金鑫， 張璐， 吳鵬， 李萍， 譚偉， 桂明英*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，成都 610061； 2.云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，昆明 650100； 3.四川省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，成都 610066）

靈芝[Ganoderma lucidum（Lesyss ex Fr.）Karst]為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，作為一種重要的食藥用真菌，自古以來就是我國一味傳統(tǒng)的名貴中藥[1]。現(xiàn)代藥理學研究證實，靈芝主要活性物質(zhì)為靈芝多糖、三萜、可溶性蛋白、氨基酸、核苷類等，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、保肝護肝、治療心腦血管疾病等功效[2-4]。靈芝還是吉祥如意的象征，可做成天然的觀賞品靈芝盆景，活躍花卉市場、美化環(huán)境、陶冶情操。制作靈芝盆景需要美麗的外形和鮮艷的顏色，因此，靈芝子實體外形和菌蓋顏色是培養(yǎng)出高觀賞價值靈芝盆景的關(guān)鍵。

光作為植物生長發(fā)育最重要的環(huán)境因素之一，控制并決定著植物的生長、發(fā)育和分化等過程[5]。與植物相比，靈芝主要將光作為一種外界信號，而非能量來源，在不同光照條件下靈芝子實體的生長速度、形狀、代謝產(chǎn)物含量以及各類酶活性特征會發(fā)生相應(yīng)變化。夏至蘭[6]報道，在靈芝的生長期通過控制光照條件、空氣濕度等環(huán)境因素，可培育成外形美觀、喻意吉祥的觀賞植物；孫立晨等[7]通過白膜遮擋處理研究發(fā)現(xiàn)，光照強度越大靈芝中丙二醛含量越高；余吳夢曉等[8]通過藍光和自然光處理栽培靈芝，發(fā)現(xiàn)藍光對靈芝子實體產(chǎn)量有明顯的促進作用，且能夠促進多糖的積累，提高糖代謝相關(guān)酶的活性；郝俊江等[9]研究表明，不同光質(zhì)處理對靈芝子實體產(chǎn)量和靈芝孢子粉產(chǎn)量均有影響，藍色光質(zhì)可以使靈芝子實體維持較高的抗氧化酶活性水平，促進可溶性蛋白合成，從而增強靈芝代謝，延緩靈芝衰老。在靈芝生長過程中，合適的光照強度尤為重要，當光照強度過高時，子實體生長緩慢，菌蓋表面色澤較差；當光照強度較弱時，菌蓋分化困難，柄長，蓋薄，子實體細小。因此，研究不同遮光處理下靈芝生長發(fā)育及抗氧化酶的響應(yīng)，對了解盆景靈芝適應(yīng)逆境的生理機制有重要意義，本研究以盆景靈芝菌株為試驗材料，通過不同光照強度處理，探討遮陽率對盆景靈芝生長及體內(nèi)酶活性的的影響，以期為盆景靈芝的生產(chǎn)栽培提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

以‘盆景靈芝3號’菌株為試驗材料，由四川省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)核技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 段木栽培2019年1—8月在德陽市食用菌專家大院實驗研究基地開展盆景靈芝栽培試驗，在研究地周邊購買櫟樹，選取直徑為8～20 cm樹木，將樹木切割成15 cm長的小原木，選取30 cm×40 cm×0.005 cm的聚丙烯有底菌袋，將原木裝入袋內(nèi)，扎緊口袋，121 ℃高壓滅菌5 h；然后進行接種，25 ℃室內(nèi)發(fā)菌60 d，于4月上旬將發(fā)菌好的短原木下地栽培。

1.2.2 試驗設(shè)計采用黑色遮陽網(wǎng)（江蘇欽農(nóng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司）來控制光照強度，試驗共設(shè)置4個處理，包括露天不遮光（遮陽率0%，T0）和分別采用3針加密遮陽網(wǎng)（遮陽率50%，T1）、6針加密遮陽網(wǎng)（遮陽率70%，T2）和8針加密遮陽網(wǎng)（遮陽率90%，T3）進行遮陽處理。每個處理大棚栽培規(guī)格為：長6 m×寬4 m，高1.8 m，每個處理3次重復(fù)，共計12個栽培棚。每個棚均采用相同盆景靈芝出芝管理方法。

1.2.3 樣品采集 通過短原木大棚栽培獲得盆景靈芝子實體，將盆景靈芝生長分為4個時期：原基形成期（primordium formation stage，S1）、菌柄形成期（stipe formation stage，S2）、菌蓋分化期（cap differentiation stage，S3）和子實體成熟期（fruiting body maturity，S4）。靈芝不同生長期特征如表1和圖1所示。

