彭輝，潘百玲，李忍，鄧景致，李志江，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心）

魯氏酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）可以在高鹽高糖或偏酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)，在傳統(tǒng)發(fā)酵食品增香中具有重要增香作用，是醬油和豆醬等釀造時(shí)主要的發(fā)酵劑和增香菌株[1]。4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2，5-dimethyl-3（2H）-furanone，HDMF）是一種類似菠蘿風(fēng)味的香料，首次在菠蘿中分離得到，在食品和煙草行業(yè)中具有較高的商業(yè)價(jià)值[2]。

天然HDMF 主要利用微生物合成法生產(chǎn)，Z.rouxii是被報(bào)道用于微生物合成HDMF 常見的菌種[3]。果糖-1，6-二磷酸（Fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP）是魯氏酵母菌代謝產(chǎn)生HDMF 的重要前體物質(zhì)[4]，經(jīng)2，3-烯醇化和脫磷酸作用后，形成的1-脫氧-2，3-鄰?fù)?6-磷酸-己糖經(jīng)去磷酸和NAD（P）H-醌氧化還原酶1 〔NAD （P）H：quinone oxidoreductase，NQO1〕作用，得到中間產(chǎn)物4-羥基-5-甲基-2-亞甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2（or 5）-ethyl-5（or 2）-methyl-3（2H）-furanone，HMMF）。烯醇式HMMF 經(jīng)線粒體內(nèi)醌氧化還原酶（Quinone oxidoreductase，QOR）作用，在酵母體內(nèi)獨(dú)立的被轉(zhuǎn)化為HDMF[5]。因此，QOR 是酵母菌利用FBP 代謝合成HDMF 重要催化酶。

酚類物質(zhì)在有氧條件下易被氧化成醌類化合物。醌類物質(zhì)自發(fā)失去電子變成半醌，在QOR 催化下將半醌還原為對(duì)苯二酚，對(duì)苯二酚在有氧條件下被再氧化成半醌中間體，形成QOR 催化還原反應(yīng)的底物[6]。對(duì)苯二酚和1，4-萘醌是QOR 催化的底物，QOR 催化鄰位醌和1，4-萘醌的效率最高[7]，但在魯氏酵母菌中鮮有利用外源酚和醌類物質(zhì)底物提供魯氏酵母菌代謝合成HDMF 報(bào)道。因此，研究利用魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌為菌株，在反應(yīng)體系中添加對(duì)苯二酚和1，4-萘醌，為QOR 提供外源底物使魯氏酵母菌代謝合成HDMF。旨在提高魯氏酵母菌代謝合成HDMF 提供數(shù)據(jù)支撐，為推進(jìn)HDMF 的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基

魯氏酵母菌中國普通微生物菌種保藏管理中心（菌種保藏編號(hào)為No.32899）；魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏；YPD 液體培養(yǎng)基（20 g·L-1蛋白胨，20 g·L-1葡萄糖，10 g·L-1酵母提取物）青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑與儀器

HDMF 標(biāo)品美國Sigma 公司；甲醇、乙腈和甲酸為色譜級(jí)山東浩中化工科技有限公司；對(duì)苯二酚（99%）和1，4-萘醌（98%）均為分析純上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純青島市捷盛化工物資有限公司；次甲基藍(lán)上海正劑化工科技有限公司；TRIzol 美國Invitrogen 公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒日本東洋紡公司。

LDZM 立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2G 超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-QX 臺(tái)式高速離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；YKSD-1000 倒置顯微鏡上海永科光學(xué)儀器有限公司；CFX96TM 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器美國Bio-Rad 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng)

參考周亞男等[8]方法并稍作改動(dòng)。取凍存的魯氏酵母QOR基因過表達(dá)工程菌菌株干粉，無菌條件下接入100 mL YPD 液體培養(yǎng)基中，在全溫振蕩器中28 ℃、180 rpm 條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)定細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2.5～3.0×108CFU·mL-1備用。

