王 旺,熊康平,錢開宇,2,王行環(huán)

(1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科,湖北武漢 430071;2.湖北省人類遺傳資源保藏中心,湖北武漢 430071)

膀胱癌當(dāng)前是泌尿系統(tǒng)最常見的癌癥,復(fù)發(fā)率和死亡率都很高[1]。非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle-invasive bladder cancer,NMIBC)是膀胱癌中最常見的類型,約占膀胱癌患者的75%。NMIBC具有復(fù)發(fā)頻繁、疾病進展風(fēng)險高的特點,5年復(fù)發(fā)率為50%～70%,5年進展率為10%～30%。經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)聯(lián)合膀胱內(nèi)化療或膀胱內(nèi)免疫治療是NMIBC的推薦治療方法。但是仍然有40%～50%的NMIBC患者最終會進展為肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC)[2],新輔助化療聯(lián)合根治性膀胱切除術(shù)是MIBC的推薦治療方法。新輔助化療是能夠顯著改善膀胱癌患者預(yù)后和生存質(zhì)量的必要手段[3]。近年來人們提出了一些新的治療方案,如使用順鉑、吉西他濱等,但是這些藥物毒副作用較大,可引起諸如中性粒細(xì)胞和血小板減少等不良反應(yīng),且患者的5年生存率并沒有得到顯著改善[4]。因此,繼續(xù)探索并發(fā)現(xiàn)新的有效的化療藥物很有必要。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在基因轉(zhuǎn)錄和表達過程中發(fā)揮著重要作用,能夠使組蛋白發(fā)生乙?；M而調(diào)控轉(zhuǎn)錄,維持細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄修飾及蛋白表達的平衡[5]。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT7(histone acetyltransferase KAT7,KAT7)已經(jīng)被鑒定為膀胱癌的癌基因[6]。WM-3835是一種新的KAT7特異性抑制劑,能夠有效抑制骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌和去勢抵抗性前列腺癌等癌癥的增殖和遷移,并促進細(xì)胞凋亡[7-9]。然而,WM-3835對人膀胱癌的效果尚不明確。本研究采用不同濃度WM-3835處理膀胱癌細(xì)胞,初步發(fā)現(xiàn)WM-3835通過抑制組蛋白乙?；{(diào)控轉(zhuǎn)錄的方式影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移,旨在為臨床轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)膀胱癌細(xì)胞系UM-UC-3、T24來自中國科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏委會細(xì)胞庫。UM-UC-3采用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng),T24采用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。WM-3835購自中國selleck生物有限公司(貨號:S9805)。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco生物有限公司。β-actin(稀釋比例1∶200)、cyclin-D1(稀釋比列1∶1 000)、PCNA(稀釋比列1∶1 000)、MMP9(稀釋比列1∶1 000)、N-cadherin(稀釋比列1∶500)抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。細(xì)胞周期染色試劑盒購自武漢沃萊邦德貿(mào)易有限公司。

1.2 噻唑藍(MTT)實驗細(xì)胞消化重懸,以3×103個/孔接種于96孔板。24 h后棄去原有培養(yǎng)基,向每孔中加入200 μL含WM-3835(0、10、20、30、40 μmol/L)的完全培養(yǎng)基。給藥48 h后,添加20 μL MTT(5 mg/mL),37 ℃避光孵育4 h。小心吸去上清液,添加150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解沉淀,使用酶標(biāo)儀(SpectraMax,USA)檢測570 nm波長處吸光度值。設(shè)定0 μmol/L的WM-3835處理下各細(xì)胞系吸光度值為100%細(xì)胞活力,10、20、30、40 μmol/L的WM-3835處理后各細(xì)胞系的細(xì)胞活力/%=各濃度的吸光度值/0 μmol/L的吸光度值×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)用不同濃度WM-3835(0、10、20 μmol/L)處理UM-UC-3和T24細(xì)胞24 h。消化并收集細(xì)胞沉淀,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)清洗細(xì)胞沉淀3次,依次加入500 μL緩沖液、破膜劑和PI染液。室溫下避光孵育30 min后,用流式細(xì)胞儀(Beckman,USA)檢測細(xì)胞周期分布比例,統(tǒng)計分析不同藥物濃度下細(xì)胞G0/G1期分布比例。

