亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母工程菌呋喃酮產(chǎn)量及菌體的影響

        2023-06-27 11:16:54彭輝潘百玲李忍鄧景致李志江
        關(guān)鍵詞:萘醌對苯二酚魯氏

        彭輝,潘百玲,李忍,鄧景致,李志江,2

        (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院,大慶 163319;2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心)

        魯氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)可以在高鹽高糖或偏酸性的環(huán)境下生長,在傳統(tǒng)發(fā)酵食品增香中具有重要增香作用,是醬油和豆醬等釀造時主要的發(fā)酵劑和增香菌株[1]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone,HDMF)是一種類似菠蘿風味的香料,首次在菠蘿中分離得到,在食品和煙草行業(yè)中具有較高的商業(yè)價值[2]。

        天然HDMF 主要利用微生物合成法生產(chǎn),Z.rouxii是被報道用于微生物合成HDMF 常見的菌種[3]。果糖-1,6-二磷酸(Fructose-1,6-bisphosphate,F(xiàn)BP)是魯氏酵母菌代謝產(chǎn)生HDMF 的重要前體物質(zhì)[4],經(jīng)2,3-烯醇化和脫磷酸作用后,形成的1-脫氧-2,3-鄰酮-6-磷酸-己糖經(jīng)去磷酸和NAD(P)H-醌氧化還原酶1 〔NAD (P)H:quinone oxidoreductase,NQO1〕作用,得到中間產(chǎn)物4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3(2H)-呋喃酮(4-hydroxy-2(or 5)-ethyl-5(or 2)-methyl-3(2H)-furanone,HMMF)。烯醇式HMMF 經(jīng)線粒體內(nèi)醌氧化還原酶(Quinone oxidoreductase,QOR)作用,在酵母體內(nèi)獨立的被轉(zhuǎn)化為HDMF[5]。因此,QOR 是酵母菌利用FBP 代謝合成HDMF 重要催化酶。

        酚類物質(zhì)在有氧條件下易被氧化成醌類化合物。醌類物質(zhì)自發(fā)失去電子變成半醌,在QOR 催化下將半醌還原為對苯二酚,對苯二酚在有氧條件下被再氧化成半醌中間體,形成QOR 催化還原反應的底物[6]。對苯二酚和1,4-萘醌是QOR 催化的底物,QOR 催化鄰位醌和1,4-萘醌的效率最高[7],但在魯氏酵母菌中鮮有利用外源酚和醌類物質(zhì)底物提供魯氏酵母菌代謝合成HDMF 報道。因此,研究利用魯氏酵母QOR基因過表達工程菌為菌株,在反應體系中添加對苯二酚和1,4-萘醌,為QOR 提供外源底物使魯氏酵母菌代謝合成HDMF。旨在提高魯氏酵母菌代謝合成HDMF 提供數(shù)據(jù)支撐,為推進HDMF 的產(chǎn)業(yè)化應用奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

        魯氏酵母菌中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌種保藏編號為No.32899);魯氏酵母QOR基因過表達工程菌實驗室構(gòu)建保藏;YPD 液體培養(yǎng)基(20 g·L-1蛋白胨,20 g·L-1葡萄糖,10 g·L-1酵母提取物)青島海博生物技術(shù)有限公司。

        1.1.2 試劑與儀器

        HDMF 標品美國Sigma 公司;甲醇、乙腈和甲酸為色譜級山東浩中化工科技有限公司;對苯二酚(99%)和1,4-萘醌(98%)均為分析純上海麥克林生化科技有限公司;乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純青島市捷盛化工物資有限公司;次甲基藍上海正劑化工科技有限公司;TRIzol 美國Invitrogen 公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本東洋紡公司。

        LDZM 立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-2G 超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司;HZQ-QX 臺式高速離心機湘儀離心機儀器有限公司;YKSD-1000 倒置顯微鏡上海永科光學儀器有限公司;CFX96TM 實時熒光定量PCR 儀器美國Bio-Rad 公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)

