楊超， 韓海斌， 韋波， 張衡*， 商宸， 蘇冰，劉思源， 蔣沛雯， 相德龍

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所， 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海 200090； 2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306； 3.大連海洋大學(xué)船舶與工程學(xué)院，遼寧 大連 116000； 4.安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

準(zhǔn)確評估魚類年齡結(jié)構(gòu)是漁業(yè)種群生物學(xué)研究的基本要求，高準(zhǔn)確率的年齡結(jié)構(gòu)組成是研究魚類生活史、種群增長率和資源評估的基礎(chǔ)，直接影響到魚類資源評估以及管理政策的制訂[1]。鑒定魚類年齡的方法較多，20世紀(jì)常用的方法是采用體長頻率來鑒定年齡組成[2]，近年來較為常用的方法是通過魚體上硬組織（如耳石、鱗片、脊椎骨等）的輪紋識別魚類的年齡[3]。在所有硬組織中，鱗片與耳石是較好的鑒定材料[4]，鱗片較易獲得，但其易脫落性與再生性常會導(dǎo)致評估不準(zhǔn)確。丘吉諾娃1956年在《魚類年齡和生長的研究方法》[5]中首次提出將魚類耳石作為年齡鑒定的材料之一，根據(jù)耳石上的輪紋進(jìn)行鑒定，到目前為止仍是使用最廣泛的方法之一。耳石是由碳酸鈣等組成的硬組織,存在于硬骨魚類內(nèi)耳的膜迷路內(nèi),共3對,即矢耳石(sagittal)、微耳石(lapillus)和星耳石(asteriscus),擔(dān)當(dāng)著平衡器官和聽覺器官的功能，因矢耳石在3對耳石中最大,易于觀察,且信息記錄準(zhǔn)確，因此通常被用作魚類年齡鑒定的首選材料[6-11]。

遠(yuǎn)東擬沙丁魚（Sardinops sagax）作為一種暖溫性小型中上層硬骨魚類，是世界上漁獲量較高的中上層魚類之一，但在歷史上遠(yuǎn)東擬沙丁魚經(jīng)歷過數(shù)次資源變動期，其資源量極不穩(wěn)定，歷史上產(chǎn)量最低時（20世紀(jì)60年代）不足十萬t，產(chǎn)量最高時（20世紀(jì)80年代）可達(dá)數(shù)百萬t，因此準(zhǔn)確利用其年齡結(jié)構(gòu)對其資源量進(jìn)行評估是合理利用遠(yuǎn)東擬沙丁魚漁業(yè)資源的關(guān)鍵所在[12-13]。遠(yuǎn)東擬沙丁魚的棲息環(huán)境有明顯的季節(jié)性變化，該變化導(dǎo)致其耳石形成速度在一年中分為2個階段，生長速度較快時耳石由蛋白質(zhì)基質(zhì)形成寬闊不透明帶，生長速度較慢時耳石由碳酸鈣晶體形成狹窄透明帶。在不透明帶與透明帶之間的界面稱為輪紋，該輪紋結(jié)構(gòu)常用于遠(yuǎn)東擬沙丁魚的年齡鑒定[14]。關(guān)于遠(yuǎn)東擬沙丁魚的年齡鑒定，目前常用的是通過耳石輪紋法來進(jìn)行觀察，通過2個專業(yè)人士的共同鑒定，得出耳石樣本年齡，但該方法受人為主觀的影響較大，需要鑒定者具有豐富的經(jīng)驗以及大量時間來進(jìn)行判斷，易導(dǎo)致其年齡結(jié)構(gòu)的偏差。此外，該方法常受到耳石上副輪及干擾輪的影響，進(jìn)而導(dǎo)致評估結(jié)果的不準(zhǔn)確[15]。

為尋求一種更加客觀的方法對年齡進(jìn)行鑒定，國內(nèi)外常用生物學(xué)參數(shù)與年齡的回歸關(guān)系進(jìn)行年齡的鑒定[6,16-19]。本文在使用回歸關(guān)系的基礎(chǔ)上增加深度學(xué)習(xí)的方法來進(jìn)行遠(yuǎn)東擬沙丁魚的年齡鑒定。深度學(xué)習(xí)是機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域中一個新的方向，其概念源于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究。深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（deep neural networks，DNN）是深度學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)，目前被廣泛應(yīng)用于人臉識別、衛(wèi)星遙感等諸多領(lǐng)域[20-21]，但是在漁業(yè)生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較少，主要是因為生物學(xué)樣本難采集，數(shù)據(jù)獲取難度大，數(shù)據(jù)量少，從而導(dǎo)致模型很難取得預(yù)期效果，本文嘗試搭建較新的深度學(xué)習(xí)模型并利用現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行模擬，以期獲取更好的年齡鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料采集及測量

