彭輝,潘百玲,李忍,鄧景致,李志江,2
(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心)
魯氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)可以在高鹽高糖或偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng),在傳統(tǒng)發(fā)酵食品增香中具有重要增香作用,是醬油和豆醬等釀造時(shí)主要的發(fā)酵劑和增香菌株[1]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF)是一種類似菠蘿風(fēng)味的香料,首次在菠蘿中分離得到,在食品和煙草行業(yè)中具有較高的商業(yè)價(jià)值[2]。
天然HDMF 主要利用微生物合成法生產(chǎn),Z.rouxii是被報(bào)道用于微生物合成HDMF 常見的菌種[3]。果糖-1,6-二磷酸(Fructose-1,6-bisphosphate,F(xiàn)BP)是魯氏酵母菌代謝產(chǎn)生HDMF 的重要前體物質(zhì)[4],經(jīng)2,3-烯醇化和脫磷酸作用后,形成的1-脫氧-2,3-鄰?fù)?6-磷酸-己糖經(jīng)去磷酸和NAD(P)H-醌氧化還原酶1 〔NAD (P)H:quinone oxidoreductase,NQO1〕作用,得到中間產(chǎn)物4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone,HMMF)。烯醇式HMMF 經(jīng)線粒體內(nèi)醌氧化還原酶(Quinone oxidoreductase,QOR)作用,在酵母體內(nèi)獨(dú)立的被轉(zhuǎn)化為HDMF[5]。因此,QOR 是酵母菌利用FBP 代謝合成HDMF 重要催化酶。
酚類物質(zhì)在有氧條件下易被氧化成醌類化合物。醌類物質(zhì)自發(fā)失去電子變成半醌,在QOR 催化下將半醌還原為對(duì)苯二酚,對(duì)苯二酚在有氧條件下被再氧化成半醌中間體,形成QOR 催化還原反應(yīng)的底物[6]。對(duì)苯二酚和1,4-萘醌是QOR 催化的底物,QOR 催化鄰位醌和1,4-萘醌的效率最高[7],但在魯氏酵母菌中鮮有利用外源酚和醌類物質(zhì)底物提供魯氏酵母菌代謝合成HDMF 報(bào)道。因此,研究利用魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌為菌株,在反應(yīng)體系中添加對(duì)苯二酚和1,4-萘醌,為QOR 提供外源底物使魯氏酵母菌代謝合成HDMF。旨在提高魯氏酵母菌代謝合成HDMF 提供數(shù)據(jù)支撐,為推進(jìn)HDMF 的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株及培養(yǎng)基
魯氏酵母菌中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌種保藏編號(hào)為No.32899);魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏;YPD 液體培養(yǎng)基(20 g·L-1蛋白胨,20 g·L-1葡萄糖,10 g·L-1酵母提取物)青島海博生物技術(shù)有限公司。
1.1.2 試劑與儀器
HDMF 標(biāo)品美國Sigma 公司;甲醇、乙腈和甲酸為色譜級(jí)山東浩中化工科技有限公司;對(duì)苯二酚(99%)和1,4-萘醌(98%)均為分析純上海麥克林生化科技有限公司;乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純青島市捷盛化工物資有限公司;次甲基藍(lán)上海正劑化工科技有限公司;TRIzol 美國Invitrogen 公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本東洋紡公司。
LDZM 立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2G 超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司;HZQ-QX 臺(tái)式高速離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司;YKSD-1000 倒置顯微鏡上海永科光學(xué)儀器有限公司;CFX96TM 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器美國Bio-Rad 公司。
1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)
參考周亞男等[8]方法并稍作改動(dòng)。取凍存的魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌菌株干粉,無菌條件下接入100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中,在全溫振蕩器中28 ℃、180 rpm 條件下培養(yǎng)3 d,測(cè)定細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2.5~3.0×108CFU·mL-1備用。
1.2.2 對(duì)苯二酚和1,4-萘醌濃度與作用時(shí)間對(duì)魯氏酵母菌合成HDMF 的影響