        參考周亞男等[8]方法并稍作改動。取凍存的魯氏酵母QOR基因過表達工程菌菌株干粉,無菌條件下接入100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中,在全溫振蕩器中28 ℃、180 rpm 條件下培養(yǎng)3 d,測定細胞總數(shù)達到2.5~3.0×108CFU·mL-1備用。

        1.2.2 對苯二酚和1,4-萘醌濃度與作用時間對魯氏酵母菌合成HDMF 的影響

        配置1、10、50 和100 μg·mL-1的對苯二酚,分別利用有機過濾膜過濾后加入到滅菌的YPD 液體培養(yǎng)基中,再將活化的魯氏酵母原菌和工程菌按5%比例接種到不同濃度對苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基中,以不加對苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基作為對照,在28 ℃和180 rpm 進行培養(yǎng),以HDMF 產(chǎn)量為指標篩選對苯二酚最優(yōu)濃度。配置1、10、50 和100 mg·L-1的1,2-萘醌,按上述條件進行1,2-萘醌濃度的篩選。在滅菌的液體培養(yǎng)基中加入篩選的對苯二酚和1,4-萘醌濃度,將活化至相同菌數(shù)的魯氏酵母原菌和工程菌按5%分別接種到培養(yǎng)基中,于28 ℃和1 80 rpm 條件下,分別培養(yǎng)0~7 d。用移液槍精確量取菌液2 mL,8 000 rpm,離心10 min,取上清液過0.22 μm 濾膜后,分析HDMF 產(chǎn)量,篩選作用時間。

        1.2.3 指標測定

        QOR 基因相對表達水平測定使用Primer 5.0軟件設計引物(表1),以PGADH作為內(nèi)參基因合成引物(上海生工生物技術(shù)公司合成)。將魯氏酵母原菌和轉(zhuǎn)化后的QOR工程菌同時活化到細胞總數(shù)達到2.0~2.5×108CFU·mL-1,取5%活化后的菌液加入100 mL 滅菌后YPD 液體培養(yǎng)基中(原菌為對照組,QOR工程菌為處理組)。將培養(yǎng)的魯氏酵母菌懸液于4 ℃,12 000 rpm 離心3 min,棄上清,將菌體于液氮中研磨至白色粉末狀,并裝入到1.5 mL Eppendorf 管中,利用Trizol 法提取RNA[9]。將提取的酵母RNA 利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。為了保證后期qRT-PCR的質(zhì)量,對上一步得到的cDNA 進行普通PCR 驗證,選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 使用THUNDERBIRD SYBR ? qPCR Mix 試劑盒進行qRT-PCR 反應。PCR 程序設置為95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,共39 個循環(huán)[10]。設定YPD 組中0 d 的GAPDH表達量為1,分別測定轉(zhuǎn)錄組挖掘的碳代謝通路待測基因表達量,每次測試設3 個生物學重復,3 個技術(shù)性重復。采用2-ΔΔCt計算相對表達量。分別在培養(yǎng)0~7 d 后取樣,測定QOR基因的相對表達水平。

        表1 主要引物序列設計Table 1 Main primers sequence design

        HDMF 產(chǎn)量測定參考Li 等[11]方法。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8 000 rpm 離心10 min,精準吸取2 mL 上清液,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC測定HDMF 含量:UPLC BEH-Amide(1.7 μm,2.1×100 mm);流動相0.5%甲酸和乙腈;流速1 mL·min-1;柱溫25 ℃,進樣量10 μL,檢測波長287 nm。將1 mg·L-1的HDMF 標準液分別稀釋制成2、5、15、20、40 和80 mg·L-1的HDMF 標準溶液備用,在上述條件下制定HDMF 標準曲線,對各發(fā)酵液組別的HDMF 進行定量。

        菌落形態(tài)及活細胞數(shù)測定取培養(yǎng)0~7 d 的發(fā)酵液置于載玻片上,用次甲基藍對其染色,在光學顯微鏡下觀察,確定對苯二酚和1,4-萘醌對酵母菌細胞形態(tài)的影響。發(fā)酵液中菌數(shù)測定采用血球計數(shù)法[12]。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        所得數(shù)據(jù)均重復測定3 次,用平均值±標準差來表示。利用統(tǒng)計學軟件SPSS25.0、Graphpad Prism 8.0 進行分析作圖,采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù),t檢驗法分析組間差異顯著性,P<0.05 表示實驗組間數(shù)據(jù)差異顯著,具有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 對苯二酚和1,4-萘醌濃度對魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量的影響

