孔丹丹 龔 蓮 謝宇鋒 陶 敏

肝癌是一種常見(jiàn)的、致死率高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其顯著特點(diǎn)是易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重影響患者預(yù)后。據(jù)我國(guó)2020年癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,肝癌是我國(guó)第5位高發(fā)癌癥,且在癌癥死因中排名位居第2位[1]。因此,揭示肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制非常有必要。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣蛋白2(tumor necrosis factor-alpha-induced protein 8-like 2,TIPE2)是最先以免疫負(fù)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)的TIPE家族成員之一[2]。已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)TIPE2表達(dá)降低,且與腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展、臨床分期及預(yù)后均密切相關(guān)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),TIPE2還具有抑制血管生成的作用,在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,TIPE2的過(guò)表達(dá)明顯抑制了腫瘤細(xì)胞的促血管生成能力,降低了腫瘤侵襲性[4]。但目前TIPE2在腫瘤血管生成方面的具體分子機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步闡明。因此,本研究通過(guò)探究肝癌細(xì)胞中TIPE2基因的表達(dá),闡明TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用及可能機(jī)制,以期為抗腫瘤血管生成以治療肝癌提供新思路。

材料與方法

1.材料與試劑：人肝癌細(xì)胞(SMMC7721、MHCC97H、MHCC97L、HepG2、HuH7、SK-HEP-1)、人正常肝細(xì)胞(L02)和HUVEC均為本實(shí)驗(yàn)室保種細(xì)胞。胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基和DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基(上海源培生物公司)、Transwell chamber(小室)和Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)Corning公司)、CCK-8試劑盒(中國(guó)Biosharp公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、TIPE2(美國(guó)Proteintech公司)、GAPDH抗體(美國(guó)Immunoway公司);抗人VEGF、MMP9、HIF-1α(美國(guó)Santa Cruz公司);人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子ELISA檢測(cè)試劑盒(上海優(yōu)選生物公司);綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的AdVTIPE2重組腺病毒及對(duì)照空病毒AdV由筆者所在課題組構(gòu)建[5]。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將本實(shí)驗(yàn)室保種的細(xì)胞快速解凍,離心后收集細(xì)胞沉淀,HUVEC接種于含10%胎牛血清的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基,其余細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱,常規(guī)培養(yǎng)和傳代。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H和SMMC7721細(xì)胞,消化后將密度為2×106個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液分別接種于10cm培養(yǎng)皿中,隨機(jī)分為病毒轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組,培養(yǎng)過(guò)夜。次日待細(xì)胞密度為50%～60%時(shí),然后將AdVTIPE2、AdV(對(duì)照空病毒)用最佳感染劑量分別感染上述細(xì)胞,培養(yǎng)6～8h后加入相同體積完全培養(yǎng)基,24h換液,繼續(xù)培養(yǎng)48～72h后用于后續(xù)試驗(yàn)。

4.RT-qPCR 采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,測(cè)定濃度,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟,合成cDNA,冰上配制qPCR反應(yīng)液,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,選擇合適程序上機(jī)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。運(yùn)用2-△△CT法統(tǒng)計(jì)分析相對(duì)mRNA表達(dá)量。引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成,詳見(jiàn)表1。

表1 主要基因引物序列

5.TCM的制備：預(yù)先在6孔板中接種適宜密度肝癌細(xì)胞,次日按照“細(xì)胞轉(zhuǎn)染”項(xiàng)步驟轉(zhuǎn)染病毒,感染48h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液,以1000r/min離心20min以去除死細(xì)胞,12000r/min離心10min去除細(xì)胞碎片,收集細(xì)胞上清液備用。

6.CCK-8法：預(yù)先在96孔板中以 2×103個(gè)/孔接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝癌細(xì)胞,貼壁后進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)染,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并以此為0h,隨后分別常規(guī)培養(yǎng)24、48、72、96h,每孔加入10μl CCK-8試劑,孵育2～4h后,使用全波長(zhǎng)酶標(biāo)掃描儀在450nm處測(cè)量吸光度(A)值。

