彭輝，潘百玲，李忍，鄧景致，李志江，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心）

魯氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）可以在高鹽高糖或偏酸性的環(huán)境下生長，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品增香中具有重要增香作用，是醬油和豆醬等釀造時主要的發(fā)酵劑和增香菌株[1]。4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2，5-dimethyl-3（2H）-furanone，HDMF）是一種類似菠蘿風味的香料，首次在菠蘿中分離得到，在食品和煙草行業(yè)中具有較高的商業(yè)價值[2]。

天然HDMF 主要利用微生物合成法生產(chǎn)，Z.rouxii是被報道用于微生物合成HDMF 常見的菌種[3]。果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP）是魯氏酵母菌代謝產(chǎn)生HDMF 的重要前體物質(zhì)[4]，經(jīng)2，3-烯醇化和脫磷酸作用后，形成的1-脫氧-2，3-鄰酮-6-磷酸-己糖經(jīng)去磷酸和NAD（P）H-醌氧化還原酶1 〔NAD （P）H：quinone oxidoreductase，NQO1〕作用，得到中間產(chǎn)物4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-3（2H）-furanone，HMMF）。烯醇式HMMF 經(jīng)線粒體內(nèi)醌氧化還原酶（Quinone oxidoreductase，QOR）作用，在酵母體內(nèi)獨立的被轉(zhuǎn)化為HDMF[5]。因此，QOR 是酵母菌利用FBP 代謝合成HDMF 重要催化酶。

酚類物質(zhì)在有氧條件下易被氧化成醌類化合物。醌類物質(zhì)自發(fā)失去電子變成半醌，在QOR 催化下將半醌還原為對苯二酚，對苯二酚在有氧條件下被再氧化成半醌中間體，形成QOR 催化還原反應的底物[6]。對苯二酚和1，4-萘醌是QOR 催化的底物，QOR 催化鄰位醌和1，4-萘醌的效率最高[7]，但在魯氏酵母菌中鮮有利用外源酚和醌類物質(zhì)底物提供魯氏酵母菌代謝合成HDMF 報道。因此，研究利用魯氏酵母QOR基因過表達工程菌為菌株，在反應體系中添加對苯二酚和1，4-萘醌，為QOR 提供外源底物使魯氏酵母菌代謝合成HDMF。旨在提高魯氏酵母菌代謝合成HDMF 提供數(shù)據(jù)支撐，為推進HDMF 的產(chǎn)業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

魯氏酵母菌中國普通微生物菌種保藏管理中心（菌種保藏編號為No.32899）；魯氏酵母QOR基因過表達工程菌實驗室構(gòu)建保藏；YPD 液體培養(yǎng)基（20 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，10 g·L-1酵母提取物）青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器

HDMF 標品美國Sigma 公司；甲醇、乙腈和甲酸為色譜級山東浩中化工科技有限公司；對苯二酚（99%）和1，4-萘醌（98%）均為分析純上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純青島市捷盛化工物資有限公司；次甲基藍上海正劑化工科技有限公司；TRIzol 美國Invitrogen 公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本東洋紡公司。

LDZM 立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2G 超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；HZQ-QX 臺式高速離心機湘儀離心機儀器有限公司；YKSD-1000 倒置顯微鏡上海永科光學儀器有限公司；CFX96TM 實時熒光定量PCR 儀器美國Bio-Rad 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)

參考周亞男等[8]方法并稍作改動。取凍存的魯氏酵母QOR基因過表達工程菌菌株干粉，無菌條件下接入100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，在全溫振蕩器中28 ℃、180 rpm 條件下培養(yǎng)3 d，測定細胞總數(shù)達到2.5～3.0×108CFU·mL-1備用。

1.2.2 對苯二酚和1，4-萘醌濃度與作用時間對魯氏酵母菌合成HDMF 的影響

配置1、10、50 和100 μg·mL-1的對苯二酚，分別利用有機過濾膜過濾后加入到滅菌的YPD 液體培養(yǎng)基中，再將活化的魯氏酵母原菌和工程菌按5%比例接種到不同濃度對苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基中，以不加對苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基作為對照，在28 ℃和180 rpm 進行培養(yǎng)，以HDMF 產(chǎn)量為指標篩選對苯二酚最優(yōu)濃度。配置1、10、50 和100 mg·L-1的1，2-萘醌，按上述條件進行1，2-萘醌濃度的篩選。在滅菌的液體培養(yǎng)基中加入篩選的對苯二酚和1，4-萘醌濃度，將活化至相同菌數(shù)的魯氏酵母原菌和工程菌按5%分別接種到培養(yǎng)基中，于28 ℃和1 80 rpm 條件下，分別培養(yǎng)0～7 d。用移液槍精確量取菌液2 mL，8 000 rpm，離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后，分析HDMF 產(chǎn)量，篩選作用時間。

