徐 榮,王乃群,譚 為,胡小雄,吳 雯,袁 航

江西省宜春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西宜春 336000

銅綠假單胞菌(PA)是臨床最重要的條件致病菌之一,可以引起肺部、皮膚軟組織、血液和泌尿系統(tǒng)等多個(gè)部位的感染。全國和本院2019年的細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告都顯示,PA的臨床分離率在革蘭陰性致病菌中排第3位,約占12%[1-2]。隨著抗菌藥物的廣泛使用,強(qiáng)大的環(huán)境選擇壓力導(dǎo)致了PA的耐藥機(jī)制越來越復(fù)雜和多樣,包括產(chǎn)酶、藥物作用靶位改變、主動(dòng)外排機(jī)制、膜通道蛋白缺失和生物膜形成等[3]。其中生物膜一旦形成,PA就很難被徹底清除,這是導(dǎo)致臨床出現(xiàn)難治性、慢性感染病例的重要原因[4]。治療生物膜相關(guān)感染時(shí),醫(yī)生往往會(huì)聯(lián)合使用敏感且膜滲透性能好的抗菌藥物,除了及時(shí)清除播散性細(xì)菌,還可以降低感染部位的生物膜負(fù)載[5-6]。但是由于細(xì)菌耐藥性的增加,尤其是多重耐藥菌株的逐漸增多,抗菌藥物在體內(nèi)的濃度常常達(dá)不到最低抑菌濃度(MIC),即處于亞抑菌濃度狀態(tài)。此狀態(tài)下,對于臨床常用抗菌藥物聯(lián)合對PA生物膜的作用效果還缺少系統(tǒng)性評價(jià)。本研究旨在以臨床黏液型多重耐藥PA菌株為對象,比較在1/2 MIC亞抑菌濃度時(shí),6種臨床常用抗菌藥物聯(lián)合使用對其生物膜的體外抑制效果。

1 材料與方法

1.1菌株收集 收集2020年10月至2021年3月本院臨床微生物室分離的黏液型多重耐藥PA菌株6株。細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)采用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng),多重耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)為對3類或3類以上臨床常用抗菌藥物不敏感[7]。菌株使用含15%甘油的無菌肉湯-80 ℃保存。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌MIC測定 復(fù)蘇PA菌株,統(tǒng)一采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法檢測哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、亞胺培南(IPM)、左氧氟沙星(LVX)和慶大霉素(GEN)6種抗菌藥物的MIC,質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853。TZP購自海南通用三洋藥業(yè)有限公司(批號:210801-2),CAZ購自海南海靈化學(xué)制藥有限公司(批號:2110211),ATM購自山東羅欣藥業(yè)有限公司(批號:321063008),IPM購自杭州默沙東制藥有限公司(批號:u025798),LVX購自華夏生生藥業(yè)有限公司(批號:210815307),GEN購自瑞陽制藥有限公司(批號:21052611)。

1.2.2菌株多位點(diǎn)序列分型(MLST) 將6株P(guān)A送浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司做全基因組測序,提取管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列放在PAMLST數(shù)據(jù)(https://pubmlst.org/organisms/pseudomonas-aeruginosa)中比對得到序列型(ST)。

1.2.3構(gòu)建PA生物膜 使用肉湯活化黏液型PA,并調(diào)整濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷岫取Ｎ?0 μL菌液加入到含200 μL肉湯的聚苯乙烯96孔板中,常溫條件下水平振蕩儀上低頻振蕩,培養(yǎng)48 h形成生物膜。使用高壓去離子水輕柔沖洗96孔板3次,去除浮游細(xì)菌后,倒扣,室溫晾干。

1.2.41/2 MIC抗菌藥物聯(lián)合抑制生物膜效果評價(jià) 在已構(gòu)建的PA生物膜中,加入200 μL含有抗菌藥物的肉湯,抗菌藥物的種類為TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN中任意1種或2種,抗菌藥物終濃度為菌株MIC的1/2。同時(shí)設(shè)立陰性對照孔位,加入等量無藥液肉湯。37 ℃孵育48 h后沖洗3次去除浮游細(xì)菌并晾干,采用結(jié)晶紫染色洗脫法定量檢測殘留生物膜[8]:(1) 加入200 μL 1%的結(jié)晶紫染色液,室溫染色10 min。(2)沖滌后加入200 μL乙醇:丙酮洗脫液(V∶V 為70∶30)室溫作用10 min。(3)使用酶標(biāo)儀測定洗脫后孔位595 nm的吸光度(A)并計(jì)算生物膜抑制指數(shù)[9]。生物膜抑制指數(shù)=[(對照孔位A值-測試孔位A值) /對照孔位A值]×100%。生物膜抑制效果的評價(jià)實(shí)驗(yàn)均平行做2次,生物膜抑制指數(shù)取均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。對正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株MIC測定結(jié)果 6種抗菌藥物TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN對黏液型多重耐藥PA的MIC測定結(jié)果見表1。