配置1、10、50 和100 μg·mL-1的對(duì)苯二酚,分別利用有機(jī)過濾膜過濾后加入到滅菌的YPD 液體培養(yǎng)基中,再將活化的魯氏酵母原菌和工程菌按5%比例接種到不同濃度對(duì)苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基中,以不加對(duì)苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基作為對(duì)照,在28 ℃和180 rpm 進(jìn)行培養(yǎng),以HDMF 產(chǎn)量為指標(biāo)篩選對(duì)苯二酚最優(yōu)濃度。配置1、10、50 和100 mg·L-1的1,2-萘醌,按上述條件進(jìn)行1,2-萘醌濃度的篩選。在滅菌的液體培養(yǎng)基中加入篩選的對(duì)苯二酚和1,4-萘醌濃度,將活化至相同菌數(shù)的魯氏酵母原菌和工程菌按5%分別接種到培養(yǎng)基中,于28 ℃和1 80 rpm 條件下,分別培養(yǎng)0~7 d。用移液槍精確量取菌液2 mL,8 000 rpm,離心10 min,取上清液過0.22 μm 濾膜后,分析HDMF 產(chǎn)量,篩選作用時(shí)間。
1.2.3 指標(biāo)測(cè)定
QOR 基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),以PGADH作為內(nèi)參基因合成引物(上海生工生物技術(shù)公司合成)。將魯氏酵母原菌和轉(zhuǎn)化后的QOR工程菌同時(shí)活化到細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2.0~2.5×108CFU·mL-1,取5%活化后的菌液加入100 mL 滅菌后YPD 液體培養(yǎng)基中(原菌為對(duì)照組,QOR工程菌為處理組)。將培養(yǎng)的魯氏酵母菌懸液于4 ℃,12 000 rpm 離心3 min,棄上清,將菌體于液氮中研磨至白色粉末狀,并裝入到1.5 mL Eppendorf 管中,利用Trizol 法提取RNA[9]。將提取的酵母RNA 利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。為了保證后期qRT-PCR的質(zhì)量,對(duì)上一步得到的cDNA 進(jìn)行普通PCR 驗(yàn)證,選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 使用THUNDERBIRD SYBR ? qPCR Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。PCR 程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,共39 個(gè)循環(huán)[10]。設(shè)定YPD 組中0 d 的GAPDH表達(dá)量為1,分別測(cè)定轉(zhuǎn)錄組挖掘的碳代謝通路待測(cè)基因表達(dá)量,每次測(cè)試設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù),3 個(gè)技術(shù)性重復(fù)。采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。分別在培養(yǎng)0~7 d 后取樣,測(cè)定QOR基因的相對(duì)表達(dá)水平。
表1 主要引物序列設(shè)計(jì)Table 1 Main primers sequence design
HDMF 產(chǎn)量測(cè)定參考Li 等[11]方法。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8 000 rpm 離心10 min,精準(zhǔn)吸取2 mL 上清液,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC測(cè)定HDMF 含量:UPLC BEH-Amide(1.7 μm,2.1×100 mm);流動(dòng)相0.5%甲酸和乙腈;流速1 mL·min-1;柱溫25 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm。將1 mg·L-1的HDMF 標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋制成2、5、15、20、40 和80 mg·L-1的HDMF 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用,在上述條件下制定HDMF 標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)各發(fā)酵液組別的HDMF 進(jìn)行定量。
菌落形態(tài)及活細(xì)胞數(shù)測(cè)定取培養(yǎng)0~7 d 的發(fā)酵液置于載玻片上,用次甲基藍(lán)對(duì)其染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察,確定對(duì)苯二酚和1,4-萘醌對(duì)酵母菌細(xì)胞形態(tài)的影響。發(fā)酵液中菌數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法[12]。
所得數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3 次,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS25.0、Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行分析作圖,采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù),t檢驗(yàn)法分析組間差異顯著性,P<0.05 表示實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