        在微生物培養(yǎng)基中添加外源底物、電子受體或相關(guān)碳源,可通過電子受體等方式促進NADH 氧化進而維持還原能力的平衡[13]。NQO1 催化醌類還原發(fā)生反應使醌類及其衍生物降解,減少細胞損傷,也可催化醌雙電子還原為對苯二酚[14]。在魯氏酵母菌中添加外源底物FBP,與呋喃酮合成相關(guān)的糖酵解(EMP)和磷酸戊糖途徑(PP)的關(guān)鍵基因和酶得到顯著上調(diào),促進HDMF 的合成[15]。但關(guān)于對苯二酚和1,4-萘醌為外源底物調(diào)控魯氏酵母菌合成的研究鮮有報道。

        以對苯二酚和1,4-萘醌為外源底物,探索其對魯氏酵母菌代謝合成HDMF 產(chǎn)量影響,結(jié)果如圖1所示。當對苯二酚的濃度為10 μg·mL-1時HDMF 產(chǎn)量最高,為3.2 mg·L-1;1,4 萘醌濃度為10 mg·L-1時HDMF 產(chǎn)量最高,為2.86 mg·L-1。兩組實驗組HDMF的產(chǎn)量均顯著高于對照組(P<0.05),說明添加適量濃度的對苯二酚和1,4-萘醌可以促進魯氏酵母菌內(nèi)QOR 催化反應生成HDMF。同時,對苯二酚組HDMF產(chǎn)量略高于1,4-萘醌組,但兩種外源底物如何參與調(diào)控NQO1 活性,促進HMMF 轉(zhuǎn)化為HDMF 機制尚不明確。

        圖1 兩種外源底物的濃度對HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of two substrates concentration on HDMF production

        2.2 培養(yǎng)時間對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量影響

        作用時間的延長,有助于外源添加物進入酵母菌生長和代謝體系,影響HDMF 的相關(guān)反應與合成。隨著時間的增加,兩種外源底物與酶促反應的效率會得到提升,可能為HDMF 合成產(chǎn)量起到促進作用。當對苯二酚和1,4-萘醌濃度分別為10 μg·mL-1和10 mg·L-1時,與對照組(0 d)相比較,添加對苯二酚后至3 d 時,HDMF 產(chǎn)量顯著升高(P<0.05),4~7 d后緩慢下降,在3 d 時含量達到最高3.2 mg·L-1(圖2);添加1,4-萘醌至5 d 時HDMF 產(chǎn)量顯著升高(P<0.05),6~7 d 緩慢下降,在5 d 時含量達到最高3.09 mg·L-(1圖2)。

        圖2 培養(yǎng)時間對HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of culture time on HDMF production

        HDMF 的產(chǎn)量在發(fā)酵后期隨著底物消耗而逐漸降低,這與李志江等[16]研究結(jié)果相類似,在豆醬中添加魯氏酵母發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)HDMF 含量在發(fā)酵后期逐漸降低并趨于平緩。

        2.3 對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母菌QOR 基因表達量的影響

        酚類化合物很容易被氧化,而多元酚則更容易被氧化,其產(chǎn)物為醌類化合物。醌類物質(zhì)作為醌氧化酶的底物,有利于QOR催化反應并進一步促進HDMF 的形成[17]。在氧化應激條件下,醌氧化還原酶活性的增高,它的作用方式之一就是以HADPH 和FAD 為輔基,催化兩個電子的反應,將異生質(zhì)醌還原成氫醌,其底物通常是對位醌[18],生成的氫醌隨后會被后續(xù)的酶偶聯(lián),并排出體外以達到QOR基因過量表達。QOR也可以催化多種醌的還原反應,其中對于鄰位醌和1,2-萘醌的催化效率最高[7],因此實驗選用對苯二酚和1,2-萘醌作為QOR底物調(diào)控魯氏酵母工程菌產(chǎn)HDMF。

