-SA陽性染色,藍色為細胞核)

2.法舒地爾抑制高糖環(huán)境下的原代心肌細胞凋亡：使用Annexin V-FITC、PI標記細胞,采用流式細胞術檢測早期凋亡細胞比例。高糖組細胞凋亡比例較低糖組明顯升高(53.4% vs 1.0%)。使用法舒地爾干預后,細胞凋亡比例下降至13.9%。而3-MA干預可逆轉法舒地爾引起的細胞凋亡的下降(13.9%升至37.2%,圖2)。筆者檢測了各組細胞抗凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的表達情況,結果顯示,高糖組Bcl-2表達降低、Bax表達升高,而法舒地爾干預后可部分逆轉該變化(HF組 vs HG組),而3-MA干預可抑制法舒地爾的作用(HM組 vs HF組,圖3)。

圖2 法舒地爾抑制高糖環(huán)境下原代心肌細胞凋亡,3-MA可逆轉法舒地爾的作用A.流式細胞術檢測細胞凋亡情況：Q2-UL壞死細胞,Q2-UR晚期凋亡細胞,Q2-LL活細胞,Q2-LR早期凋亡細胞;B.各組早期凋亡細胞比例,計算Q2-LR區(qū)細胞數(shù)與4區(qū)所有細胞數(shù)的比值即為早期凋亡細胞比例,*P<0.05

圖3 法舒地爾及3-MA對高糖環(huán)境下原代心肌細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的影響A.Western blot法檢測結果;B.各組細胞Bcl-2、Bax的相對表達量。與LG組比較,*P<0.05,**P<0.01;與HG組比較,#P<0.05;與HF組比較,△P<0.05

3.法舒地爾抑制高糖環(huán)境下原代心肌細胞內ROCK表達：測定ROCK1、ROCK2的mRNA表達反映ROCK表達情況,同時采用Western blot法檢測ROCK下游蛋白MYPT1及p-MYPT1的表達量,計算p-MYPT1/MYPT1比值反映ROCK活性變化。高糖環(huán)境下ROCK1、ROCK2 mRNA表達增加、p-MYPT1/MYPT1比值升高(HG組 vs LG組),而法舒地爾可使ROCK1、ROCK2 mRNA表達減少、p-MYPT1/MYPT1比值降低(HF組 vs HG組,HM組 vs HG組)。這些結果表明,法舒地爾抑制高糖環(huán)境下原代心肌細胞內ROCK表達(圖4)。

圖4 法舒地爾及3-MA對高糖環(huán)境下原代心肌細胞ROCK信號通路的影響A.ROCK1 mRNA相對表達量(RT-PCR法);B.ROCK2 mRNA相對表達量(RT-PCR法);C.Western blot法檢測p-MYPT1、MYPT1蛋白情況;D.p-MYPT1/MYPT1蛋白相對表達量比值

4.法舒地爾活化了高糖環(huán)境下原代心肌細胞內受阻的自噬流：高糖組心肌細胞內不可溶性P62蛋白表達升高,提示自噬流受阻。使用法舒地爾干預后,不可溶性P62蛋白表達減少、可溶性P62蛋白表達增多、同時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增大,說明自噬流活化。而使用自噬抑制劑3-MA,可使自噬流阻滯,逆轉法舒地爾的作用(圖5)。

討 論

心肌細胞凋亡后繼發(fā)心臟成纖維細胞活化導致心臟纖維化是糖尿病心肌病左心室舒張和收縮功能障礙的主要原因。與正常人比較,糖尿病患者心肌細胞、內皮細胞及心臟成纖維細胞的凋亡數(shù)分別為正常人的85、61及26倍[9]。這些結果說明心肌細胞對糖尿病誘導的細胞凋亡最敏感。本研究采用流式細胞術檢測細胞凋亡率,高糖組細胞凋亡率較低糖組明顯升高,所以高糖可以引起心肌細胞凋亡。