1.2.2 對(duì)苯二酚和1，4-萘醌濃度與作用時(shí)間對(duì)魯氏酵母菌合成HDMF 的影響

配置1、10、50 和100 μg·mL-1的對(duì)苯二酚，分別利用有機(jī)過濾膜過濾后加入到滅菌的YPD 液體培養(yǎng)基中，再將活化的魯氏酵母原菌和工程菌按5%比例接種到不同濃度對(duì)苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基中，以不加對(duì)苯二酚溶液的YPD 培養(yǎng)基作為對(duì)照，在28 ℃和180 rpm 進(jìn)行培養(yǎng)，以HDMF 產(chǎn)量為指標(biāo)篩選對(duì)苯二酚最優(yōu)濃度。配置1、10、50 和100 mg·L-1的1，2-萘醌，按上述條件進(jìn)行1，2-萘醌濃度的篩選。在滅菌的液體培養(yǎng)基中加入篩選的對(duì)苯二酚和1，4-萘醌濃度，將活化至相同菌數(shù)的魯氏酵母原菌和工程菌按5%分別接種到培養(yǎng)基中，于28 ℃和1 80 rpm 條件下，分別培養(yǎng)0～7 d。用移液槍精確量取菌液2 mL，8 000 rpm，離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后，分析HDMF 產(chǎn)量，篩選作用時(shí)間。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定

QOR 基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），以PGADH作為內(nèi)參基因合成引物（上海生工生物技術(shù)公司合成）。將魯氏酵母原菌和轉(zhuǎn)化后的QOR工程菌同時(shí)活化到細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2.0～2.5×108CFU·mL-1，取5%活化后的菌液加入100 mL 滅菌后YPD 液體培養(yǎng)基中（原菌為對(duì)照組，QOR工程菌為處理組）。將培養(yǎng)的魯氏酵母菌懸液于4 ℃，12 000 rpm 離心3 min，棄上清，將菌體于液氮中研磨至白色粉末狀，并裝入到1.5 mL Eppendorf 管中，利用Trizol 法提取RNA[9]。將提取的酵母RNA 利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。為了保證后期qRT-PCR的質(zhì)量，對(duì)上一步得到的cDNA 進(jìn)行普通PCR 驗(yàn)證，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 使用THUNDERBIRD SYBR ? qPCR Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。PCR 程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，共39 個(gè)循環(huán)[10]。設(shè)定YPD 組中0 d 的GAPDH表達(dá)量為1，分別測(cè)定轉(zhuǎn)錄組挖掘的碳代謝通路待測(cè)基因表達(dá)量，每次測(cè)試設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3 個(gè)技術(shù)性重復(fù)。采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。分別在培養(yǎng)0～7 d 后取樣，測(cè)定QOR基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 主要引物序列設(shè)計(jì)Table 1 Main primers sequence design

HDMF 產(chǎn)量測(cè)定參考Li 等[11]方法。取培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃條件下8 000 rpm 離心10 min，精準(zhǔn)吸取2 mL 上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC測(cè)定HDMF 含量：UPLC BEH-Amide（1.7 μm，2.1×100 mm）；流動(dòng)相0.5%甲酸和乙腈；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm。將1 mg·L-1的HDMF 標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋制成2、5、15、20、40 和80 mg·L-1的HDMF 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，在上述條件下制定HDMF 標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)各發(fā)酵液組別的HDMF 進(jìn)行定量。

菌落形態(tài)及活細(xì)胞數(shù)測(cè)定取培養(yǎng)0～7 d 的發(fā)酵液置于載玻片上，用次甲基藍(lán)對(duì)其染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，確定對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)酵母菌細(xì)胞形態(tài)的影響。發(fā)酵液中菌數(shù)測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)均重復(fù)測(cè)定3 次，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS25.0、Graphpad Prism 8.0 進(jìn)行分析作圖，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)法分析組間差異顯著性，P＜0.05 表示實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)苯二酚和1，4-萘醌濃度對(duì)魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量的影響

在微生物培養(yǎng)基中添加外源底物、電子受體或相關(guān)碳源，可通過電子受體等方式促進(jìn)NADH 氧化進(jìn)而維持還原能力的平衡[13]。NQO1 催化醌類還原發(fā)生反應(yīng)使醌類及其衍生物降解，減少細(xì)胞損傷，也可催化醌雙電子還原為對(duì)苯二酚[14]。在魯氏酵母菌中添加外源底物FBP，與呋喃酮合成相關(guān)的糖酵解（EMP）和磷酸戊糖途徑（PP）的關(guān)鍵基因和酶得到顯著上調(diào)，促進(jìn)HDMF 的合成[15]。但關(guān)于對(duì)苯二酚和1，4-萘醌為外源底物調(diào)控魯氏酵母菌合成的研究鮮有報(bào)道。