漁獲物樣品采自北太平洋公海的商業(yè)捕撈船隊作業(yè)海域（39°—43°N、147°—153°E），于2020和2021年的4—11月每月經(jīng)船隊在捕獲樣品中按照叉長從小到大進(jìn)行隨機(jī)采樣100～200尾并冷凍保存，運回實驗室用于生物學(xué)指標(biāo)測定，生物學(xué)指標(biāo)的測量按照《海洋調(diào)查規(guī)范》[22]規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，測量指標(biāo)包括叉長（fork length，L）（自吻端至尾叉的長度）、體質(zhì)量（weight，W）、耳石重量（otolish weight，W0），所有樣品共計2 664尾，其中948尾樣品取耳石，詳見表1。

表1 遠(yuǎn)東擬沙丁魚叉長、體質(zhì)量和耳石重量信息Table 1 Information of fork length，weight and otolish weight of Sardinops sagax

使用超聲波清洗機(jī)清洗耳石表面的粘液和包膜，在60 ℃的烘箱中烘烤24 h，去除表面水分，干燥冷卻到常溫后，使用電子天平（ZA305AS，上海贊維）對耳石進(jìn)行稱重。清洗、干燥之后的耳石進(jìn)行包埋處理，將耳石的聽溝一面朝下放置于載玻片上，使用UV膠進(jìn)行包埋，紫外線燈照射固定。將包埋好的樣品置于萊卡光學(xué)顯微鏡（DM750，德國萊卡）10倍物鏡下，觀察耳石輪紋并通過顯微鏡成像設(shè)備拍照。

1.2 耳石處理及數(shù)據(jù)分析

1.2.1 基于輪紋觀察法的年齡判讀 按照傳統(tǒng)方法處理之后的耳石輪紋結(jié)構(gòu)不明顯，難以通過輪紋觀察其年齡（圖1A）；通過UV膠包埋處理后的耳石，經(jīng)透射光照射并通過光學(xué)顯微鏡拍照可得到較為清晰的輪紋（圖1B）。然而，包埋之后再經(jīng)手動研磨的耳石表面輪紋結(jié)構(gòu)沒有明顯變化（圖1C）。經(jīng)過對比，圖1B的包埋方法是最為合適的耳石處理方法。

圖1 遠(yuǎn)東擬沙丁魚耳石Fig. 1 Otolith image of the Sardinops sagax

參考Mcfarlane等[23]的方法，確定遠(yuǎn)東擬沙丁魚耳石輪紋鑒定標(biāo)準(zhǔn)：半透明環(huán)必需在耳石表面連續(xù)出現(xiàn)，如果半透明環(huán)與另1個環(huán)合并或者未能在整個耳石表面出現(xiàn)，則被視為假環(huán)；最外層的不透明環(huán)不算做完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，除非在該環(huán)之外仍能觀察到另1個不透明環(huán)。每一個遠(yuǎn)東擬沙丁魚耳石都由2人獨自研判，分別計數(shù)。如果2人計數(shù)相同，則認(rèn)為年齡判讀正確，接受該結(jié)果；若2人計數(shù)的年輪數(shù)不同，則重新進(jìn)行判讀、計數(shù)，并對最終結(jié)構(gòu)進(jìn)行討論，若達(dá)成一致則接受該結(jié)果，否則放棄。將通過輪紋觀察法最終得出一致的年齡鑒定結(jié)果作為耳石年齡標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 線性擬合公式 分別擬合矢耳石的重量與年齡，魚體叉長與年齡，魚體質(zhì)量與耳石年齡的一元線性回歸方程，比較其擬合回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R2）。在此基礎(chǔ)上增加多元線性擬合并與一元線性擬合相比較，相關(guān)系數(shù)（R2）最高的為最佳擬合方程。最后使用最佳擬合方程進(jìn)行年齡鑒定，本文所有數(shù)據(jù)擬合及相關(guān)系數(shù)數(shù)值分別通過Excel 2016及Origin模擬實現(xiàn)。

