黃秀萍 賴依虹 林壁濤 滕 斕 劉思德

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,也是全球第三大癌癥死亡原因,其在我國(guó)的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢(shì)[1]。CRC的治療選擇包括手術(shù)、化療、放療和靶向治療,早期CRC患者通常將手術(shù)作為首選治療方案,術(shù)后也可使用化療作為輔助治療手段[2]。目前,隨著內(nèi)鏡檢查和各種輔助技術(shù)的發(fā)展,雖然CRC患者的病死率有所下降,但仍然沒(méi)有有效方法來(lái)預(yù)防CRC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3,4]。因此,針對(duì)CRC關(guān)鍵致病因素的靶向治療成為重大突破,為臨床上預(yù)防或抑制CRC轉(zhuǎn)移研究提供了新視角。

神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin,NRP)是一種高度保守的多功能Ⅰ型單程跨膜蛋白,大小為(130～140)kDa,參與體內(nèi)各種生理與病理過(guò)程。NRP包括NRP-1和NRP-2兩個(gè)亞型,兩者通過(guò)充當(dāng)多種配體的共同受體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。其中,NRP-1作為跨膜糖蛋白在各種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,通過(guò)與幾種生長(zhǎng)因子及其同源信號(hào)受體相互作用來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲及浸潤(rùn)等[5～8]。因此,NRP-1已被提出可作為治療癌癥的一個(gè)潛在靶點(diǎn),并且已有研究表明,靶向NRP-1可延緩CRC腫瘤生長(zhǎng),并通過(guò)改變抗腫瘤巨噬細(xì)胞/促腫瘤巨噬細(xì)胞比率和激活特異性CD8+T細(xì)胞來(lái)延長(zhǎng)結(jié)直腸癌小鼠的生存期[9]。但關(guān)于NRP-1抑制CRC轉(zhuǎn)移的功能及具體作用機(jī)制尚未完全明確。因此,本研究旨在通過(guò)靶向抑制NRP-1表達(dá)后觀察CRC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為能力的變化并探究作用機(jī)制,以期為CRC的臨床治療提供新思路。

對(duì)象與方法

1.主要材料與試劑：人結(jié)直腸癌細(xì)胞系DLD-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所;FAK抑制劑CT-707購(gòu)自美國(guó)Selleck公司;DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;Polybrene和DAPI購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自北京康瑞納生物科技有限公司;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司;Matrigel膠、結(jié)晶紫染色、RIPA裂解緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒以及ECL超敏顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;一抗抗體NRP-1、FAK、p-FAK、ERK、p-ERK及GAPDH購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;sh-NRP-1慢病毒載體與陰性對(duì)照sh-NC慢病毒載體均由生工生物工程(上海)股份有限公司構(gòu)建,并完成慢病毒包裝、濃縮及效價(jià)測(cè)定。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與分組：在DLD-1細(xì)胞中添加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5% CO2環(huán)境中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),分組與處理如下：①對(duì)照組：正常培養(yǎng)DLD-1細(xì)胞;②CT-707組：FAK抑制劑CT-707(3μmol/L)處理DLD-1細(xì)胞48h;③sh-NRP-1組：sh-NRP-1慢病毒液感染細(xì)胞;④sh-NRP-1+CT-707組：sh-NRP-1慢病毒液感染細(xì)胞后,再用FAK抑制劑CT-707(3μmol/L)處理DLD-1細(xì)胞48h。

3.慢病毒感染細(xì)胞：將DLD-1細(xì)胞調(diào)整濃度為4×105個(gè)/毫升,取100μl接種于6孔板,加入sh-NRP-1慢病毒液或陰性對(duì)照sh-NC慢病毒液進(jìn)行感染,分別記為sh-NRP-1組、sh-NC組,感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為100,并添加5μg/ml Polybrene,處理10h后收集細(xì)胞,利用0.5μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DLD-1細(xì)胞,并以正常培養(yǎng)的DLD-1細(xì)胞作為對(duì)照組。在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)情況,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法抽提各組DLD-1細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NRP-1在mRNA水平上的表達(dá)情況,NRP-1上游引物：5′-ATGACGACCAGGCCAACTG-3′,下游引物：5′-ATGACCGTGGGCTTTTCTGT-3′;β-actin上游引物：5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3′,下游引物：5′-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3′。

5.CCK-8法：將各組DLD-1細(xì)胞置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng),分別于24、48、72h時(shí),加入10μl CCK-8試劑液,孵育2h,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450nm處吸光度(A)值。

6.EdU染色：將各組DLD-1細(xì)胞按每孔1×105個(gè)的密度接種于24孔板,37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24h后,進(jìn)行EdU染色,DAPI避光孵育30min,甘油封片,激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況并采集圖像。