1.4 細(xì)胞劃痕實驗將膀胱癌細(xì)胞系UM-UC-3和T24細(xì)胞按2×105個/孔的密度接種于六孔板內(nèi),細(xì)胞匯合度>95%時,使用200 μL移液槍頭輕劃細(xì)胞表面。PBS洗凈懸浮細(xì)胞,加入1% FBS培養(yǎng)基(含WM-3835 0、10、20 μmol/L),在劃痕后0 h和24 h分別觀察細(xì)胞遷移距離并拍照記錄。設(shè)定0 μmol/L WM-3835處理下各細(xì)胞系遷移率為100%,10、20 μmol/L的WM-3835處理后各細(xì)胞系的遷移率/%=各濃度遷移距離/0 μmol/L的遷移距離× 100%。

1.5 Transwell實驗消化并收集細(xì)胞沉淀,用含WM-3835的無血清培養(yǎng)基重懸UM-UC-3細(xì)胞和T24細(xì)胞。實驗使用孔徑為8 μm Transwell小室(Corning,USA)。在上室中加入100 μL 細(xì)胞懸液,下室加入600 μL完全培養(yǎng)基,UM-UC-3細(xì)胞密度為3.5×105個/mL,T24細(xì)胞密度為4.0 × 105個/mL。培養(yǎng)箱孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染色10 min,自來水洗去多余結(jié)晶紫。用棉簽擦去上室未遷過去的細(xì)胞,熒光顯微鏡(Leica,German)觀察細(xì)胞并拍照,通過計算細(xì)胞遷移數(shù)目比較細(xì)胞遷移能力。

1.6 實時熒光定量PCR分析使用RNeasy Mini Kit(貨號:#74101,Qiagen,德國)分離膀胱癌細(xì)胞總RNA。使用ReverTrace qRT-PCR Kit (Toyobo,中國)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)體系為:0.5 μL引物、1 μL cDNA、 3.5 μL 無RNA酶水和5 μL 2×SYBR Green mix (Biolight,中國)。引物序列如下,β-actin-F:GATCCACATCTGCTGGAAG;β-actin-R:CAGCACAATGAAGATCAAGA;cyclin-D1-F:CAATGACC CCGCACGATTTC;cyclin-D1-R:CATGGAGGGCGGATTGGAA;PCNA-F:CCTG

CTGGGATATTAGCTCCA;PCNA-R:

CAGCGGT

AGGTGTCGAAGC;MMP9-F:

TCTTCCCTGGAG

ACCTGAGA;MMP9-R:GAGTGTAACCATAGCG

GTACAGG;N-cadherin-F:

TGCGCGTGAAGGTT

TGCCAGT;N-cadherin-R:TGGCGTTCTTTATCC

CGGCGT。以β-actin為內(nèi)參,以0 μmol/L WM-3835處理下轉(zhuǎn)錄水平為基準(zhǔn)(100%),計算并比較不同濃度WM-3835處理后基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.7 免疫印跡實驗膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3經(jīng)不同濃度WM-3835孵育24 h,消化后離心收集細(xì)胞,放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液(添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)于冰上裂解細(xì)胞,離心取上清,二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法檢測蛋白濃度并調(diào)整至同一濃度,加入5×SDS loading buffer混勻,95 ℃加熱10 min。選擇10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜(Millipore,USA),轉(zhuǎn)膜時恒定電流為275 mA,時間為60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%奶粉封閉,選擇相應(yīng)一抗4 ℃孵育至少8 h,二抗室溫孵育1 h。蛋白質(zhì)條帶使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示(Bio-Rad,USA),由分子成像儀CheiDocXRS顯影記錄。使用Image J 軟件計算蛋白灰度值。以β-actin為內(nèi)參,以0 μmol/L WM-3835處理下蛋白表達水平為基準(zhǔn)(100%),計算并比較不同濃度WM-3835處理后蛋白表達水平的變化。

