姚文琴,覃云璐,黨榮敏,王 恒,鄧 瑩,王定瑜

黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,貴州都勻 558003

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由單鈉尿酸鹽沉積在關(guān)節(jié)囊、滑囊、軟骨、骨質(zhì)和其他組織中所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病。越來越多的證據(jù)表明,代謝-免疫-炎癥是一個(gè)相互影響的復(fù)雜“網(wǎng)絡(luò)”,“網(wǎng)絡(luò)”中各種分子間相互作用,導(dǎo)致疾病發(fā)生、發(fā)展[1]。目前痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療主要包括緩解發(fā)作時(shí)疼痛和抑制炎癥反應(yīng),常用藥物為非甾體消炎藥、秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素等,藥物不良反應(yīng)大。杜鵑花科植物滇白珠的莖葉性熱、味辛辣,屬熱藥,入冷經(jīng),其根、梗具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕作用,可治療風(fēng)寒濕痹、筋骨疼痛[2]。滇白珠的化學(xué)成分類型主要有黃酮類、萜類、水楊酸甲酯糖苷類、木脂素類、香豆精類、有機(jī)酸類和甾體類,還含有香豆素、生物堿等[3],具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒作用。臨床常見含滇白珠的復(fù)方成藥有痛風(fēng)靈、滇白珠糖漿、復(fù)方伸筋膠囊等,多用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、跌打損傷和濕疹等方面的治療[4]。滇白珠是貴州苗族民間治療痛風(fēng)的常用藥材,有研究報(bào)道采用灌胃治療效果突出[5-6]。本研究采用大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射滇白珠醇提取液的新治療手段,觀察其治療作用并分析作用機(jī)制,為臨床用藥、開發(fā)新藥、擴(kuò)大新藥源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠50只,體質(zhì)量250～270 g,購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(黔) 2018-0001。滇白珠購自貴州省都勻市藥材市場(chǎng),經(jīng)黔南民族醫(yī)專藥學(xué)系鑒定為杜鵑花植物滇白珠。

1.2儀器與試劑 尿酸鈉結(jié)晶(Sigma公司,規(guī)格:5 g,批號(hào):102306692);大鼠白細(xì)胞介素(IL)-17、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):201904);酶標(biāo)儀(北京凱奧K6600A)。

1.3方法

1.3.1滇白珠醇提取液的提取 藥物提取采用醇提法,提取方法如下:稱取滇白珠粗粉74 g置于100 mL圓底燒瓶中加70%乙醇800 mL,水浴加熱1 h,減壓過濾,取濾渣置于原燒瓶?jī)?nèi)加70%乙醇700 mL,再次水浴加熱1 h后減壓過濾,合并兩次提取液,減壓濃縮到無醇味,分別取一定體積配制成濃度(相當(dāng)于原藥材)為4、2、1 g/mL儲(chǔ)備液備用。

1.3.2動(dòng)物分組 50只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,每組10只,分別設(shè)空白對(duì)照組、模型組及滇白珠醇提取液治療高劑量組(4 g/kg)、中劑量組(2 g/kg)、低劑量組(1g/kg)。

1.3.3模型的建立與實(shí)驗(yàn)干預(yù) 取 500 mg單鈉尿酸鹽晶體,加 2 mL 吐溫80,再加入無菌生理鹽水后用磁力攪拌器加熱攪拌,直至晶體完全溶解,定容至 20 mL,制成 25 mg/mL單鈉尿酸鹽晶體混懸液,高壓滅菌后,于4 ℃ 保存,用前搖勻。SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,參照文獻(xiàn)[7]造模方法,水合氯醛麻醉后以大鼠右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔為進(jìn)針點(diǎn),將踝關(guān)節(jié)擺放成直角,充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨的間隙,注射針頭與脛骨成45°夾角插入關(guān)節(jié)腔,模型組及滇白珠醇提取液各劑量組均注射0.2 mL 25 mg/mL單鈉尿酸鹽晶體混懸液制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。造模成功后,滇白珠醇提取液高、中、低劑量組分別給予4、2、1 g/kg滇白珠醇提取液0.2 mL關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射,模型組以同樣方法僅注射 0.2 mL無菌生理鹽水,均連續(xù)給藥 1周?？瞻捉M不予任何處理。

1.3.4指標(biāo)檢測(cè) 模型組造模第7 天,滇白珠醇提取液各劑量組末次給藥1 h 后,取各組大鼠股動(dòng)脈血,靜置,2 000 r/min離心15 min,取上清液,在-20 ℃ 下保存待測(cè)。采用ELISA檢測(cè)血清 IL-17、VEGF、IL-6水平。

病理檢查:剪取踝關(guān)節(jié)置10%甲醛液中固定脫鈣,梯度乙醇脫水,將透明處理后的組織塊放入已溶化石蠟內(nèi)浸蠟包埋、切片,干燥待染。將石蠟切片脫蠟、水洗后HE染色鏡檢。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜炎癥與程度及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等情況。炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]:無炎癥,計(jì)0分;輕度炎癥,可見少量白細(xì)胞浸潤(rùn),計(jì)1分;中度炎癥,可見2個(gè)或以上的白細(xì)胞聚集物,計(jì)2分;重度炎癥,出現(xiàn)白細(xì)胞融合及浸潤(rùn)顯著,計(jì)3分。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比較 與模型組相比,滇白珠醇提取液不同劑量組血清中IL-17、VEGF、IL-6水平均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),滇白珠醇提取液中、高劑量組血清IL-17、VEGF、IL-6水平均低于滇白珠醇提取液低劑量組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-17、VEGF水平與滇白珠醇提取液中劑量組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-6水平低于滇白珠醇提取液中劑量組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-17、VEGF、IL-6水平比較