        為了進一步驗證外源添加對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母QOR過表達工程菌產(chǎn)HDMF 的影響,對其目的基因QOR相對表達量進行測定,結(jié)果如圖3所示。添加對苯二酚培養(yǎng)至第3 天時,QOR基因相對表達量最高為5.02,與對照組相比較顯著提升(P<0.05);添加1,4 萘醌培養(yǎng)到5 d 時QOR基因相對表達量為3.9(P<0.05)。根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果可知,未添加該底物的培養(yǎng)基中QOR表達量在3 d 時產(chǎn)量最高為2.3 左右(課題組未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此,對苯二酚可以提高QOR相對表達量約2.2 倍;1,4-萘醌可以提高QOR相對表達量約1.7 倍。添加對苯二酚相比于1,4-萘醌的QOR表達量提高了1.3 倍。因此,通過添加兩種外源底物,促進了魯氏酵母菌QOR基因過量表達。

        圖3 兩種底物對QOR 基因相對表達量的影響Fig.3 Effects of two substrates on QOR gene relative expression

        圖4 兩種底物對活菌數(shù)量的影響Fig.4 Effect of two substrates on the number of live bacteria

        2.4 對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母菌細胞數(shù)的影響

        由文獻可知,篩選10 μg·mL-1的對苯二酚濃度(0.01%)適于人體接受的作用劑量[19],也低于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的安全劑量(0.044%)[20],1,4-萘醌濃度達到10 mg·L-1時對真菌不存在顯著致敏性[21]。因此,研究選用對苯二酚和1,4-萘醌適于本實驗魯氏酵母菌的外源底物,參與魯氏酵母菌胞內(nèi)QOR催化反應。

        對添加對苯二酚與1,4-萘醌的魯氏酵母QOR過表達工程菌進行細胞數(shù)的測定,顯微鏡下利用血球計數(shù)板測定活細胞數(shù)目(圖5)。隨著發(fā)酵時間的延長,兩組活菌數(shù)均呈先增高后下降的趨勢,加入對苯二酚活菌數(shù)在3 d 時最多,加入1,4-萘醌活菌數(shù)在5 d 時最多(P<0.05)。李昕等[15]研究表明,魯氏酵母活菌數(shù)目越高,產(chǎn)生的HDMF 越多,與上述實驗結(jié)果相似。由此可知,添加對苯二酚與1,4-萘醌可以促進魯氏酵母QOR過表達工程菌的生長。

        圖5 兩種底物對細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of two substrates on cell morphology

        2.5 對苯二酚和1,4-萘醌對魯氏酵母菌細胞形態(tài)的影響

        盡管對苯二酚和1,4-萘醌能夠促進魯氏酵母細胞數(shù)目的增加,但也會對菌體形態(tài)造成潛在的影響。高濃度對苯二酚急性暴露處理釀酒酵母,通過增加活性氧導致菌體細胞凋亡調(diào)控基因、磷脂和中性脂水平高表達,抑制了酵母菌細胞生長[20]。1,4-萘醌可通過2 位羥基或甲氧基作用,與菌體細胞壁和細胞膜系統(tǒng)發(fā)生作用,破壞真菌細胞壁致死菌體[21]。

        通過觀察細胞生長形態(tài)可直觀的比較外源添加底物對其產(chǎn)生的影響。取0、1、3、5、7 d 發(fā)酵液用次甲基藍對其染色后,由于細胞浸于次甲基藍溶液時,色素滲入細胞內(nèi),活細胞內(nèi)的還原酶能使其脫色,但死細胞內(nèi)的還原酶失活,不能產(chǎn)生脫色作用,被染成藍色(圖4 中呈黑色菌體)[22]。因此藍色的死細胞不能再產(chǎn)HDMF,未被染色的活細胞可繼續(xù)產(chǎn)HDMF。結(jié)果如圖4 所示,加入兩種外源底物后原菌及轉(zhuǎn)化菌細胞均呈小圓形或橢圓形,聚集在一起,且死亡率低,這與Liu 等[23]研究中的魯氏酵母細胞生長形態(tài)相一致。說明添加對苯二酚與1,4-萘醌對細胞的形態(tài)及活性未產(chǎn)生較大的致死影響,但致死率及抑制機制需要進一步研究。