以對(duì)苯二酚和1，4-萘醌為外源底物，探索其對(duì)魯氏酵母菌代謝合成HDMF 產(chǎn)量影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)對(duì)苯二酚的濃度為10 μg·mL-1時(shí)HDMF 產(chǎn)量最高，為3.2 mg·L-1；1，4 萘醌濃度為10 mg·L-1時(shí)HDMF 產(chǎn)量最高，為2.86 mg·L-1。兩組實(shí)驗(yàn)組HDMF的產(chǎn)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明添加適量濃度的對(duì)苯二酚和1，4-萘醌可以促進(jìn)魯氏酵母菌內(nèi)QOR 催化反應(yīng)生成HDMF。同時(shí)，對(duì)苯二酚組HDMF產(chǎn)量略高于1，4-萘醌組，但兩種外源底物如何參與調(diào)控NQO1 活性，促進(jìn)HMMF 轉(zhuǎn)化為HDMF 機(jī)制尚不明確。

圖1 兩種外源底物的濃度對(duì)HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of two substrates concentration on HDMF production

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)魯氏酵母菌合成HDMF 產(chǎn)量影響

作用時(shí)間的延長(zhǎng)，有助于外源添加物進(jìn)入酵母菌生長(zhǎng)和代謝體系，影響HDMF 的相關(guān)反應(yīng)與合成。隨著時(shí)間的增加，兩種外源底物與酶促反應(yīng)的效率會(huì)得到提升，可能為HDMF 合成產(chǎn)量起到促進(jìn)作用。當(dāng)對(duì)苯二酚和1，4-萘醌濃度分別為10 μg·mL-1和10 mg·L-1時(shí)，與對(duì)照組（0 d）相比較，添加對(duì)苯二酚后至3 d 時(shí)，HDMF 產(chǎn)量顯著升高（P＜0.05），4～7 d后緩慢下降，在3 d 時(shí)含量達(dá)到最高3.2 mg·L-1（圖2）；添加1，4-萘醌至5 d 時(shí)HDMF 產(chǎn)量顯著升高（P＜0.05），6～7 d 緩慢下降，在5 d 時(shí)含量達(dá)到最高3.09 mg·L-（1圖2）。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HDMF 產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of culture time on HDMF production

HDMF 的產(chǎn)量在發(fā)酵后期隨著底物消耗而逐漸降低，這與李志江等[16]研究結(jié)果相類似，在豆醬中添加魯氏酵母發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)HDMF 含量在發(fā)酵后期逐漸降低并趨于平緩。

2.3 對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)魯氏酵母菌QOR 基因表達(dá)量的影響

酚類化合物很容易被氧化，而多元酚則更容易被氧化，其產(chǎn)物為醌類化合物。醌類物質(zhì)作為醌氧化酶的底物，有利于QOR催化反應(yīng)并進(jìn)一步促進(jìn)HDMF 的形成[17]。在氧化應(yīng)激條件下，醌氧化還原酶活性的增高，它的作用方式之一就是以HADPH 和FAD 為輔基，催化兩個(gè)電子的反應(yīng)，將異生質(zhì)醌還原成氫醌，其底物通常是對(duì)位醌[18]，生成的氫醌隨后會(huì)被后續(xù)的酶偶聯(lián)，并排出體外以達(dá)到QOR基因過量表達(dá)。QOR也可以催化多種醌的還原反應(yīng)，其中對(duì)于鄰位醌和1，2-萘醌的催化效率最高[7]，因此實(shí)驗(yàn)選用對(duì)苯二酚和1，2-萘醌作為QOR底物調(diào)控魯氏酵母工程菌產(chǎn)HDMF。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證外源添加對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌產(chǎn)HDMF 的影響，對(duì)其目的基因QOR相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。添加對(duì)苯二酚培養(yǎng)至第3 天時(shí)，QOR基因相對(duì)表達(dá)量最高為5.02，與對(duì)照組相比較顯著提升（P＜0.05）；添加1，4 萘醌培養(yǎng)到5 d 時(shí)QOR基因相對(duì)表達(dá)量為3.9（P＜0.05）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果可知，未添加該底物的培養(yǎng)基中QOR表達(dá)量在3 d 時(shí)產(chǎn)量最高為2.3 左右（課題組未發(fā)表數(shù)據(jù)）。因此，對(duì)苯二酚可以提高QOR相對(duì)表達(dá)量約2.2 倍；1，4-萘醌可以提高QOR相對(duì)表達(dá)量約1.7 倍。添加對(duì)苯二酚相比于1，4-萘醌的QOR表達(dá)量提高了1.3 倍。因此，通過添加兩種外源底物，促進(jìn)了魯氏酵母菌QOR基因過量表達(dá)。

圖3 兩種底物對(duì)QOR 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of two substrates on QOR gene relative expression

圖4 兩種底物對(duì)活菌數(shù)量的影響Fig.4 Effect of two substrates on the number of live bacteria