7.小管形成實(shí)驗(yàn)：取150μl溶解后的Matrigel基質(zhì)膠鋪于48孔板,并置于37℃培養(yǎng)箱30min。調(diào)整HUVEC細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/毫升,用兩大組TIPE2過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞TCM分別重懸,取200μl細(xì)胞懸液加入鋪好基質(zhì)膠的48孔板中,常規(guī)培養(yǎng)8h,普通倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞成管情況,隨機(jī)選取5個(gè)視野并拍照(×40)。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件評(píng)估相對(duì)小管總長(zhǎng)度和成管數(shù)量。

8.Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先在24孔板中接種轉(zhuǎn)染后的兩組肝癌細(xì)胞,并加入600μl DMEM完全培養(yǎng)基。將Matrigel基質(zhì)膠平鋪于Transwell上室基膜,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱風(fēng)干成膠(Transwell遷移實(shí)驗(yàn)無(wú)此鋪膠步驟)。使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸HUVEC細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升,于上室接種100μl細(xì)胞懸液,常規(guī)共培養(yǎng)48h后,取出小室,小心拭去上室多余的細(xì)胞,4%多聚甲醛固定20min,0.1%結(jié)晶紫染色15min,自來(lái)水沖洗干凈后晾干,最后普通倒置顯微鏡(×200)下拍照,每組細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同視野,取平均值,以各自對(duì)照組細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析相對(duì)遷移、侵襲能力。

9.細(xì)胞劃痕遷移試驗(yàn)：將HUVEC接種于6孔板(1×104個(gè)細(xì)胞/孔),用200μl塑料移液管尖端創(chuàng)建“劃痕”(無(wú)細(xì)胞區(qū)域)。用PBS洗滌細(xì)胞,分別與各組細(xì)胞培養(yǎng)上清共同培養(yǎng)12～24h。用普通倒置顯微鏡(×40)觀察劃痕在0、12、24h時(shí)變化情況并拍照,用Image J軟件記錄分析劃痕間隙變化。

10.ELISA法檢測(cè)TCM中VEGF蛋白分泌量：收集各組TIPE2過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞TCM,5000r/min離心10min,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450nm處A值,最后根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組TCM中VEGF蛋白分泌量。

11.Western blot法檢測(cè)：在收集的各組細(xì)胞沉淀中加入適量RIPA裂解液,置于冰上充分裂解30min,以適宜轉(zhuǎn)速4℃離心,收集蛋白上清并測(cè)定濃度。平衡各組蛋白濃度后沸水浴變性,每孔上樣30μg蛋白,SDS-PAGE電泳2h分離蛋白,冰上轉(zhuǎn)膜1.5h,5%脫脂牛奶室溫封閉2h,4℃冰箱孵育一抗過(guò)夜。次日TBST洗膜3次后,使用相對(duì)應(yīng)的二抗稀釋液(1∶15000)室溫孵育1h,洗膜3次,加入超敏ECL發(fā)光液后置于成像儀中掃膜。判斷目標(biāo)蛋白的條帶位置,并根據(jù)灰度值分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1.TIPE2在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)：RT-qPCR結(jié)果顯示,與L02對(duì)照細(xì)胞比較,本研究所選的6種肝癌細(xì)胞TIPE2的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05,圖1)。由此可知,TIPE2在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。

圖1 TIPE2在肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞中的mRNA表達(dá)與L02比較,*P<0.05

2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AdV/AdVTIPE2后肝癌細(xì)胞中TIPE2的表達(dá)：選取TIPE2低表達(dá)的SMMC7721、MHCC97H細(xì)胞分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AdV對(duì)照空病毒及AdVTIPE2,分為對(duì)照組和TIPE2組。采用Western blot法及RT-qPCR法進(jìn)行TIPE2過(guò)表達(dá)效率鑒定,結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞中TIPE2幾乎表達(dá)完全缺失,而TIPE2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中TIPE2蛋白和mRNA水平均顯著上調(diào)(P<0.05),提示TIPE2過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功(圖2)。