表1 6種抗菌藥物對PA的MIC(μg/mL)

2.2菌株MLST結(jié)果 測序后提取6株黏液型多重耐藥PA的管家基因acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA和trpE的序列,放在PAMLST數(shù)據(jù)進(jìn)行MLST數(shù)據(jù)比對,結(jié)果顯示均為ST 235型。

2.3不同抗菌藥物組合抑制生物膜效果比較 在1/2 MIC時(shí),TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX、GEN單獨(dú)或聯(lián)合對6株多重耐藥PA的生物膜抑制指數(shù)見表2。6種抗菌藥物中任意2種聯(lián)用或單獨(dú)使用分別作用于6株P(guān)A的生物膜,獲得的生物膜抑制指數(shù)均符合正態(tài)分布(P>0.1)。2種藥物聯(lián)用的15種組合當(dāng)中,LVX+IPM和LVX+ATM的生物膜抑制指數(shù)大于70.0%,GEN+IPM、TZP+ATM、ATM+IPM和GEN+TZP的生物膜抑制指數(shù)大于60.0%,其余9種組合的生物膜抑制指數(shù)大于50.0%。6種藥物單獨(dú)作用于生物膜,抑制指數(shù)均小于50.0%,均值從大到小依次為LVX、IPM、ATM、GEN、TZP和CAZ,其中LVX的抑制指數(shù)均值為42.3%。

表2 常用抗菌藥物單獨(dú)或聯(lián)合對6株P(guān)A的生物膜抑制指數(shù)(%)

對21組數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)任意2種藥物聯(lián)合作用的15組數(shù)據(jù)中,LVX+IPM和LVX+ATM之間及LVX+ATM、GEN+IPM與其他藥物聯(lián)用組合相比,生物膜抑制指數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。6種藥物單獨(dú)作用于生物膜的抑制指數(shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但小于任意2種抗菌藥物聯(lián)用組合的生物膜抑制指數(shù)(P<0.05)。

3 討 論

黏液型PA由于細(xì)胞外存在大量藻酸鹽成分,比非黏液型菌株更容易形成可見的生物膜結(jié)構(gòu),但生物膜卻是致病菌在體內(nèi)定植的普遍模式[10]。當(dāng)生物膜相關(guān)菌株同時(shí)為多重耐藥菌時(shí),臨床醫(yī)生將很難選擇合適的抗菌藥物使用方案。TZP、CAZ、ATM、IPM、LVX和GEN分別是青霉素類+酶抑制劑、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類的代表性抗菌藥物,本研究通過比較在亞抑菌濃度下,這些藥物對本院6株ST 235型多重耐藥PA菌株的生物膜體外聯(lián)合抑制效果,發(fā)現(xiàn)LVX+IPM聯(lián)用的抑制效果最好,其次為LVX+ATM。說明在相同的耐藥水平下,氟喹諾酮類與碳青霉烯類或單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物聯(lián)用對于PA生物膜具有更好的抑制效果。

由于不攜帶正電荷,具有良好的生物膜穿透性,氟喹諾酮類被認(rèn)為是生物膜內(nèi)作用效果最好的一類抗菌藥物[11-12]。有文獻(xiàn)報(bào)道,LVX+IPM對PA慢性肺部感染有很好的治療效果[13]。由于亞抑菌濃度下長時(shí)間作用,很多抗菌藥物包括氟喹諾酮類和IPM都可以誘導(dǎo)PA生物膜的形成及耐藥性的加強(qiáng),因此臨床選擇抗菌藥物時(shí),首先仍應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感的藥物進(jìn)行抗生物膜治療[14-16]。

既往的體外聯(lián)合用藥表明,β-內(nèi)酰胺類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物聯(lián)合治療PA感染時(shí),通常表現(xiàn)為協(xié)同、相加或無關(guān)[17-18]。本研究當(dāng)中,6種抗菌藥物任意2種組合后,對生物膜的抑制效果均好于抗菌藥物單獨(dú)使用,因此臨床上在治療生物膜相關(guān)感染時(shí)應(yīng)盡量選擇聯(lián)合用藥。

本研究使用的6株黏液型多重耐藥PA均分離自本院臨床患者,經(jīng)MLST數(shù)據(jù)對比,顯示都?xì)w屬ST 235型,具有一定的同源性,這可能是導(dǎo)致本研究中的各組生物膜抑制指數(shù)均呈正態(tài)分布的主要原因。由于不同地區(qū)PA菌株的耐藥基因與表型不同,抗菌藥物的體外抑制效果與體內(nèi)也可能存在差異,因此抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對PA生物膜抑制效果的比對結(jié)論后續(xù)仍有必要進(jìn)一步驗(yàn)證。