2.2急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)病理檢查結(jié)果 病理檢查結(jié)果顯示:滇白珠醇提取液不同劑量組與模型組比較,局部血管內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞,上皮及皮下充血明顯。滇白珠醇提取液低劑量組纖維組織及滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液中劑量組較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn),色素沉著,滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液高劑量組肉芽組織增生,大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜未見增生,關(guān)節(jié)軟骨及骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,未見痛風(fēng)結(jié)節(jié)。見圖1。

注:A為空白對(duì)照組;B為模型組;C為滇白珠醇提取液低劑量組;D為滇白珠醇提取液中劑量組;E為滇白珠醇提取液高劑量組。圖1 踝關(guān)節(jié)組織病理檢查結(jié)果(HE染色,×200)

3 討 論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是臨床常見病,發(fā)作時(shí)嚴(yán)重影響患者的日常生活,如不積極治療極易致殘、致畸,影響關(guān)節(jié)功能。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制涉及多條與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路,即Toll樣因子受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)依賴性核因子-κB 信號(hào)通路、Nod 樣受體蛋白 3 炎性小體、脂聯(lián)素、三磷酸腺苷(ATP)-P2X7R 信號(hào)通路等,關(guān)節(jié)滑膜炎癥因子及其組成的滑膜免疫微環(huán)境在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中占有重要地位,它們可通過多個(gè)信號(hào)通路介導(dǎo)痛風(fēng)的發(fā)病[9]。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期多采用秋水仙堿、非甾體消炎藥進(jìn)行抗炎止痛對(duì)癥治療,但存在胃腸反應(yīng)及肝腎功能損害等不良反應(yīng)。中醫(yī)認(rèn)為“濁瘀”是痛風(fēng)的發(fā)病病機(jī),使用祛濕化濁或祛濕化瘀藥可緩解。我國(guó)天然物產(chǎn)資源豐富,作為安全、有效的天然抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎制劑的藥用植物研發(fā)必將取得突破性進(jìn)展,潛藏著巨大的開發(fā)價(jià)值。肖壯等[10]研究證實(shí)滇白珠具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗氧化及抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生與分泌的作用。天然藥物治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎給藥方式多數(shù)為口服,關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射是目前臨床用于骨、關(guān)節(jié)疾病治療的常用方法,可用于緩解關(guān)節(jié)腫痛、損傷[11-12]。采用不同劑量滇白珠醇提取液關(guān)節(jié)腔注射治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎,通過將藥物直接輸送到炎癥部位,改變藥物在體內(nèi)的分布模式,避開了藥物在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中必經(jīng)的生理屏障,以最小的劑量發(fā)揮最大的作用。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型中單鈉尿酸鹽晶體沉積在關(guān)節(jié)、滑膜引起炎癥應(yīng)激反應(yīng),核因子NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可調(diào)節(jié)大量活化的吞噬細(xì)胞、Th細(xì)胞亞群等炎癥細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有研究顯示血清 VEGF、IL-17、IL-6水平可以作為判斷急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同劑量滇白珠醇提取液對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及對(duì)血清IL-17、VEGF、IL-6水平的影響,結(jié)果顯示與模型組比較,滇白珠醇提取液不同劑量組血清中IL-17、VEGF、IL-6水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滇白珠醇提取液中、高劑量組血清IL-17、VEGF水平均低于滇白珠醇提取液低劑量組(P<0.05),而滇白珠醇提取液高劑量組血清IL-17、VEGF水平與滇白珠醇提取液中劑量組相比,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。滇白珠醇提取液低、中、高劑量組血清IL-6水平兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析其原因可能是因?yàn)榈岚字榇继崛∫宏P(guān)節(jié)腔內(nèi)注射后,下調(diào)血液中VEGF水平,VEGF作為直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原,其促進(jìn)新生血管的形成能力及血管的通透性顯著下降,血管內(nèi)物質(zhì)的滲出減少,同時(shí)Th17細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IL-17減少,抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與分泌。IL-6 是一種多功能炎癥細(xì)胞因子,不僅可以直接參與炎癥反應(yīng),同時(shí)也可以促進(jìn)其他炎癥因子的釋放,加強(qiáng)炎癥反應(yīng),在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中扮演重要角色。IL-6水平降低后,導(dǎo)滑膜炎癥反應(yīng)和軟骨破壞減輕,可能與在炎癥局部直接發(fā)揮抗炎作用有關(guān),炎癥的形成和發(fā)展受到抑制。病理結(jié)果也證實(shí),滇白珠醇提取液不同劑量組與模型組比較,局部血管內(nèi)有較多中性粒細(xì)胞,上皮及皮下充血明顯;滇白珠醇提取液低劑量組纖維組織及滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液中劑量組較多淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn),色素沉著,滑膜輕度增生;滇白珠醇提取液高劑量組肉芽組織增生,大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn),滑膜未見增生,關(guān)節(jié)軟骨及骨組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,未見痛風(fēng)結(jié)節(jié)。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射滇白珠醇提取液對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有治療效果,呈現(xiàn)劑量依賴,可能與下調(diào)血清IL-17、VGEF、IL-6等炎癥因子水平有關(guān),但確切的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。