1.2.3 指標測定

QOR 基因相對表達水平測定使用Primer 5.0軟件設計引物（表1），以PGADH作為內(nèi)參基因合成引物（上海生工生物技術(shù)公司合成）。將魯氏酵母原菌和轉(zhuǎn)化后的QOR工程菌同時活化到細胞總數(shù)達到2.0～2.5×108CFU·mL-1，取5%活化后的菌液加入100 mL 滅菌后YPD 液體培養(yǎng)基中（原菌為對照組，QOR工程菌為處理組）。將培養(yǎng)的魯氏酵母菌懸液于4 ℃，12 000 rpm 離心3 min，棄上清，將菌體于液氮中研磨至白色粉末狀，并裝入到1.5 mL Eppendorf 管中，利用Trizol 法提取RNA[9]。將提取的酵母RNA 利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。為了保證后期qRT-PCR的質(zhì)量，對上一步得到的cDNA 進行普通PCR 驗證，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 使用THUNDERBIRD SYBR ? qPCR Mix 試劑盒進行qRT-PCR 反應。PCR 程序設置為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，共39 個循環(huán)[10]。設定YPD 組中0 d 的GAPDH表達量為1，分別測定轉(zhuǎn)錄組挖掘的碳代謝通路待測基因表達量，每次測試設3 個生物學重復，3 個技術(shù)性重復。采用2-ΔΔCt計算相對表達量。分別在培養(yǎng)0～7 d 后取樣，測定QOR基因的相對表達水平。

表1 主要引物序列設計Table 1 Main primers sequence design

HDMF 產(chǎn)量測定參考Li 等[11]方法。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8 000 rpm 離心10 min，精準吸取2 mL 上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC測定HDMF 含量：UPLC BEH-Amide（1.7 μm，2.1×100 mm）；流動相0.5%甲酸和乙腈；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長287 nm。將1 mg·L-1的HDMF 標準液分別稀釋制成2、5、15、20、40 和80 mg·L-1的HDMF 標準溶液備用，在上述條件下制定HDMF 標準曲線，對各發(fā)酵液組別的HDMF 進行定量。

菌落形態(tài)及活細胞數(shù)測定取培養(yǎng)0～7 d 的發(fā)酵液置于載玻片上，用次甲基藍對其染色，在光學顯微鏡下觀察，確定對苯二酚和1，4-萘醌對酵母菌細胞形態(tài)的影響。發(fā)酵液中菌數(shù)測定采用血球計數(shù)法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均重復測定3 次，用平均值±標準差來表示。利用統(tǒng)計學軟件SPSS25.0、Graphpad Prism 8.0 進行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，t檢驗法分析組間差異顯著性，P＜0.05 表示實驗組間數(shù)據(jù)差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對苯二酚和1，4-萘醌濃度對魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量的影響

在微生物培養(yǎng)基中添加外源底物、電子受體或相關(guān)碳源，可通過電子受體等方式促進NADH 氧化進而維持還原能力的平衡[13]。NQO1 催化醌類還原發(fā)生反應使醌類及其衍生物降解，減少細胞損傷，也可催化醌雙電子還原為對苯二酚[14]。在魯氏酵母菌中添加外源底物FBP，與呋喃酮合成相關(guān)的糖酵解（EMP）和磷酸戊糖途徑（PP）的關(guān)鍵基因和酶得到顯著上調(diào)，促進HDMF 的合成[15]。但關(guān)于對苯二酚和1，4-萘醌為外源底物調(diào)控魯氏酵母菌合成的研究鮮有報道。