2.4 對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)魯氏酵母菌細(xì)胞數(shù)的影響

由文獻(xiàn)可知，篩選10 μg·mL-1的對(duì)苯二酚濃度（0.01%）適于人體接受的作用劑量[19]，也低于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的安全劑量（0.044%）[20]，1，4-萘醌濃度達(dá)到10 mg·L-1時(shí)對(duì)真菌不存在顯著致敏性[21]。因此，研究選用對(duì)苯二酚和1，4-萘醌適于本實(shí)驗(yàn)魯氏酵母菌的外源底物，參與魯氏酵母菌胞內(nèi)QOR催化反應(yīng)。

對(duì)添加對(duì)苯二酚與1，4-萘醌的魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌進(jìn)行細(xì)胞數(shù)的測(cè)定，顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定活細(xì)胞數(shù)目（圖5）。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組活菌數(shù)均呈先增高后下降的趨勢(shì)，加入對(duì)苯二酚活菌數(shù)在3 d 時(shí)最多，加入1，4-萘醌活菌數(shù)在5 d 時(shí)最多（P＜0.05）。李昕等[15]研究表明，魯氏酵母活菌數(shù)目越高，產(chǎn)生的HDMF 越多，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由此可知，添加對(duì)苯二酚與1，4-萘醌可以促進(jìn)魯氏酵母QOR過表達(dá)工程菌的生長(zhǎng)。

圖5 兩種底物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of two substrates on cell morphology

2.5 對(duì)苯二酚和1，4-萘醌對(duì)魯氏酵母菌細(xì)胞形態(tài)的影響

盡管對(duì)苯二酚和1，4-萘醌能夠促進(jìn)魯氏酵母細(xì)胞數(shù)目的增加，但也會(huì)對(duì)菌體形態(tài)造成潛在的影響。高濃度對(duì)苯二酚急性暴露處理釀酒酵母，通過增加活性氧導(dǎo)致菌體細(xì)胞凋亡調(diào)控基因、磷脂和中性脂水平高表達(dá)，抑制了酵母菌細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。1，4-萘醌可通過2 位羥基或甲氧基作用，與菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)發(fā)生作用，破壞真菌細(xì)胞壁致死菌體[21]。

通過觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)可直觀的比較外源添加底物對(duì)其產(chǎn)生的影響。取0、1、3、5、7 d 發(fā)酵液用次甲基藍(lán)對(duì)其染色后，由于細(xì)胞浸于次甲基藍(lán)溶液時(shí)，色素滲入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞內(nèi)的還原酶能使其脫色，但死細(xì)胞內(nèi)的還原酶失活，不能產(chǎn)生脫色作用，被染成藍(lán)色（圖4 中呈黑色菌體）[22]。因此藍(lán)色的死細(xì)胞不能再產(chǎn)HDMF，未被染色的活細(xì)胞可繼續(xù)產(chǎn)HDMF。結(jié)果如圖4 所示，加入兩種外源底物后原菌及轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞均呈小圓形或橢圓形，聚集在一起，且死亡率低，這與Liu 等[23]研究中的魯氏酵母細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)相一致。說明添加對(duì)苯二酚與1，4-萘醌對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及活性未產(chǎn)生較大的致死影響，但致死率及抑制機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

在魯氏酵母QOR基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入對(duì)苯二酚和1，4-萘醌，測(cè)定發(fā)酵液中HDMF含量以及對(duì)菌體生長(zhǎng)活性產(chǎn)生的影響。通過添加最適濃度的對(duì)苯二酚和1，4-萘醌，培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，兩實(shí)驗(yàn)組中QOR基因相對(duì)表達(dá)量均成倍數(shù)升高，QOR催化加速FBP 代謝合成HDMF。同時(shí)酵母活細(xì)胞數(shù)量增加，且菌體形態(tài)未發(fā)生改變。當(dāng)外源酚類和醌類達(dá)到最佳添加量時(shí)，酚類產(chǎn)出HDMF 的含量是醌類的1.12 倍。研究證明利用外源酚類和醌類可作為QOR反應(yīng)底物促進(jìn)魯氏酵母工程菌生產(chǎn)HDMF，但具體調(diào)控機(jī)制還有待考究。因此，外源添加對(duì)苯二酚和1，4-萘醌可在不影響魯氏酵母工程菌生長(zhǎng)時(shí)，提高HDMF 的產(chǎn)量，為今后實(shí)現(xiàn)低成本，高產(chǎn)量制備天然HDMF 提供一定的試驗(yàn)依據(jù)。