圖1 盆景靈芝生長的不同時期Fig. 1 Different periods of bonsai Ganoderma lucidum growth

表1 盆景靈芝不同生長期特征Table 1 Characteristics of different growth periods of bonsai Ganoderma lucidum

1.2.4 不同生長時期靈芝子實體活性成分測定分別在靈芝生長的原基形成期（S1）、菌柄形成期（S2）、菌蓋分化期（S3）和子實體成熟期（S4）采集樣品，每個大棚隨機采集9個樣品，進行多糖、三萜和可溶性蛋白含量的測定。多糖含量采用苯酚硫酸法測定[10-11]，三萜含量測定采用香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色法測定[10,12]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[13]。

1.2.5 盆景靈芝不同生長時期體內(nèi)木質(zhì)素酶活性測定 采用隨機混合取樣法，分別在靈芝生長的原基形成期、菌柄形成期、菌蓋分化期、子實體成熟期進行取樣。每個處理采集9個樣品，隨機3個樣品1組，對每組樣品進行酶活性測定，靈芝子實體內(nèi)錳過氧化物酶（manganese peroxidase）和漆酶（laccase）活性的測定方法參考李文濤等[14]和王學奎等[15]方法。

1.2.6 盆景靈芝不同生長時期體內(nèi)抗氧化酶活性的測定 靈芝樣品采集方法同1.2.5，每個樣品取0.1 g，加入4 ℃的磷酸緩沖液5 mL，研磨，在4 ℃10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液用于酶活性測定。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測定采用鄰苯三酚自氧化法[16]，過氧化物酶（peroxidase，POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15]，過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的測定參照Barata等[17]的方法。

1.2.7 盆景靈芝不同生長時期體內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定 參照李合生[13]的方法，取0.1 g樣品，加入5%三氯乙酸5 mL，冰浴研磨，所得勻漿5 000 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL，加0.67%硫代巴比妥酸2 mL，混合后100 ℃水浴30 min，冷卻后5 000 r·min-1下離心10 min。分別測定上清液在532和600 nm處吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2013 軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析；利用IBM SPSS 22軟件進行獨立樣本t檢驗，采用Origin 8.0進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強度對盆景靈芝子實體生長發(fā)育的影響

盆景靈芝子實體生長發(fā)育如表2所示。4個處理的靈芝從下地后7～8 d開始見到原基生長，T0處理的出原基時間較其他處理晚1 d，可見，遮陽處理能促使靈芝提早長出原基。從原基期到菌柄形成期，T2處理的原基個數(shù)最多，達140.58個；T0處理最少，僅113.50個；遮陽處理間原基個數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。菌蓋生長階段（圖2），T0處理的子實體生長較差，生長不整齊，菌蓋形狀呈畸形、不規(guī)則，菌蓋表面顏色較淡，沒有光澤，同時易滋生蟲害；而遮陽處理（T1、T2、T3處理）的子實體均能正常生長成朵形，其中，T1處理菌蓋分化整齊度一般，菌蓋表面呈黃色，光澤度較好；T2處理菌蓋分化整齊度較好，菌蓋表面金黃色，顏色鮮亮，光澤度好；T3處理菌蓋分化整齊度較差，菌蓋邊緣白色明顯，中間呈暗褐色和紅色，光澤度一般。由此可見，光照強度不僅對原基形成時間、原基個數(shù)有影響，還對菌蓋形狀、顏色、光澤度有較大影響，總體來看，70%遮陽率最有利于盆景靈芝生長發(fā)育。

圖2 不同處理下盆景靈芝的生長Fig. 2 Growth of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

表2 不同處理下盆景靈芝子實體的生長發(fā)育Table 2 Growth and development of bonsai Ganoderma lucidum fruiting bodies under different treatments

2.2 光照強度對盆景靈芝子實體農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量的影響

在盆景靈芝子實體成熟階段對靈芝菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度和第一潮子實體干產(chǎn)量進行測量，結(jié)果（表3）表明，T2處理的菌蓋直徑、菌蓋厚度、菌柄長度和產(chǎn)量均表現(xiàn)最好；T1處理次之；而T0處理表現(xiàn)最差；不同處理間均存在顯著差異（P＜0.05）。由此表明，當陽光直曬時，盆景靈芝的菌蓋小、薄，菌柄短，產(chǎn)量低；當遮陽率為50%時，菌蓋的直徑和厚度及菌柄長度、產(chǎn)量顯著增加；當遮陽率達到70%時，菌蓋的直徑和厚度及菌柄、產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)；然而繼續(xù)增加遮陽率，當遮陽率達到90%時，菌蓋的直徑和厚度及菌柄長度、產(chǎn)量則顯著降低?？梢?，盆景靈芝的生長期需要適宜的遮陽率，以70%遮陽率對靈芝的生長效果最佳。