Rho GTP酶通過激活其下游靶分子ROCK調節(jié)細胞的多種行為與功能。ROCK有兩種亞型,即ROCK1和ROCK2。近年來分析發(fā)現(xiàn),心臟中ROCK2表達為主。法舒地爾是ROCK的非亞基選擇性的抑制劑,既抑制ROCK1也抑制ROCK2的表達。ROCK的作用底物有很多,典型的是MYPT1。本研究可以見到高糖可以激活RhoA/ROCK信號轉導通路,法舒地爾可抑制RhoA/ROCK的表達。研究發(fā)現(xiàn),阻斷RhoA/ROCK信號轉導通路可減輕細胞凋亡,可能通過調控Bcl-2/Bax、caspase-3、caspase-2的表達[2,10～13]。本研究在高糖培養(yǎng)的原代心肌細胞中使用法舒地爾干預后,細胞凋亡可減輕。說明法舒地爾可以抑制高糖環(huán)境下的心肌細胞凋亡,而且,法舒地爾對細胞凋亡的作用機制既有促凋亡蛋白Bax的減少,亦有抗凋亡蛋白Bcl-2的增加。

細胞凋亡和自噬作為調控細胞程序性死亡的兩種重要方式,廣泛存在于真核細胞的生理病理過程中。盡管凋亡與自噬的特征及機制不同,但兩通路并不是獨立并行的,兩者有共同的刺激因子和調節(jié)蛋白,兩通路之間存在著錯綜復雜的對話。眾多調控元件參與凋亡和自噬的交互應答機制,包括 Beclin1、Bcl-2家族蛋白、P53等。有研究發(fā)現(xiàn),增強自噬可減輕細胞凋亡水平[14]。國內有研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍可通過增強細胞自噬減輕糖尿病大鼠血管內皮細胞凋亡[15]。低糖或低氧環(huán)境下,心肌細胞自噬活性增強、細胞凋亡比例減少[16～18]。目前,國內外關于Rho/ROCK信號通路與自噬信號通路直接關系較少。Gurkar發(fā)現(xiàn)ROCK1可以磷酸化Beclin1的Thr119,引起B(yǎng)eclin1/Bcl-2復合體分離,從而引起自噬增強。然而亦有研究表明法舒地爾阻斷ROCK,可增強自噬[6,7]。

P62是自噬過程中最重要的轉運蛋白,它是連接LC3與待降解產物的中介。P62蛋白含量變化反應自噬流的活化與否,自噬流活化時,P62蛋白含量降低;自噬流抑制時,P62蛋白含量增加。實際操作中,可同時觀察可溶性P62蛋白、不可溶性P62蛋白和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ轉化綜合判斷自噬流狀態(tài)。若可溶性P62蛋白減少,不可溶性P62蛋白無明顯改變,同時LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化增加則表明自噬流活化;若可溶性P62蛋白減少,但不可溶性P62明顯增加,則無論LC3的變化,均表明自噬流阻斷。本研究發(fā)現(xiàn)高糖引起心肌細胞內不可溶性P62增加,提示自噬流阻斷;使用法舒地爾干預后,可溶性P62蛋白減少同時伴有LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高,說明自噬流活化。而使用自噬抑制劑3-MA阻斷自噬流后(不可溶性P62蛋白明顯升高),法舒地爾抑制心肌細胞凋亡的作用被部分反轉,說明自噬流的活化在法舒地爾對高糖環(huán)境下心肌細胞凋亡中起著重要的作用。

綜上所述,本研究以離體培養(yǎng)的原代心肌細胞為研究對象,使用高糖培養(yǎng)基,并使用法舒地爾及自噬抑制劑干預,表明法舒地爾通過活化自噬流抑制高糖環(huán)境下心肌細胞凋亡。今后將繼續(xù)探討自噬在糖尿病心肌病中的分子生物學機制,并進行動物實驗進一步加以驗證。該研究擬為糖尿病心肌病的治療提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。