        3 結(jié)論

        在魯氏酵母QOR基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入對苯二酚和1,4-萘醌,測定發(fā)酵液中HDMF含量以及對菌體生長活性產(chǎn)生的影響。通過添加最適濃度的對苯二酚和1,4-萘醌,培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn),兩實驗組中QOR基因相對表達量均成倍數(shù)升高,QOR催化加速FBP 代謝合成HDMF。同時酵母活細胞數(shù)量增加,且菌體形態(tài)未發(fā)生改變。當外源酚類和醌類達到最佳添加量時,酚類產(chǎn)出HDMF 的含量是醌類的1.12 倍。研究證明利用外源酚類和醌類可作為QOR反應底物促進魯氏酵母工程菌生產(chǎn)HDMF,但具體調(diào)控機制還有待考究。因此,外源添加對苯二酚和1,4-萘醌可在不影響魯氏酵母工程菌生長時,提高HDMF 的產(chǎn)量,為今后實現(xiàn)低成本,高產(chǎn)量制備天然HDMF 提供一定的試驗依據(jù)。

        猜你喜歡
        萘醌對苯二酚魯氏
        對苯二酚對類珠藻的生物毒性
        水胡桃葉中萘醌的提取及其體外抗氧化活性
        鑒定紅曲菌中萘醌響應基因提高紅曲色素產(chǎn)率
        納米氧化鋅修飾玻碳電極–電化學法測定水中的對苯二酚與鄰苯二酚
        合成源1,4-萘醌類衍生物的抗腫瘤活性研究進展
        廣州化學(2020年6期)2020-12-28 06:53:12
        《豐乳肥臀》中母親上官魯氏的形象分析
        聚曙紅Y 修飾玻碳電極循環(huán)伏安法測定自來水中對苯二酚
        間氯過氧化苯甲酸可控性氧化2-巰基萘醌類化合物的合成與鑒定
        納米金修飾電極對對苯二酚的電催化性能研究
        山東化工(2017年5期)2017-09-16 02:43:15
        上官魯氏和凱蒂的母親形象比較研究
        a级毛片高清免费视频就| 国产一区二区三区不卡视频| 亚洲第一网站免费视频| 午夜精品久久久久久久99热| 欧美激情内射喷水高潮| 精品91精品91精品国产片| 亚洲免费av第一区第二区| 手机看片久久第一人妻| 蜜桃无码一区二区三区| 国产精品无码Av在线播放小说| 一区二区三区在线免费av| 国产一级一级内射视频| 人人爽久久涩噜噜噜av| 亚洲伊人久久成人综合网| 中文字幕日韩一区二区不卡| 久久久久99精品成人片欧美 | 亚洲av伊人久久综合密臀性色| 国产在线拍偷自拍偷精品| 亚洲精品一区二在线观看| 亚洲日韩精品一区二区三区无码| 日本三级欧美三级人妇视频| 草莓视频中文字幕人妻系列| 国产午夜福利小视频在线观看| 亚洲国产精品久久艾草| 欧美巨大xxxx做受l| 久久精品国产亚洲AV古装片| 国产情侣亚洲自拍第一页| 永久黄网站免费视频性色| 免费视频一区二区| 日本成年少妇人妻中文字幕 | 日本中文字幕一区二区高清在线| 国产农村妇女毛片精品久久久| 中文字幕一区二区三区在线看一区| 成年美女黄网站色大免费视频 | 精品国产一品二品三品| 亚洲国产精品不卡av在线| 国产精品无码a∨精品影院| 日韩美女高潮流白浆视频在线观看| 一区二区三区精品免费| 亚洲图片日本视频免费| 国产在线不卡AV观看|