在微生物培養(yǎng)基中添加外源底物、電子受體或相關(guān)碳源,可通過電子受體等方式促進(jìn)NADH 氧化進(jìn)而維持還原能力的平衡[13]。NQO1 催化醌類還原發(fā)生反應(yīng)使醌類及其衍生物降解,減少細(xì)胞損傷,也可催化醌雙電子還原為對(duì)苯二酚[14]。在魯氏酵母菌中添加外源底物FBP,與呋喃酮合成相關(guān)的糖酵解(EMP)和磷酸戊糖途徑(PP)的關(guān)鍵基因和酶得到顯著上調(diào),促進(jìn)HDMF 的合成[15]。但關(guān)于對(duì)苯二酚和1,4-萘醌為外源底物調(diào)控魯氏酵母菌合成的研究鮮有報(bào)道。
以對(duì)苯二酚和1,4-萘醌為外源底物,探索其對(duì)魯氏酵母菌代謝合成HDMF 產(chǎn)量影響,結(jié)果如圖1所示。當(dāng)對(duì)苯二酚的濃度為10 μg·mL-1時(shí)HDMF 產(chǎn)量最高,為3.2 mg·L-1;1,4 萘醌濃度為10 mg·L-1時(shí)HDMF 產(chǎn)量最高,為2.86 mg·L-1。兩組實(shí)驗(yàn)組HDMF的產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說明添加適量濃度的對(duì)苯二酚和1,4-萘醌可以促進(jìn)魯氏酵母菌內(nèi)QOR 催化反應(yīng)生成HDMF。同時(shí),對(duì)苯二酚組HDMF產(chǎn)量略高于1,4-萘醌組,但兩種外源底物如何參與調(diào)控NQO1 活性,促進(jìn)HMMF 轉(zhuǎn)化為HDMF 機(jī)制尚不明確。
圖1 兩種外源底物的濃度對(duì)HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of two substrates concentration on HDMF production
作用時(shí)間的延長(zhǎng),有助于外源添加物進(jìn)入酵母菌生長(zhǎng)和代謝體系,影響HDMF 的相關(guān)反應(yīng)與合成。隨著時(shí)間的增加,兩種外源底物與酶促反應(yīng)的效率會(huì)得到提升,可能為HDMF 合成產(chǎn)量起到促進(jìn)作用。當(dāng)對(duì)苯二酚和1,4-萘醌濃度分別為10 μg·mL-1和10 mg·L-1時(shí),與對(duì)照組(0 d)相比較,添加對(duì)苯二酚后至3 d 時(shí),HDMF 產(chǎn)量顯著升高(P<0.05),4~7 d后緩慢下降,在3 d 時(shí)含量達(dá)到最高3.2 mg·L-1(圖2);添加1,4-萘醌至5 d 時(shí)HDMF 產(chǎn)量顯著升高(P<0.05),6~7 d 緩慢下降,在5 d 時(shí)含量達(dá)到最高3.09 mg·L-(1圖2)。
圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of culture time on HDMF production
HDMF 的產(chǎn)量在發(fā)酵后期隨著底物消耗而逐漸降低,這與李志江等[16]研究結(jié)果相類似,在豆醬中添加魯氏酵母發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)HDMF 含量在發(fā)酵后期逐漸降低并趨于平緩。
酚類化合物很容易被氧化,而多元酚則更容易被氧化,其產(chǎn)物為醌類化合物。醌類物質(zhì)作為醌氧化酶的底物,有利于QOR催化反應(yīng)并進(jìn)一步促進(jìn)HDMF 的形成[17]。在氧化應(yīng)激條件下,醌氧化還原酶活性的增高,它的作用方式之一就是以HADPH 和FAD 為輔基,催化兩個(gè)電子的反應(yīng),將異生質(zhì)醌還原成氫醌,其底物通常是對(duì)位醌[18],生成的氫醌隨后會(huì)被后續(xù)的酶偶聯(lián),并排出體外以達(dá)到QOR基因過量表達(dá)。QOR也可以催化多種醌的還原反應(yīng),其中對(duì)于鄰位醌和1,2-萘醌的催化效率最高[7],因此實(shí)驗(yàn)選用對(duì)苯二酚和1,2-萘醌作為QOR底物調(diào)控魯氏酵母工程菌產(chǎn)HDMF。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證外源添加對(duì)苯二酚和1,4-萘醌對(duì)魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌產(chǎn)HDMF 的影響,對(duì)其目的基因QOR相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。添加對(duì)苯二酚培養(yǎng)至第3 天時(shí),QOR基因相對(duì)表達(dá)量最高為5.02,與對(duì)照組相比較顯著提升(P<0.05);添加1,4 萘醌培養(yǎng)到5 d 時(shí)QOR基因相對(duì)表達(dá)量為3.9(P<0.05)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果可知,未添加該底物的培養(yǎng)基中QOR表達(dá)量在3 d 時(shí)產(chǎn)量最高為2.3 左右(課題組未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此,對(duì)苯二酚可以提高QOR相對(duì)表達(dá)量約2.2 倍;1,4-萘醌可以提高QOR相對(duì)表達(dá)量約1.7 倍。添加對(duì)苯二酚相比于1,4-萘醌的QOR表達(dá)量提高了1.3 倍。因此,通過添加兩種外源底物,促進(jìn)了魯氏酵母菌QOR基因過量表達(dá)。
圖3 兩種底物對(duì)QOR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of two substrates on QOR gene relative expression