1.3 深度學(xué)習(xí)模型構(gòu)建

1.3.1 模型構(gòu)建 結(jié)合當(dāng)前已獲得的耳石的質(zhì)量、魚體叉長、魚體質(zhì)量以及其對應(yīng)的年齡4組數(shù)據(jù)，搭建深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對3組數(shù)據(jù)進(jìn)行訓(xùn)練。其中，本文的自建神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)整體框架如圖2所示。

圖2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)整體框架Fig. 2 Whole framework of self-built neural network

將沙丁魚的叉長、體質(zhì)量以及對應(yīng)的耳石質(zhì)量作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集輸入，其中每尾魚的測量指標(biāo)作為1組數(shù)據(jù)，同時將對應(yīng)的年齡作為驗證集，按照訓(xùn)練集80%、驗證集20%比例進(jìn)行訓(xùn)練。全部數(shù)據(jù)均轉(zhuǎn)化為Tensor數(shù)據(jù)類型。模型的整體流程為：將原始的3維數(shù)據(jù)魚體叉長、魚體質(zhì)量與耳石質(zhì)量通過Linear操作提升到700維；運用線性激活函數(shù)(rectified linear unit，ReLU)方法將部分神經(jīng)元的輸出變?yōu)?，使網(wǎng)絡(luò)具有稀疏性，同時減少參數(shù)的相互依存關(guān)系，緩解模型過擬合；調(diào)用Linear操作將模型上升到2 048維以使模型的特征更為明顯；加入一個ReLU操作，將模型的維度提高至4 096維，達(dá)到特征最為明顯的效果；對模型進(jìn)行降維操作，將4 096維降至1 024維，使模型的特征進(jìn)行融合。進(jìn)行2次Linear操作，將模型降至其7維對應(yīng)0、1、2、3、4、5、6。最后將所輸出的7維結(jié)果與驗證集相比較，得出模型的最終結(jié)果。

式中，y為輸出結(jié)果；x為輸入?yún)?shù)；B為權(quán)重矩陣；T為將矩陣轉(zhuǎn)置；b表示偏置。

式中，t為ReLU函數(shù)的輸出結(jié)果；max()0,a表示將a＜0的數(shù)全部轉(zhuǎn)為0，a≥0的則保持不變。

1.3.2 模型評價指標(biāo) 實際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果相符，為真陽性（true positive，NTP）；實際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果不符，為假陽性(false positive，NFP)；預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果均不符，為真陰性（true negative，NTN）；預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果不符，為假陰性（false negative，NFN），其表達(dá)式如下。

式中，Ppre指將正確預(yù)測出來的正樣本數(shù)量占所有預(yù)測出來的樣本數(shù)量的比率，Prec指將正確預(yù)測出的正樣本數(shù)量和所有的正樣本數(shù)量的比率。

在深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，通常采用損失率（Ploss）、平衡F分?jǐn)?shù)（PF1）、準(zhǔn)確率和召回率等指標(biāo)對模型進(jìn)行評價[25]。

Ploss為真實值與預(yù)測值之間的差值，損失值越小表明結(jié)果距離真實值越接近，該指標(biāo)使用交叉熵?fù)p失函數(shù)，其表達(dá)式如下。

式中，P（x）為對應(yīng)年齡值的取值；q（x）為相對應(yīng)概率值。

F1-score是Prec和Ppre的調(diào)和值，綜合考慮了召回率和精準(zhǔn)率對試驗數(shù)據(jù)的影響，避免某一指標(biāo)來主導(dǎo)試驗結(jié)果，其表達(dá)式如下

本文深度模型搭建及模型效果評價均通過Python 3.7.11實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 年齡與耳石質(zhì)量、體質(zhì)量、叉長的關(guān)系

2.1.1 年齡鑒定比例分析 成對t檢驗結(jié)果分析顯示，遠(yuǎn)東擬沙丁魚的左、右耳石質(zhì)量并無明顯差異(P＞0.05)，因此選用左側(cè)矢耳石進(jìn)行輪紋觀察并鑒定年齡。鑒定結(jié)果(圖3)表明，樣本年齡中1+、2+和3+的個體占據(jù)50%以上，表明遠(yuǎn)東擬沙丁魚種群年輕個體占比較高。