2 結(jié) 果

2.1 WM-3835抑制膀胱癌細(xì)胞增殖用不同濃度的WM-3835(0、10、20、30、40 μmol/L)處理膀胱癌細(xì)胞48 h,發(fā)現(xiàn)WM-3835能夠顯著抑制UM-UC-3細(xì)胞和T24細(xì)胞增殖,且呈現(xiàn)濃度依賴性。此外,WM-3835表現(xiàn)出對膀胱腫瘤細(xì)胞更強的抑制效果,20 μmol/L WM-3835對正常尿路上皮細(xì)胞的抑制效果較小(圖1)。后繼實驗選擇0 μmol/L WM-3835為空白對照組,10 μmol/L為低濃度組,20 μmol/L為高濃度組。

圖1 不同濃度WM-3835對膀胱癌細(xì)胞增殖的抑制情況

2.2 WM-3835影響膀胱癌細(xì)胞周期分布WM-3835處理膀胱癌細(xì)胞24 h后,通過細(xì)胞流式儀檢測UM-UC-3和T24的細(xì)胞周期分布變化,發(fā)現(xiàn)給藥后,低濃度組和高濃度組都誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(圖2)。

2.3 WM-3835抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移在用WM-3835處理UM-UC-3和T24細(xì)胞系24 h后,通過劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835對膀胱癌細(xì)胞遷移能力的影響。發(fā)現(xiàn)WM-3835能夠顯著的抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移能力,且高濃度組的效果比低濃度組更有效(圖3)。采用Transwell實驗方法檢測了WM-3835對膀胱癌細(xì)胞遷移的影響,遷移結(jié)果與劃痕實驗結(jié)果一致(圖4)。

A:劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細(xì)胞遷移情況的顯微鏡下觀;B:不同濃度WM-3835對UM-UC-3細(xì)胞遷移距離的影響;C:劃痕實驗檢測不同濃度WM-3835下T24細(xì)胞遷移情況的顯微鏡下觀;D:不同濃度WM-3835對T24細(xì)胞遷移距離的影響;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

A:Transwell實驗檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細(xì)胞遷移情況的顯微鏡下觀;B:不同濃度WM-3835對UM-UC-3細(xì)胞遷移個數(shù)的影響;C:Transwell實驗檢測不同濃度WM-3835下T24細(xì)胞遷移情況的顯微鏡下觀;D:不同濃度WM-3835對T24細(xì)胞遷移個數(shù)的影響;**P<0.01,***P<0.001。

2.4 WM-3835抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達用不同濃度WM-3835處理UM-UC-3細(xì)胞系24 h后,通過實時熒光定量PCR分析和免疫印跡實驗檢測細(xì)胞增殖標(biāo)志物cyclin-D1和PCNA以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物N-cadherin和MMP9的基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量。免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)上述標(biāo)志物在WM-3835處理后蛋白表達水平均顯著降低(圖5A、B),實時熒光定量PCR分析顯示以上標(biāo)志物的基因轉(zhuǎn)錄水平也出現(xiàn)了下調(diào)(圖5C),且蛋白及轉(zhuǎn)錄水平都隨給藥濃度的升高而降低。

A:免疫印跡法檢測不同濃度WM-3835下UM-UC-3細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)志物蛋白表達的電泳條帶;B:不同濃度WM-3835下UM-UC-3細(xì)胞增殖和遷移標(biāo)志物蛋白表達的定量分析;C:不同濃度WM-3835下UM-UC-3細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平;**P<0.01,***P<0.001。