圖2 TIPE2過(guò)表達(dá)肝癌細(xì)胞的鑒定A.Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TIPE2蛋白表達(dá)的代表性圖;B.RT-qPCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TIPE2mRNA相對(duì)表達(dá)柱形圖

3.TIPE2抑制肝癌細(xì)胞的增殖：CCK-8結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,TIPE2組細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢,且在72h和96h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。結(jié)果表明,TIPE2可抑制肝癌細(xì)胞的增殖活性。

圖3 過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響A.SMMC7721;B.MHCC97H。與對(duì)照組比較,*P<0.05

4.TIPE2抑制肝癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲：由Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,分別與各自對(duì)照組比較,TIPE2過(guò)表達(dá)顯著抑制了SMMC7721和MHCC97H肝癌細(xì)胞的相對(duì)遷移和侵襲能力(P<0.05,圖4)。因此,TIPE2具有抑制肝癌細(xì)胞體外遷移、侵襲的作用。

圖4 過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞體外遷移和侵襲的影響A.未基質(zhì)膠Transwell遷移和基質(zhì)膠Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)代表性照片;B.肝癌細(xì)胞相對(duì)遷移和侵襲能力柱形圖

5.TIPE2抑制肝癌細(xì)胞的促血管形成能力：小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,來(lái)自SMMC7721、MHCC97H的對(duì)照組和TIPE2組TCM處理的HUVEC細(xì)胞血管成管數(shù)量依次為 58.67±4.50、36.67±5.25、75.67±7.93和 32.67±4.64個(gè),與對(duì)照組比較,TIPE2過(guò)表達(dá)組TCM誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞小管結(jié)構(gòu)較少且長(zhǎng)度明顯減低,血管腔完整性較差(P<0.05,圖5)。以上結(jié)果表明,TIPE2可抑制肝癌細(xì)胞的促血管形成能力。

圖5 過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞促血管形成能力的影響A.含TCM體外小管形成實(shí)驗(yàn)代表性照片;B.HUVEC相對(duì)成管數(shù)和相對(duì)小管長(zhǎng)度散點(diǎn)圖。與對(duì)照組比較,*P<0.05

6.TIPE2抑制HUVEC細(xì)胞的體外遷移和侵襲：通過(guò)劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析了與各組TCM共培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。分別與各自對(duì)照組比較,TIPE2過(guò)表達(dá)明顯削弱了HUVEC細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力(P<0.05,圖6)。結(jié)果證實(shí),TIPE2可顯著抑制HUVEC細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力。

圖6 過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)HUVEC細(xì)胞體外遷移、侵襲的影響A.劃痕遷移實(shí)驗(yàn)代表性照片;B.肝癌細(xì)胞相對(duì)遷移和侵襲能力柱形圖;C.基質(zhì)膠Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)代表性照片

7.過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)VEGF、HIF-1α和MMP9蛋白表達(dá)的影響：ELISA結(jié)果顯示(圖7A),分別與各自對(duì)照組比較,TIPE2組細(xì)胞的VEGF蛋白分泌水平下降(P<0.05)。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示(圖7中B、C),過(guò)表達(dá)TIPE2可下調(diào)VEGF、HIF-1α、MMP9蛋白表達(dá)(P<0.05)。VEGF的分泌水平和蛋白水平結(jié)果一致。

圖7 過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)VEGF、HIF-1α和MMP9蛋白表達(dá)的影響A.過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)各組TCM中VEGF分泌的影響;B.過(guò)表達(dá)TIPE2對(duì)肝癌細(xì)胞VEGF、HIF-1α、MMP9蛋白表達(dá)的影響。與對(duì)照組比較,*P<0.05