圖4 兩種底物對(duì)活菌數(shù)量的影響Fig.4 Effect of two substrates on the number of live bacteria
由文獻(xiàn)可知,篩選10 μg·mL-1的對(duì)苯二酚濃度(0.01%)適于人體接受的作用劑量[19],也低于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的安全劑量(0.044%)[20],1,4-萘醌濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)對(duì)真菌不存在顯著致敏性[21]。因此,研究選用對(duì)苯二酚和1,4-萘醌適于本實(shí)驗(yàn)魯氏酵母菌的外源底物,參與魯氏酵母菌胞內(nèi)QOR催化反應(yīng)。
對(duì)添加對(duì)苯二酚與1,4-萘醌的魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的測(cè)定,顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目(圖5)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),兩組活菌數(shù)均呈先增高后下降的趨勢(shì),加入對(duì)苯二酚活菌數(shù)在3 d 時(shí)最多,加入1,4-萘醌活菌數(shù)在5 d 時(shí)最多(P<0.05)。李昕等[15]研究表明,魯氏酵母活菌數(shù)目越高,產(chǎn)生的HDMF 越多,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由此可知,添加對(duì)苯二酚與1,4-萘醌可以促進(jìn)魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌的生長(zhǎng)。
圖5 兩種底物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of two substrates on cell morphology
盡管對(duì)苯二酚和1,4-萘醌能夠促進(jìn)魯氏酵母細(xì)胞數(shù)目的增加,但也會(huì)對(duì)菌體形態(tài)造成潛在的影響。高濃度對(duì)苯二酚急性暴露處理釀酒酵母,通過增加活性氧導(dǎo)致菌體細(xì)胞凋亡調(diào)控基因、磷脂和中性脂水平高表達(dá),抑制了酵母菌細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。1,4-萘醌可通過2 位羥基或甲氧基作用,與菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生作用,破壞真菌細(xì)胞壁致死菌體[21]。
通過觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)可直觀的比較外源添加底物對(duì)其產(chǎn)生的影響。取0、1、3、5、7 d 發(fā)酵液用次甲基藍(lán)對(duì)其染色后,由于細(xì)胞浸于次甲基藍(lán)溶液時(shí),色素滲入細(xì)胞內(nèi),活細(xì)胞內(nèi)的還原酶能使其脫色,但死細(xì)胞內(nèi)的還原酶失活,不能產(chǎn)生脫色作用,被染成藍(lán)色(圖4 中呈黑色菌體)[22]。因此藍(lán)色的死細(xì)胞不能再產(chǎn)HDMF,未被染色的活細(xì)胞可繼續(xù)產(chǎn)HDMF。結(jié)果如圖4 所示,加入兩種外源底物后原菌及轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞均呈小圓形或橢圓形,聚集在一起,且死亡率低,這與Liu 等[23]研究中的魯氏酵母細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)相一致。說明添加對(duì)苯二酚與1,4-萘醌對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及活性未產(chǎn)生較大的致死影響,但致死率及抑制機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
在魯氏酵母QOR基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入對(duì)苯二酚和1,4-萘醌,測(cè)定發(fā)酵液中HDMF含量以及對(duì)菌體生長(zhǎng)活性產(chǎn)生的影響。通過添加最適濃度的對(duì)苯二酚和1,4-萘醌,培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn),兩實(shí)驗(yàn)組中QOR基因相對(duì)表達(dá)量均成倍數(shù)升高,QOR催化加速FBP 代謝合成HDMF。同時(shí)酵母活細(xì)胞數(shù)量增加,且菌體形態(tài)未發(fā)生改變。當(dāng)外源酚類和醌類達(dá)到最佳添加量時(shí),酚類產(chǎn)出HDMF 的含量是醌類的1.12 倍。研究證明利用外源酚類和醌類可作為QOR反應(yīng)底物促進(jìn)魯氏酵母工程菌生產(chǎn)HDMF,但具體調(diào)控機(jī)制還有待考究。因此,外源添加對(duì)苯二酚和1,4-萘醌可在不影響魯氏酵母工程菌生長(zhǎng)時(shí),提高HDMF 的產(chǎn)量,為今后實(shí)現(xiàn)低成本,高產(chǎn)量制備天然HDMF 提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。
黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)2023年3期