黨引利,羅海霞,劉瑩瑩,劉曉鶯,樊海燕

陜西省榆林市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西榆林 719000

子宮內(nèi)膜癌(EC)又稱子宮體癌,其發(fā)病率位居?jì)D科惡性腫瘤首位,主要發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后的中老年婦女中,嚴(yán)重威脅女性身心健康和生命安全[1]。雖然大多數(shù)EC患者經(jīng)臨床合理治療后可獲得較好預(yù)后,但相較于其他惡性腫瘤逐漸下降的病死率,EC病死率卻呈現(xiàn)明顯增長趨勢[2]。尋找新的高效的治療靶點(diǎn)對(duì)于改善EC患者預(yù)后具有重要意義。微小核糖核酸(miRNA)是近年研究較多的,與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的非編碼內(nèi)源性RNA[3-4]。近年研究亦在EC病灶組織中發(fā)現(xiàn)了許多表達(dá)異常的miRNA[5-6]。miR-133b位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶,其低表達(dá)與食管鱗癌、直腸癌患者細(xì)胞增殖、侵襲、遷移有關(guān)[7-8],其高表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9],但關(guān)于其在EC中的表達(dá)及作用的分析報(bào)道較為少見。本研究旨在探討miR-133b在EC癌變組織中的表達(dá)及意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 以本院2020年1月至2022年6月在腫瘤病灶切除術(shù)中收集的EC癌變組織(EC組)、診斷性刮宮術(shù)中收集的子宮內(nèi)膜增生性病變組織(增生組)、進(jìn)行診斷性刮宮術(shù)或行子宮切除術(shù)的子宮異常出血者和子宮肌瘤者的正常子宮內(nèi)膜組織(對(duì)照組)各66例為研究對(duì)象。各組織來源者的納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)前未接受任何藥物治療;順利完成手術(shù)操作;獲得新鮮子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本,且保存良好;臨床資料完整。各組織來源者的排除標(biāo)準(zhǔn):合并凝血系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病;合并嚴(yán)重心、肝、腎、肺和腦血管疾病;合并其他部位腫瘤。EC組患者年齡39～70歲,平均(54.64±7.46)歲;增生組患者年齡36～71歲,平均(53.27±8.05)歲;對(duì)照組患者年齡36～69歲,平均(51.72±6.92)歲。3組患者年齡比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究均征得患者或陪同家屬同意,且簽訂知情同意書。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1miR-133b測定 (1)總RNA提取:取適量子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本,加液氮快速研成粉末,嚴(yán)格參照Trizol試劑盒說明書,加入總RNA抽提試劑,提取組織標(biāo)本中的總RNA;紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)提取的RNA純度,測定標(biāo)本吸光度(A)。當(dāng)A260/230和A260/280均在1.9～2.1時(shí),提示RNA純度達(dá)標(biāo)。1%瓊脂糖凝膠電泳分析提取的RNA,電泳樣帶5S rRAN、18S rRAN、28S rRAN清晰存在時(shí),證明提取的RNA完整性良好。(2)RNA檢測:嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成上述提取物的反轉(zhuǎn)錄cDNA標(biāo)本;以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板(3.0 μL),聯(lián)合miR-133b正向和反向引物各1.0 μL(正向引物:5′-CTT TGG TCC CCT TCA ACC A-3′,反向引物:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′),2×SYBR Green Ⅰ Master混合物12.5 μL,雙蒸水7.5 μL,選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),經(jīng)過95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,59.2 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,反復(fù)40個(gè)循環(huán),測定標(biāo)本中miR-133b水平,記錄反應(yīng)標(biāo)本的Ct值,用2-ΔΔCt計(jì)算組織標(biāo)本中miR-133b表達(dá)水平。

1.2.2腫瘤標(biāo)志物檢測 分析天平精確稱取EC組子宮內(nèi)膜組織1 000 mg,加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)入2 mL RIPA裂解液勻漿,17 000 r/min離心10 min,分離上清液保存待用。采用化學(xué)發(fā)光法測定組織上清液中腫瘤標(biāo)志物人附睪蛋白4(HE4)、糖類抗原125(CA125)表達(dá)水平。結(jié)果判斷:HE4>140 pmol/L為陽性,HE4≤140 pmol/L為陰性;CA125>35 U/mL為陽性,CA125≤35 U/mL為陰性。

1.2.3雌激素受體(ER)檢測 獲取EC子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本,4%甲醛溶液固定,經(jīng)石蠟包埋、切片、免疫組化染色后,顯微鏡下觀察組織切片,細(xì)胞核或細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒,判定為陽性細(xì)胞。依據(jù)陽性細(xì)胞占比進(jìn)行切片中ER陽性表達(dá)判定,陽性細(xì)胞占比>5%判定為ER陽性表達(dá)[10]。

2 結(jié) 果

2.13組子宮內(nèi)膜組織中miR-133b表達(dá)水平比較 EC組患者子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平為0.65(0.46,1.09),增生組為1.32(0.93,1.72),對(duì)照組為1.84(1.45,2.31),3組子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=80.513,P<0.05),且EC組低于增生組和對(duì)照組(Z=5.787、8.199,P<0.05),增生組低于對(duì)照組(Z=4.624,P<0.05)。

