任虎虎,李 晨,陳 建,吳智群

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院介入科,陜西西安 710032

原發(fā)性肝癌是一種起源于肝臟組織的惡性腫瘤,75%～85%為肝細胞癌(HCC)[1]。據(jù)2014年數(shù)據(jù)統(tǒng)計,肝癌分別位居我國惡性腫瘤發(fā)病譜、死亡譜的第4位、第2位[2]。肝癌早期癥狀不典型,不易被發(fā)現(xiàn),確診時常伴隨腫瘤轉(zhuǎn)移及相關(guān)并發(fā)癥,預(yù)后總體較差[3]。因此,對肝癌的研究受到臨床高度重視,尋找肝癌相關(guān)分子標志物,對于肝癌的病因診斷、治療指導(dǎo)、預(yù)后評估有重要意義。肝癌形成機制復(fù)雜,除了與病毒性肝炎、飲酒、黃曲霉毒素等因素相關(guān)外,還涉及分子學(xué)機制[4]。長鏈非編碼核糖核酸(lncRNA)是一類定位于細胞核或細胞質(zhì)中且長度大于200個核苷酸的RNA分子,可參與基因表觀遺傳學(xué)表達調(diào)控,并在惡性腫瘤形成及進展過程中發(fā)揮重要作用[5]。lncRNA LINC00673為新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子,定位于17q24.3上,在惡性腫瘤中呈異常表達[6]。但lncRNA LINC00673在肝癌中的確切表達情況少見報道,該分子能否作為血清標志物應(yīng)用于HCC的臨床診治尚不明確?；谏鲜霰尘?本研究擬觀察HCC患者血清lncRNA LINC00673水平變化情況及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,以明確其臨床意義,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年1月空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院收治并確診的103例HCC患者為HCC組。HCC組中男86例,女17例;<60歲72例,≥60歲31例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期73例,Ⅲ～Ⅳ期30例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例;血管侵犯54例;肝硬化83例;微癌栓15例;腫瘤分化程度:中高分化80例,低分化23例;腫瘤最大徑<3 cm 25例,≥3 cm 78例;血清甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 62例,≥400 μg/L 41例。納入標準:(1)符合《肝細胞癌臨床指南更新》中的相關(guān)診斷標準,經(jīng)病理檢查確診[7];(2)術(shù)前未進行射頻消融、肝動脈栓塞化療、免疫治療等醫(yī)學(xué)干預(yù);(3)無凝血功能障礙;(4)無精神系統(tǒng)疾病。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)臨床資料不完整;(3)不配合研究要求;(4)認知功能不正?；驘o法正常溝通;(5)生命終末期;(6)妊娠期或哺乳期女性。另選擇同期體檢健康志愿者103例為對照組,其中男84例、女19例,<60歲69例、≥60歲34例。HCC組和對照組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清lncRNA LINC00673水平檢測 收集受試者外周靜脈血5 mL,室溫環(huán)境下靜置60 min,在4 ℃下以1 000 r/min離心10 min,收集上層血清并轉(zhuǎn)至收集管后,再在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min,離心操作結(jié)束后于-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。采用TRIzolTMLS試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)提取受試者血清中的總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)合成cDNA,cDNA模板按5倍稀釋后置于-20 ℃冰箱內(nèi)凍存。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進行基因擴增,反應(yīng)條件:95 ℃下30 s預(yù)變性,95 ℃下10 s變性,60 ℃下30 s退火延伸,循環(huán)40次。lncRNA LINC00673上、下游引物分別為5′-TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3′與5′-GCACAGCTTGGAGGCTTGA-3′;內(nèi)參GAPDH上、下游引物分別為5′-CTATGCAGCTCTTCTATGTGG-3′與5′-ATCCAACTGTGAATCAGCC-3′。lncRNA LINC 00673水平以2-ΔΔCt計算。

1.2.2隨訪情況 對103例患者進行5年門診復(fù)查隨訪,2022年1月截止,統(tǒng)計患者總生存情況。第1年每3個月隨訪1次,從第2年開始每6個月隨訪1次,檢查項目包括超聲、電子計算機斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)等。

2 結(jié) 果

2.1HCC組和對照組血清lncRNA LINC00673水平分析 RT-PCR結(jié)果顯示,lncRNA LINC00673在HCC組血清中的水平(4.37±1.06)明顯高于對照組(1.29±0.31),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.303,P<0.001)。

2.2血清lncRNA LINC00673診斷HCC的ROC曲線分析 血清lncRNA LINC00673診斷HCC的曲線下面積(AUC)為0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截斷值為2.87時,靈敏度為75.70%,特異度為81.61%,準確度為78.70%。見圖1。