7.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔培養(yǎng)板背后均勻畫出橫線,每隔0.5cm一道。將各組DLD-1細(xì)胞按每孔5×105個(gè)的密度接種于6孔板中,37℃、5%CO2環(huán)境中過(guò)夜培養(yǎng)。無(wú)菌槍頭垂直于板底劃痕。0h與48h取出細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并采集圖像。

8.Transwell實(shí)驗(yàn)：將稀釋的Matrigel膠鋪于24孔Transwell小室上室,待膠凝固。取200μl各組DLD-1細(xì)胞懸液(2×104個(gè)/毫升)加入鋪膠的上室,下室加入600μl含胎牛血清培養(yǎng)液,孵育24h,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上室不進(jìn)行鋪膠,其他操作均與上述侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程一致。

9.Western blot法檢測(cè)：采用RIPA裂解液提取各組DLD-1細(xì)胞總蛋白,BCA法定量蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入一抗NRP-1(1∶1000)、FAK(1∶1000)、p-FAK(1∶1000)、ERK(1∶1000)、p-ERK(1∶1000),與膜在4℃下共孵育過(guò)夜。TBST洗膜,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000),室溫孵育2h,ECL超敏液顯色,紫外凝膠成像系統(tǒng)成像,Image J軟件分析蛋白印跡條帶灰度值,以GAPDH作為內(nèi)參。

結(jié) 果

1.細(xì)胞感染后檢測(cè)結(jié)果：在倒置熒光顯微鏡下觀察到sh-NC組和sh-NRP-1組的DLD-1細(xì)胞中均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光,兩組細(xì)胞感染率均為90%以上,而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見綠色熒光,詳見圖1A。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),sh-NRP-1組DLD-1細(xì)胞中NRP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量與蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組和sh-NC組(P<0.05),而sh-NC組與對(duì)照組的細(xì)胞中NRP-1mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見圖1中B和C。

圖1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果測(cè)定A.倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)(×100);B.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NRP-1mRNA表達(dá);C.Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NRP-1蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較,*P<0.05;與sh-NC組比較,#P<0.05

2.各組CRC細(xì)胞增殖水平比較：各組DLD-1細(xì)胞處理后培養(yǎng)24、48、72h,CT-707組和sh-NRP-1組的細(xì)胞增殖活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05);sh-NRP-1+CT-707組細(xì)胞在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的增殖活性也顯著低于sh-NRP-1組(P<0.05),詳見圖2。各組DLD-1細(xì)胞內(nèi)均可見紅色染色,與對(duì)照組比較,CT-707組和sh-NRP-1組的細(xì)胞中EdU陽(yáng)性百分比顯著降低(P<0.05);而與sh-NRP-1組比較,sh-NRP-1+CT-707組細(xì)胞中EdU陽(yáng)性百分比也顯著降低(P<0.05),詳見圖3。

圖2 CCK-8測(cè)定CRC細(xì)胞增殖活性

圖3 EdU染色觀察CRC細(xì)胞增殖水平(×100)與對(duì)照組比較,*P<0.05;與sh-NRP-1組比較,#P<0.05

3.各組CRC細(xì)胞劃痕愈合率比較：與對(duì)照組比較,CT-707組和sh-NRP-1組的DLD-1細(xì)胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.05);sh-NRP-1+CT-707組的細(xì)胞劃痕愈合率又顯著低于sh-NRP-1組(P<0.05),詳見圖4。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定CRC細(xì)胞劃痕愈合情況(×100)與對(duì)照組比較,*P<0.05;與sh-NRP-1組比較,#P<0.05

4.各組CRC細(xì)胞遷移與侵襲水平比較：與對(duì)照組比較,CT-707組和sh-NRP-1組的細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均顯著減少(P<0.05);與sh-NRP-1組比較,sh-NRP-1+CT-707組的細(xì)胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目也均顯著減少(P<0.05),詳見圖5。

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CRC細(xì)胞遷移與侵襲(結(jié)晶紫染色,×100)與對(duì)照組比較,*P<0.05;與sh-NRP-1組比較,#P<0.05

5.各組CRC細(xì)胞FAK/ERK途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較：與對(duì)照組比較,CT-707組和sh-NRP-1組的DLD-1細(xì)胞中FAK蛋白磷酸化水平和ERK蛋白磷酸化水平均顯著下調(diào)(P<0.05);與sh-NRP-1組比較,sh-NRP-1+CT-707組細(xì)胞中FAK蛋白磷酸化水平和ERK蛋白磷酸化水平均顯著下調(diào)(P<0.05),詳見圖6。

圖6 Western blot法檢測(cè)CRC細(xì)胞FAK/ERK途徑相關(guān)蛋白表達(dá)1.對(duì)照組;2.CT-707組;3.sh-NRP-1組;4.sh-NRP-1+CT-707組。與對(duì)照組比較,*P<0.05;與sh-NRP-1組比較,#P<0.05