討 論

已有報(bào)道提示,TIPE2在腫瘤中表達(dá)下調(diào),是潛在的抑癌因子,可通過(guò)多種信號(hào)通路抑制腫瘤的惡性進(jìn)展[6]。Suo等[7]研究發(fā)現(xiàn),TIPE2可抑制血管生成,VEGF的表達(dá)可隨TIPE2下調(diào)而降低。Li等[4]研究發(fā)現(xiàn),在NSCLC中過(guò)表達(dá)TIPE2可通過(guò)抑制Rac1(Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1)激活,從而削弱下游的F-肌動(dòng)蛋白聚合和VEGF表達(dá),最終抑制了腫瘤的血管生成和侵襲性。有研究發(fā)現(xiàn),TIPE2在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮促瘤作用,且與患者生存預(yù)后相關(guān)[8]。上述報(bào)道提示,TIPE2作為一種潛在的癌靶標(biāo)在腫瘤中所發(fā)揮的作用近年來(lái)受到越來(lái)越多的重視。然而,TIPE2對(duì)肝癌的作用及具體調(diào)控機(jī)制知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn),TIPE2在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下降,并對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力起抑制作用。同時(shí)采用將各組肝癌細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)來(lái)模擬腫瘤形成的微環(huán)境,并檢測(cè)小管形成能力和細(xì)胞遷移、侵襲能力。結(jié)果表明TIPE2還能削弱HUVEC細(xì)胞的血管形成和遷移、侵襲能力,與前人在肺癌模型中的研究結(jié)果一致,表明TIPE2可抑制肝癌新血管的形成。

腫瘤微環(huán)境中的缺氧刺激在誘導(dǎo)血管生成中至關(guān)重要[9]。HIF-1α是在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子,在人體內(nèi)廣泛存在[10]。激活后可調(diào)控腫瘤的多種惡性行為過(guò)程[11]。此外,在非缺氧狀態(tài)下,HIF-1α也可通過(guò)多種生長(zhǎng)因子、癌基因的激活以及抑癌基因的缺失來(lái)誘導(dǎo)其表達(dá),最終也能發(fā)揮促瘤作用[12]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,HIF-1α能激活且增強(qiáng)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性,并增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性[13]。另外,HIF-1α可通過(guò)上調(diào)VEGF,促進(jìn)VEGF與其受體VEGFR1相結(jié)合、上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),從而增加血管的通透性,誘導(dǎo)腫瘤的新生血管形成[14]。

研究表明,在乳腺癌、膽囊癌、宮頸癌等腫瘤中,HIF-1α/VEGF通路相關(guān)蛋白表達(dá)均上調(diào),并且與腫瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[15～18]。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn),HIF-1/VEGF通路相關(guān)蛋白在肝癌組織中高表達(dá),并且與腫瘤分期和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),在肝癌新生血管的形成中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[19]。因此當(dāng)肝癌細(xì)胞增殖過(guò)程中缺氧時(shí),HIF-1α?xí)龠M(jìn)VEGF的表達(dá),誘導(dǎo)和調(diào)控腫瘤新血管的生成。本研究結(jié)果表明,在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TIPE2后可引起VEGF蛋白分泌降低,并且VEGF、HIF-1α和MMP9蛋白表達(dá)也隨之下降,提示TIPE2抑制了HIF-1α/VEGF通路的激活,結(jié)合TIPE2抑制肝癌細(xì)胞血管生成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測(cè)TIPE2通過(guò)抑制HIF-1α/VEGF信號(hào)通路調(diào)控血管生成過(guò)程,進(jìn)而發(fā)揮其抑癌作用。

綜上所述,TIPE2可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與減弱HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的激活,降低MMP9的表達(dá),從而削弱細(xì)胞外基質(zhì)降解,最終抑制了肝癌的新生血管形成相關(guān)。本研究證實(shí)了TIPE2的潛在抑癌作用,這可能是肝癌的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。