以對苯二酚和1，4-萘醌為外源底物，探索其對魯氏酵母菌代謝合成HDMF 產(chǎn)量影響，結(jié)果如圖1所示。當對苯二酚的濃度為10 μg·mL-1時HDMF 產(chǎn)量最高，為3.2 mg·L-1；1，4 萘醌濃度為10 mg·L-1時HDMF 產(chǎn)量最高，為2.86 mg·L-1。兩組實驗組HDMF的產(chǎn)量均顯著高于對照組（P＜0.05），說明添加適量濃度的對苯二酚和1，4-萘醌可以促進魯氏酵母菌內(nèi)QOR 催化反應生成HDMF。同時，對苯二酚組HDMF產(chǎn)量略高于1，4-萘醌組，但兩種外源底物如何參與調(diào)控NQO1 活性，促進HMMF 轉(zhuǎn)化為HDMF 機制尚不明確。

圖1 兩種外源底物的濃度對HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of two substrates concentration on HDMF production

2.2 培養(yǎng)時間對苯二酚和1，4-萘醌對魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量影響

作用時間的延長，有助于外源添加物進入酵母菌生長和代謝體系，影響HDMF 的相關(guān)反應與合成。隨著時間的增加，兩種外源底物與酶促反應的效率會得到提升，可能為HDMF 合成產(chǎn)量起到促進作用。當對苯二酚和1，4-萘醌濃度分別為10 μg·mL-1和10 mg·L-1時，與對照組（0 d）相比較，添加對苯二酚后至3 d 時，HDMF 產(chǎn)量顯著升高（P＜0.05），4～7 d后緩慢下降，在3 d 時含量達到最高3.2 mg·L-1（圖2）；添加1，4-萘醌至5 d 時HDMF 產(chǎn)量顯著升高（P＜0.05），6～7 d 緩慢下降，在5 d 時含量達到最高3.09 mg·L-（1圖2）。

圖2 培養(yǎng)時間對HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of culture time on HDMF production

HDMF 的產(chǎn)量在發(fā)酵后期隨著底物消耗而逐漸降低，這與李志江等[16]研究結(jié)果相類似，在豆醬中添加魯氏酵母發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)HDMF 含量在發(fā)酵后期逐漸降低并趨于平緩。

2.3 對苯二酚和1，4-萘醌對魯氏酵母菌QOR 基因表達量的影響

酚類化合物很容易被氧化，而多元酚則更容易被氧化，其產(chǎn)物為醌類化合物。醌類物質(zhì)作為醌氧化酶的底物，有利于QOR催化反應并進一步促進HDMF 的形成[17]。在氧化應激條件下，醌氧化還原酶活性的增高，它的作用方式之一就是以HADPH 和FAD 為輔基，催化兩個電子的反應，將異生質(zhì)醌還原成氫醌，其底物通常是對位醌[18]，生成的氫醌隨后會被后續(xù)的酶偶聯(lián)，并排出體外以達到QOR基因過量表達。QOR也可以催化多種醌的還原反應，其中對于鄰位醌和1，2-萘醌的催化效率最高[7]，因此實驗選用對苯二酚和1，2-萘醌作為QOR底物調(diào)控魯氏酵母工程菌產(chǎn)HDMF。

為了進一步驗證外源添加對苯二酚和1，4-萘醌對魯氏酵母QOR過表達工程菌產(chǎn)HDMF 的影響，對其目的基因QOR相對表達量進行測定，結(jié)果如圖3所示。添加對苯二酚培養(yǎng)至第3 天時，QOR基因相對表達量最高為5.02，與對照組相比較顯著提升（P＜0.05）；添加1，4 萘醌培養(yǎng)到5 d 時QOR基因相對表達量為3.9（P＜0.05）。根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果可知，未添加該底物的培養(yǎng)基中QOR表達量在3 d 時產(chǎn)量最高為2.3 左右（課題組未發(fā)表數(shù)據(jù)）。因此，對苯二酚可以提高QOR相對表達量約2.2 倍；1，4-萘醌可以提高QOR相對表達量約1.7 倍。添加對苯二酚相比于1，4-萘醌的QOR表達量提高了1.3 倍。因此，通過添加兩種外源底物，促進了魯氏酵母菌QOR基因過量表達。

圖3 兩種底物對QOR 基因相對表達量的影響Fig.3 Effects of two substrates on QOR gene relative expression