圖3 耳石輪紋觀察法所得各年齡組成比例Fig. 3 Age composition of otolith ring observation method

2.1.2 生物學(xué)數(shù)據(jù)對應(yīng)年齡分布箱型圖分析 對年齡分布與耳石質(zhì)量、叉長和體質(zhì)量的箱形圖（圖4）的分析結(jié)果表明，遠(yuǎn)東擬沙丁魚的耳石質(zhì)量、叉長和體質(zhì)量在1+～5+的年齡組間均有重疊，5+～6+的年齡組間無重疊。雖然重疊部分較多，但箱形圖中耳石質(zhì)量、魚體叉長和魚體質(zhì)量的均值與中值隨著年齡組的增大而表現(xiàn)的增長趨勢仍非常明顯，表明耳石質(zhì)量、魚體叉長和魚體質(zhì)量均隨著年齡的增大而增長。

圖4 遠(yuǎn)東擬沙丁魚耳石質(zhì)量、叉長和體質(zhì)量對應(yīng)年齡分布的箱形圖Fig. 4 Box diagram of otolith weight ， fork length and weight to age distribution of Sardinops sagax

2.2 回歸方程擬合及應(yīng)用

2.2.1 最佳擬合方程 在單變量擬合回歸方程中，通過對比各函數(shù)關(guān)系，得出相關(guān)系數(shù)（R2）最高的線性擬合關(guān)系可以作為年齡與各生物學(xué)參數(shù)的最佳擬合公式。耳石質(zhì)量（W0）與年齡（A）、魚體質(zhì)量（W）與年齡（A）、叉長（L）與年齡（A）的最佳擬合方程分別如公式（7）～（9）所示。

通過分析一元擬合方程的相關(guān)系數(shù)，得出耳石質(zhì)量與魚類年齡的相關(guān)性最高，對比可知，耳石質(zhì)量與耳石年齡的擬合程度最高，因此將耳石質(zhì)量所預(yù)測的年齡作為一元擬合鑒定年齡。

通過3個變量即耳石質(zhì)量、叉長與體質(zhì)量擬合年齡的公式如下。

通過相關(guān)系數(shù)最高的單變量耳石質(zhì)量與年齡擬合方程公式如下。

2.2.2 擬合回歸方程鑒定年齡驗證對比 通過耳石質(zhì)量與年齡的一元擬合法鑒定年齡和用多個生物學(xué)特征的多元擬合法所得出的年齡結(jié)構(gòu)，與輪紋觀察法得出的年齡結(jié)構(gòu)相比無顯著差異（P=0.956＞0.05;P=0.93＞0.05）（圖5）。

圖5 實測輪紋觀察法年齡與線性擬合回歸鑒定的年齡Fig. 5 Age identified by measured surface observation and linear fitting regression

2.3 模型訓(xùn)練結(jié)果分析

如圖6所示，模型經(jīng)過3 000次訓(xùn)練達(dá)到穩(wěn)定結(jié)果。隨著迭代次數(shù)增加到3 000次，該模型識別年齡的精度穩(wěn)定在0.716；由召回率與迭代次數(shù)的關(guān)系圖可知，隨著迭代次數(shù)增加到3 000次，模型識別年齡的召回率接近0.6。圖6中的F1值可以表明試驗方法的有效性，在訓(xùn)練迭代次數(shù)達(dá)到3 000次，F(xiàn)1值逐漸穩(wěn)定在0.61左右。從損失率與迭代次數(shù)的關(guān)系可知，隨著迭代次數(shù)的增加，模型的損失率也逐漸降低，直到穩(wěn)定在1.24以下。

圖6 深度學(xué)習(xí)模型的精度、召回率、損失率和F1值與訓(xùn)練次數(shù)迭代圖Fig. 6 Iteration diagram of accuracy、recall rate、loss rate、F1 value and training times

2.4 鑒定準(zhǔn)確率結(jié)果比較分析

將所有鑒定樣本輸入自建深度學(xué)習(xí)模型，通過訓(xùn)練所得的鑒定結(jié)果與輪紋觀察法所得年齡對比無誤差的情況下，深度學(xué)習(xí)模型取得的最大準(zhǔn)確率為71.6%（表2）。

表2 3種方法鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確率Table 2 Prediction accuracy results of three methods