討 論

幾十年來(lái),盡管CRC篩查程序和輔助腫瘤治療方法的進(jìn)步明顯改善了患者的預(yù)后,但CRC病死率仍然較高,對(duì)其潛在機(jī)制的了解較為有限。CRC最初發(fā)展為良性腺瘤性息肉,逐漸發(fā)展為晚期腺瘤、浸潤(rùn)性癌并最終發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4,10],據(jù)統(tǒng)計(jì),大約有25%的CRC患者出現(xiàn)同步轉(zhuǎn)移,而另有25%的患者在整個(gè)疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)生了轉(zhuǎn)移。發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC患者預(yù)后差,5年生存率不足10%[11]。然而,CRC轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制也尚未完全闡明,已知參與癌癥進(jìn)展的分子可以作為預(yù)后標(biāo)志物,因此,更好地了解CRC的發(fā)病機(jī)制和鑒定新型生物學(xué)標(biāo)志物將有助于了解癌癥進(jìn)展的分子機(jī)制,從而顯著提高CRC的診斷、預(yù)防和治療水平。

NRP-1已被證明與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),其能夠與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族及其受體、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及其受體等多種細(xì)胞因子相互作用,影響腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤細(xì)胞遷移等[12,13]。此外,NRP1還可以通過(guò)穩(wěn)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能和阻止腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞進(jìn)入含氧量正常的腫瘤區(qū)域來(lái)加速腫瘤進(jìn)展[14]。因此,NRP1已成為腫瘤治療的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示,通過(guò)轉(zhuǎn)染sh-NRP-1慢病毒靶向下調(diào)CRC細(xì)胞中NRP-1表達(dá)后,細(xì)胞增殖活性明顯下降,細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目也均明顯減少,這表明在CRC的惡性進(jìn)展過(guò)程中,NRP-1參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。既往研究也表明,NRP1調(diào)控多種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移行為,例如,Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn),NRP1促進(jìn)Met/β1-整合素,從而促進(jìn)CRC細(xì)胞的遷移與轉(zhuǎn)移。Chen等[16]研究表明,NRP1通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移。Seifi-Alan等[17]研究指出,與沒(méi)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者比較,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者的NRP-1蛋白表達(dá)顯著升高,說(shuō)明NRP-1可能是乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)。

FAK是一種細(xì)胞內(nèi)高度保守的非受體酪氨酸激酶,由位于人類染色體8q24.3上的PTK2編碼,處于整合素、生長(zhǎng)因子等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn),可作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和血管生成的介質(zhì),將細(xì)胞外信號(hào)傳遞到細(xì)胞中,從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的多種功能作用,例如黏附、遷移和侵襲等[18,19]。FAK活化后,可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶途徑引起級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與腫瘤轉(zhuǎn)移,而ERK是絲裂活化蛋白激酶通路的主要成員之一,能夠被多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子磷酸化所激活,其過(guò)度活化在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中均起主要作用[20]。CT-707是一種低分子選擇性FAK抑制劑,可在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí),CT-707在藥物代謝和安全性方面表現(xiàn)良好,治療潛力較大,目前在我國(guó)已作為非小細(xì)胞型肺癌的抗腫瘤新藥進(jìn)入臨床使用階段[21]。本研究通過(guò)使用CT-707作用CRC細(xì)胞后,檢測(cè)到細(xì)胞增殖活性明顯下降,細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目均明顯減少,同時(shí),FAK蛋白磷酸化水平和ERK蛋白磷酸化水平均顯著下調(diào);此外,在靶向下調(diào)CRC細(xì)胞中NRP-1表達(dá)后,也發(fā)現(xiàn)FAK蛋白磷酸化水平和ERK蛋白磷酸化水平表現(xiàn)為下調(diào)。通過(guò)進(jìn)一步靶向下調(diào)CRC細(xì)胞中NRP-1表達(dá)并使用CT-707作用CRC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),細(xì)胞增殖活性進(jìn)一步下降,細(xì)胞遷移與侵襲數(shù)目也均進(jìn)一步減少。由此推測(cè),NRP-1參與CRC腫瘤轉(zhuǎn)移的作用可能與其調(diào)控FAK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,NRP-1參與了CRC腫瘤轉(zhuǎn)移,靶向NRP-1可抑制CRC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,該作用機(jī)制可能與調(diào)控FAK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。但本研究只從CRC細(xì)胞系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)檢測(cè),后續(xù)需要建立動(dòng)物模型做進(jìn)一步的功能研究,此外,對(duì)CRC細(xì)胞作用的信號(hào)機(jī)制也有待于深入探討,分析是否影響或涉及其他相關(guān)通路的作用機(jī)制,旨在為NRP-1靶向治療CRC轉(zhuǎn)移提供更多證據(jù)。