3 討 論

膀胱癌是全球最常見的泌尿系統(tǒng)癌癥,復(fù)發(fā)率和死亡率都很高[3]。迄今為止,使用化療藥物進行局部或全身化療仍然是輔助手術(shù)治療膀胱癌的最佳治療和干預(yù)措施。鑒于膀胱切除術(shù)后的高遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)和局部區(qū)域復(fù)發(fā)的發(fā)生率較高,需要積極進行局部和全身治療[2-3]。圍手術(shù)期化療(無論是新輔助化療還是輔助化療)已被用于提高患者生活質(zhì)量和預(yù)后生存。而目前臨床上常用的化療藥物,如吉西他濱、吡柔比星、順鉑等,都具有一系列不同程度的副作用[10-12]。本實驗室前期也檢測了一系列用于膀胱癌輔助化療的新藥,例如依澤麥布和香菇多糖能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進展來抑制膀胱癌的增殖和遷移[13-14]。

作為腫瘤發(fā)生的基礎(chǔ),癌基因的突變和上調(diào)在腫瘤檢測中經(jīng)常被觀察到。此外,越來越多的證據(jù)表明,癌基因的異常激活常?？蓺w因于轉(zhuǎn)錄異常激活和翻譯后修飾,例如乙?；揎梉15]。組蛋白乙?；窴AT5可以通過使組蛋白H2A乙?；瘉碚{(diào)控Hoxa9基因表達,進而影響急性髓系白血病的進展[16]。在胃癌中,組蛋白乙?；窧RD4的高表達促進了胃癌的進展和轉(zhuǎn)移,其機制為BRD4以乙?；蕾囆苑绞阶R別轉(zhuǎn)錄因子slug上的乙酰化賴氨酸,防止其被E3泛素連接酶識別,從而抑制slug的多泛素化和蛋白酶體降解[17]。這些結(jié)果清楚地表明乙酰化是調(diào)節(jié)癌基因轉(zhuǎn)錄和修飾的一種重要手段。因此,特異性靶向調(diào)控癌基因乙酰化激活的小分子抑制劑可能提供抑制癌蛋白活性的新途徑,從而延緩腫瘤發(fā)生。KAT7通過催化多個賴氨酸殘基的H4和H3組蛋白乙酰化對染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進行重構(gòu),從而促進轉(zhuǎn)錄,它對基因轉(zhuǎn)錄和表達、細(xì)胞自我更新、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和發(fā)育具有重要意義[18]。WM-3835是KAT7的特異性抑制劑,在其他癌癥中的作用已經(jīng)有了大量的研究報道。例如,WM-3835可有效抑制非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞生長,5 μmol/L的WM-3835即可顯著抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖活力[7]。在體內(nèi)和體外實驗中驗證了WM-3835對骨肉瘤的抑制作用,它能夠激活骨肉瘤細(xì)胞凋亡,有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移[8]。然而,WM-3835在膀胱癌中的作用效果目前尚未見報道,所以我們對此進行了研究。

本研究采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡等實驗揭示了WM-3835可抑制膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3和T24增殖和遷移。經(jīng)WM-3835處理后,UM-UC-3和T24細(xì)胞的增殖能力得到了顯著抑制,在同一濃度下,WM-3835對正常尿路上皮細(xì)胞的殺傷效果很弱。膀胱癌細(xì)胞的周期分布出現(xiàn)了G0/G1期阻滯,這可能是WM-3835抑制細(xì)胞增殖的原因,而且遷移能力也得到了顯著地抑制(P<0.05)。采用不同濃度WM-3835處理膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3可有效抑制周期蛋白cyclin-D1和增殖標(biāo)志物蛋白PCNA的表達,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志物MMP9和N-cadherin的蛋白表達也下調(diào),這可能是通過調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明,WM-3835可能是通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞周期阻滯和抑制膀胱癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移。WM-3835的體內(nèi)抗腫瘤研究及生物安全性評價有待后續(xù)進一步研究。

綜上所述,WM-3835可以抑制膀胱癌腫瘤的增殖和遷移,具有顯著的體外抗腫瘤活性,體內(nèi)抗腫瘤效果也在其他癌癥中得到驗證。WM-3835具有成為膀胱癌術(shù)前新輔助化療及術(shù)后化療用藥的潛力。