圖4 兩種底物對活菌數(shù)量的影響Fig.4 Effect of two substrates on the number of live bacteria

2.4 對苯二酚和1，4-萘醌對魯氏酵母菌細胞數(shù)的影響

由文獻可知，篩選10 μg·mL-1的對苯二酚濃度（0.01%）適于人體接受的作用劑量[19]，也低于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的安全劑量（0.044%）[20]，1，4-萘醌濃度達到10 mg·L-1時對真菌不存在顯著致敏性[21]。因此，研究選用對苯二酚和1，4-萘醌適于本實驗魯氏酵母菌的外源底物，參與魯氏酵母菌胞內(nèi)QOR催化反應。

對添加對苯二酚與1，4-萘醌的魯氏酵母QOR過表達工程菌進行細胞數(shù)的測定，顯微鏡下利用血球計數(shù)板測定活細胞數(shù)目（圖5）。隨著發(fā)酵時間的延長，兩組活菌數(shù)均呈先增高后下降的趨勢，加入對苯二酚活菌數(shù)在3 d 時最多，加入1，4-萘醌活菌數(shù)在5 d 時最多（P＜0.05）。李昕等[15]研究表明，魯氏酵母活菌數(shù)目越高，產(chǎn)生的HDMF 越多，與上述實驗結(jié)果相似。由此可知，添加對苯二酚與1，4-萘醌可以促進魯氏酵母QOR過表達工程菌的生長。

圖5 兩種底物對細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of two substrates on cell morphology

2.5 對苯二酚和1，4-萘醌對魯氏酵母菌細胞形態(tài)的影響

盡管對苯二酚和1，4-萘醌能夠促進魯氏酵母細胞數(shù)目的增加，但也會對菌體形態(tài)造成潛在的影響。高濃度對苯二酚急性暴露處理釀酒酵母，通過增加活性氧導致菌體細胞凋亡調(diào)控基因、磷脂和中性脂水平高表達，抑制了酵母菌細胞生長[20]。1，4-萘醌可通過2 位羥基或甲氧基作用，與菌體細胞壁和細胞膜系統(tǒng)發(fā)生作用，破壞真菌細胞壁致死菌體[21]。

通過觀察細胞生長形態(tài)可直觀的比較外源添加底物對其產(chǎn)生的影響。取0、1、3、5、7 d 發(fā)酵液用次甲基藍對其染色后，由于細胞浸于次甲基藍溶液時，色素滲入細胞內(nèi)，活細胞內(nèi)的還原酶能使其脫色，但死細胞內(nèi)的還原酶失活，不能產(chǎn)生脫色作用，被染成藍色（圖4 中呈黑色菌體）[22]。因此藍色的死細胞不能再產(chǎn)HDMF，未被染色的活細胞可繼續(xù)產(chǎn)HDMF。結(jié)果如圖4 所示，加入兩種外源底物后原菌及轉(zhuǎn)化菌細胞均呈小圓形或橢圓形，聚集在一起，且死亡率低，這與Liu 等[23]研究中的魯氏酵母細胞生長形態(tài)相一致。說明添加對苯二酚與1，4-萘醌對細胞的形態(tài)及活性未產(chǎn)生較大的致死影響，但致死率及抑制機制需要進一步研究。

3 結(jié)論

在魯氏酵母QOR基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入對苯二酚和1，4-萘醌，測定發(fā)酵液中HDMF含量以及對菌體生長活性產(chǎn)生的影響。通過添加最適濃度的對苯二酚和1，4-萘醌，培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)，兩實驗組中QOR基因相對表達量均成倍數(shù)升高，QOR催化加速FBP 代謝合成HDMF。同時酵母活細胞數(shù)量增加，且菌體形態(tài)未發(fā)生改變。當外源酚類和醌類達到最佳添加量時，酚類產(chǎn)出HDMF 的含量是醌類的1.12 倍。研究證明利用外源酚類和醌類可作為QOR反應底物促進魯氏酵母工程菌生產(chǎn)HDMF，但具體調(diào)控機制還有待考究。因此，外源添加對苯二酚和1，4-萘醌可在不影響魯氏酵母工程菌生長時，提高HDMF 的產(chǎn)量，為今后實現(xiàn)低成本，高產(chǎn)量制備天然HDMF 提供一定的試驗依據(jù)。