3 討論

使用擬合回歸方程鑒定年齡的方法是Boehlert在1985年首次提出[6]，利用多個關(guān)于耳石的變量即耳石質(zhì)量、耳石長度等構(gòu)建回歸方程預(yù)測年齡。國內(nèi)使用擬合回歸方程鑒定年齡多見于淡水魚類中耳石質(zhì)量與年齡的回歸關(guān)系[16,26]。本文采用的擬合回歸方程，分別分析了叉長、體質(zhì)量和耳石質(zhì)量與年齡的擬合公式并比較其相關(guān)性，通過對比發(fā)現(xiàn)，耳石質(zhì)量與年齡的相關(guān)性最高，其R2超過0.80。通過擬合曲線得出的遠(yuǎn)東擬沙丁魚年齡結(jié)構(gòu)經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，其與輪紋觀察法所得到的年齡結(jié)構(gòu)并無差異，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)使用多元擬合方程進(jìn)行年齡鑒定的準(zhǔn)確率高于一元擬合方程。使用擬合回歸方法最大的優(yōu)點是簡單易得，但是該方法也具有缺陷性：其一是必須對預(yù)測數(shù)據(jù)與現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)行乘冪或者使用對數(shù)等其他方法進(jìn)行變換以獲取線性關(guān)系，這將導(dǎo)致數(shù)據(jù)的變動從而影響預(yù)測結(jié)果[27-31]；其二是使用該方法會產(chǎn)生年齡估計比例的漸進(jìn)偏差，從而導(dǎo)致預(yù)測結(jié)果產(chǎn)生一定的偏差[7]。因此，本研究嘗試使用新方法即通過構(gòu)建深度學(xué)習(xí)模型對年齡進(jìn)行鑒定，以避免使用擬合回歸方程所導(dǎo)致的漸進(jìn)偏差對遠(yuǎn)東擬沙丁魚年齡結(jié)構(gòu)所帶來的誤差影響。

目前，國際上使用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對魚類年齡進(jìn)行鑒定的相關(guān)研究大多使用耳石圖像[32-33]。在較為常用的經(jīng)典算法中，Seam比較了貝葉斯（Na?ve Bayes，NB）、決策樹(J48)與隨機(jī)森林（random forest, RF）在魚類年齡鑒定方面的應(yīng)用，分別表述了各個模型的特點。NB算法為通過某對象的先驗概率，利用貝葉斯公式計算出其后驗概率，即該對象屬于某一類的概率，選擇具有最大后驗概率的類作為該對象所屬的類；但使用該模型要求建立在數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性較高的基礎(chǔ)上。J48算法為從上到下遞歸的分治策略，選擇某個屬性放置在根節(jié)點，為每個可能的屬性值產(chǎn)生1個分支，將實例分成多個子集，每個子集對應(yīng)1個根節(jié)點的分支，然后在每個分支上遞歸地重復(fù)這個過程，該模型要求不同類之間的數(shù)量差別要盡可能地大。RF是由個別樹輸出的類別的眾數(shù)而定，即根數(shù)特征數(shù)量的多少進(jìn)行分類。在樣本組成不均衡的情況下會導(dǎo)致誤分為其他類。Benzer等[34]通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）與傳統(tǒng)回歸方法分別對莫干湖的北梭子魚（Esox lucius）進(jìn)行年齡預(yù)測，從結(jié)果比較來看ANN方法可以成為線性回歸模型的較好的替代方法。

深度學(xué)習(xí)方法可以根據(jù)多個因素進(jìn)行魚類年齡的自動判別，魚類叉長、體質(zhì)量以及耳石質(zhì)量等生物學(xué)數(shù)據(jù)都可以對魚類年齡進(jìn)行判讀[35-36]。本研究采用的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Linear-Rule）與數(shù)據(jù)匹配度更高，具有更高的準(zhǔn)確率，采用softmax進(jìn)行維度變化，讓不同年齡之間生物學(xué)數(shù)據(jù)特征更加明顯。為評估模型的分類性能，本文模型使用4個指標(biāo)對模型效果進(jìn)行評估，都達(dá)到了較好的結(jié)果。由于該技術(shù)基于可測量的參數(shù)，因此在數(shù)據(jù)處理的適應(yīng)性、年齡的標(biāo)準(zhǔn)化等方面更具優(yōu)勢。此外，通過比較擬合回歸方程與深度學(xué)習(xí)的預(yù)測準(zhǔn)確性可知，該模型的準(zhǔn)確率要遠(yuǎn)高于線性擬合方法。

從檢測結(jié)果來看，深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練的各項指標(biāo)都較好，但從鑒定準(zhǔn)確率來看，雖然深度學(xué)習(xí)模型所鑒定的結(jié)果均高于線性擬合回歸方程，但其鑒定的準(zhǔn)確率還未達(dá)到最佳效果，在之后的工作中應(yīng)當(dāng)增加數(shù)據(jù)量用來訓(xùn)練模型以提高模型預(yù)測的準(zhǔn)確率，從而更好的幫助研究者進(jìn)行遠(yuǎn)東擬沙丁魚年齡鑒定工作。