圖1 血清lncRNA LINC00673診斷HCC的ROC曲線

2.3不同臨床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表達情況比較 以ROC曲線最佳截斷值2.87為分界點,將103例HCC患者分為lncRNA LINC00673低表達組(血清lncRNA LINC00673水平<2.87,41例)與lncRNA LINC00673高表達組(血清lncRNA LINC00673水平≥2.87,62例)。lncRNA LINC00673高表達患者血清AFP水平≥400 μg/L、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的比例明顯高于lncRNA LINC00673低表達患者(P<0.05),而lncRNA LINC00673高表達患者和lncRNA LINC00673低表達患者在性別、年齡、肝硬化、腫瘤分化程度、微癌栓情況方面比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征HCC患者血清lncRNA LINC00673表達情況比較[n(%)]

2.4不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線分析 103例HCC患者在隨訪5年間,失訪6例,獲得隨訪97例,其中生存53例,死亡44例,總生存率為54.64%。血清lncRNA LINC00673高表達組與lncRNA LINC00673低表達組5年總生存率分別為44.83%(26/58)、69.23%(27/39)。Kaplan-Meier生存曲線顯示,血清lncRNA LINC00673高表達患者5年生存率顯著低于lncRNA LINC00673低表達患者(Log-Rankχ2=6.007,P=0.014)。見圖2。

圖2 不同血清lncRNA LINC00673水平HCC患者的Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展,手術(shù)切除、射頻消融、肝動脈化療栓塞、放射性療法、分子靶向藥物等手段應(yīng)用于肝癌治療,患者預(yù)后情況得到較大改善,但高復(fù)發(fā)與高轉(zhuǎn)移仍制約著患者的長期生存。有報道稱,肝癌患者根治性切除術(shù)后5年累積復(fù)發(fā)率可達70%,且復(fù)發(fā)腫瘤的侵襲性相較于原發(fā)腫瘤更高[8]。肝癌發(fā)病率較高,預(yù)后較差,對人類健康造成嚴重威脅。故尋找在肝癌早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷中具有潛在應(yīng)用價值的分子標志物十分必要。

lncRNA是一種無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子,能夠參與基因組印記、X染色體沉默、轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)修飾、核內(nèi)運輸?shù)榷鄠€生命過程,還可參與調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡[9]。多項研究提示,在肝癌發(fā)病過程中,lncRNA起促進作用[10-11]。lncRNA LINC00673為lncRNA家族中的一種,在不同癌組織中存在高或低表達,在惡性腫瘤診斷或預(yù)后評估方面具有潛在優(yōu)勢[12]。本研究顯示,lncRNA LINC00673在HCC組血清中的水平明顯高于對照組,提示lncRNA LINC00673在HCC中呈高表達,該分子可能參與了HCC發(fā)生。以往研究也提示惡性腫瘤的形成可能與lncRNA LINC00673有關(guān),如李濤等[13]和高勇等[14]檢測結(jié)腸癌和胃癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00673的水平,并與其對應(yīng)的癌旁正常組織作對照研究,發(fā)現(xiàn)癌灶組織內(nèi)lncRNA LINC00673水平明顯更高。本研究顯示血清lncRNA LINC00673診斷HCC的AUC為0.783(95%CI:0.718～0.849),最佳截斷值為2.87時,靈敏度為75.70%,特異度為81.61%,準確度為78.70%,提示血清lncRNA LINC00673對于HCC有一定的診斷價值,有望作為HCC的輔助診斷指標。此外,本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00673高表達患者血清AFP水平≥400 μg/L、腫瘤最大徑≥3 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有血管侵犯、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的比例明顯高于lncRNA LINC00673低表達患者(P<0.05),提示血清lncRNA LINC00673與HCC臨床病理特征關(guān)聯(lián)密切,該分子可能參與了HCC遷移、侵襲等癌細胞進展。郭紅艷等[15]報道,lncRNA LINC00673高表達能促進磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑關(guān)鍵分子表達,上調(diào)腫瘤相關(guān)因子zeste基因增強子同源物2(EZH2)和β-catenin水平,繼而促進胃癌MGC-803細胞增殖和克隆。ZHANG等[16]研究提示,lncRNA LINC00673沉默對抑制肝癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖、侵襲有積極作用。本研究103例HCC患者隨訪5年間,失訪6例,Kaplan-Meier生存曲線顯示血清lncRNA LINC00673高表達患者5年生存率顯著低于lncRNA LINC00673低表達患者,提示血清lncRNA LINC00673高表達與HCC不良預(yù)后有關(guān)。ZHANG等[17]和張依等[18]的研究與此相符。ZHANG等[17]發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC00673高表達與胰腺癌患者存活率下降有關(guān),可作為該腫瘤預(yù)后的標志物。張依等[18]提到,lncRNA LINC00673水平上升與肺癌預(yù)后不良相關(guān)。進一步分析可能原因為lncRNA LINC00673通過與組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)和果蠅EZH2相互作用,進而促進HCC的發(fā)生和發(fā)展,導(dǎo)致其預(yù)后不良[19]。

綜上所述,HCC患者血清lncRNA LINC00673水平升高,其水平與患者腫瘤最大徑、TNM分期、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血清AFP水平有關(guān),可導(dǎo)致預(yù)后不良,有望成為HCC診療相關(guān)的血清標志物。但其具體機制不明,有待細胞學(xué)實驗或動物模型實驗進一步驗證。