2.2不同臨床病理特征EC患者子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平比較 不同年齡、病理分型、細(xì)胞分化程度、肌層浸潤深度、ER表達(dá)的EC患者子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4陽性、CA125陽性的EC患者子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平均低于FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4陰性、CA125陰性的患者(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征的EC患者子宮內(nèi)膜組織中miR-133b表達(dá)水平比較

2.3EC組患者子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4表達(dá)、CA125表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示,EC組患者子宮內(nèi)膜組織中miR-133b表達(dá)水平與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4表達(dá)、CA125表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.445、-0.405、-0.445、-0.534,P<0.001)。

2.4miR-133b對(duì)EC、EC病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能 ROC曲線分析顯示:以增生組為對(duì)照,miR-133b診斷EC的曲線下面積(AUC)為0.802(95%CI:0.726～0.877);以FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期為對(duì)照,miR-133b診斷FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期的AUC為0.765(95%CI:0.650～0.880);以無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為對(duì)照,miR-133b診斷EC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的AUC為0.826(95%CI:0.756～0.895)。見圖1和表2。

注:A為miR-133b診斷EC的ROC曲線;B為miR-133b診斷EC病理分期的ROC曲線;C為miR-133b診斷EC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線。圖1 子宮內(nèi)膜組織中miR-133b診斷EC、EC病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表2 miR-133b對(duì)EC、EC病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷效能

3 討 論

EC是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一,且近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)出一定上升趨勢。有研究指出,EC患者的預(yù)后與疾病早期診斷及病情進(jìn)展情況密切相關(guān),當(dāng)病灶僅局限于內(nèi)膜組織時(shí),其5年生存率可高達(dá)91%,但當(dāng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí),5年生存率可降至17%以下[11]。故做好EC診斷及病情進(jìn)展?fàn)顩r的準(zhǔn)確判斷對(duì)患者預(yù)后的評(píng)估至關(guān)重要。

目前已存在的診斷性刮宮技術(shù)、盆腔鏡技術(shù)及磁共振技術(shù)等雖然在EC診斷中有一定的靈敏度和特異度,但仍存在一定局限性[12]。miRNA是一類長度約為22～25個(gè)核苷酸的單鏈RNA,被越來越多研究證實(shí)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[13]。miR-133b被證明是細(xì)胞代謝中的關(guān)鍵分子,可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)體代謝[14]。CHENG等[15]研究發(fā)現(xiàn),miR-133b屬于海綿腫瘤中的抑制基因;LI等[16]在卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn),卵巢癌患者卵巢組織及血液中miR-133b水平均顯著低于正常卵巢組織,miR-133b可通過抑制Warburg效應(yīng)而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,并提出這一發(fā)現(xiàn)可能會(huì)改善卵巢癌的診斷及治療方法。 LIAO等[17]在EC研究中發(fā)現(xiàn),miR-133b在EC組織中低表達(dá),且在腫瘤高病理分期和絕經(jīng)患者中表達(dá)水平較低,在EC患者體內(nèi)miR-133b可通過下調(diào)SUMO1抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲作用。本研究得到與LIAO等[17]相似的結(jié)果,EC組子宮內(nèi)膜組織miR-133b表達(dá)水平顯著低于增生組和對(duì)照組,且其在FIGOⅢ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4陽性、CA125陽性患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平均顯著低于FIGOⅠ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HE4陰性、CA125陰性的患者(P<0.05),證實(shí)在EC患者體內(nèi)miR-133b呈低表達(dá)狀態(tài),且病情越嚴(yán)重其表達(dá)水平越低。HE4和CA125是臨床常用的腫瘤標(biāo)志物,對(duì)EC診斷均具有較高價(jià)值[18]。本研究相關(guān)分析顯示,EC組患者子宮內(nèi)膜組織中miR-133b表達(dá)水平與HE4和CA125表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),提示miR-133b可用于EC診斷及病情判斷。進(jìn)一步ROC曲線分析顯示,miR-133b對(duì)EC、EC FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均具有一定診斷價(jià)值,AUC分別為0.802、0.765和0.826,但單獨(dú)用于病理分期發(fā)展診斷的特異度較低,若與其他腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測,有可能會(huì)提高其臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,miR-133b在EC中呈低表達(dá),在EC發(fā)生和病情發(fā)展方面均具有一定診斷價(jià)值。但受時(shí)間和其他條件限制,本研究仍存在諸多不足有待后續(xù)進(jìn)一步證實(shí)。諸如,miR-133b均低表達(dá)于卵巢癌病灶組織和血清中,該現(xiàn)象是否同樣存在于EC中?臨床是否可通過監(jiān)測血清miR-133b進(jìn)行EC早期判斷?此外,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9在EC轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用[19],而以往在諸多惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)miR-133b通過調(diào)節(jié)MMP-9代謝,抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9],該機(jī)制是否同樣存在EC中?有待進(jìn)一步研究分析。