表3 不同處理下盆景靈芝的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量Table 3 Agronomic characteristics and yield of bonsai Ganodermalucidum under different treatments

2.3 光照強度對盆景靈芝不同生長期子實體內(nèi)活性成分含量的影響

由表4可知，不同處理盆景靈芝子實體在原基期、菌柄期、菌蓋期、成熟期多糖和三萜含量的變化趨勢相同，都表現(xiàn)為在原基期含量最低，然后逐漸升高，在成熟期達到峰值；而可溶性蛋白含量在原基期最低，然后逐漸升高，在菌蓋期達到峰值，至成熟期又逐漸下降。多糖含量在靈芝生長的4個時期中均表現(xiàn)為遮陽處理顯著高于T0處理；在遮陽處理中，在原基期和菌柄期，不同處理間多糖含量差異不顯著，而在菌蓋期和成熟期，T2處理顯著高于T1處理，與T3處理差異不顯著，可見，陽光直曬會降低靈芝子實體中的多糖含量，一定程度的遮陽有利于提高子實體多糖含量。4個處理靈芝子實體的三萜含量均在原基期最低，成熟期最高；在原基期，T2含量最高，T0處理次之，T3處理最低；在菌柄期，T1處理最高，T2處理次之，T3處理最低；在菌蓋期和成熟期，T2處理最高，T1處理次之，T3處理最低，可見，遮光率為90%時，靈芝子實體三萜含量較低，不利于子實體內(nèi)三萜的合成，遮光率在0%～70%時，光照對靈芝子實體內(nèi)三萜含量的影響較小。4個處理靈芝子實體內(nèi)的可溶性蛋白含量均在原基期最低，菌蓋期最高；且4個時期均表現(xiàn)為T0處理最高，T1處理次之，T3處理最低，可見，陽光直曬能提高靈芝子實體內(nèi)可溶性蛋白含量，隨著遮陽率的增加，子實體內(nèi)可溶性蛋白含量逐漸降低。

表4 不同處理下盆景靈芝額活性成分含量Table 4 Contents of active ingredients of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.4 光照強度對靈芝不同生長時期體內(nèi)木質(zhì)素酶活性的影響

錳過氧化物酶和漆酶是靈芝生長發(fā)育過程中2種重要的木質(zhì)素降解酶，其活性高低對靈芝木質(zhì)素的降解能力和靈芝品質(zhì)具有重要影響。由圖3可知，光照強度對靈芝不同生長時期體內(nèi)錳過氧化物酶、漆酶活性有顯著影響。錳過氧化物酶在原基期活性最高，然后緩慢降低，到菌蓋期其活性出現(xiàn)急劇下降，成熟期時其活性相對平穩(wěn)；而漆酶在原基期活性最低，然后急劇升高，在菌蓋期活性最高，成熟期時其活性又顯著降低。不同處理間進行比較（圖3），T0處理的錳過氧化物酶、漆酶活性均顯著低于遮陽處理；T2處理的錳過氧化物酶、漆酶活性最高，顯著高于其他處理。4個時期盆景靈芝子實體的錳過氧化物酶、漆酶活性均表現(xiàn)為T2＞T1＞T3＞T0?？梢姡柟庵睍窈透哒陉柭识紩档妥訉嶓w內(nèi)錳過氧化物酶和漆酶活性，而適度遮陽有利于錳過氧化物酶和漆酶活性的提高，以70%遮陽率為宜。

圖3 不同處理下盆景靈芝的木質(zhì)素酶活性Fig. 3 Ligninase activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5 光照強度對盆景靈芝不同生長期體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）是植物抵御外界傷害的重要抗氧化酶，能夠維持體內(nèi)的活性氧代謝平衡。

2.5.1 SOD活性變化 如圖4所示，盆景靈芝在4個時期均表現(xiàn)為T2處理的SOD活性最高，T3處理最低。靈芝從原基期到成熟期，4個處理的SOD活性均表現(xiàn)為先上升后降低，其中，T0處理的增幅最大，T3處理次之，T2處理最小。在原基期，T2和T1處理的SOD活性顯著高于T0和T3處理，T3又顯著低于T0處理。在菌柄期和菌蓋期，T2處理的SOD活性顯著高于其他處理，較T0處理分別顯著增加23.94%和32.52%?？梢姡瑥姽夂腿豕饩鶎ε杈办`芝細胞產(chǎn)生了脅迫，使其體內(nèi)積累了大量的自由基，而70%遮陽率在一定程度上緩解或解除了逆境脅迫，有利于盆景靈芝生長。另外，盆景靈芝處在成熟期時，體內(nèi)SOD活性均呈降低趨勢，這可能是由于盆景靈芝成熟后，體內(nèi)細胞呼吸作用逐漸減弱，逆境脅迫對其造成的影響逐漸變小，從而導(dǎo)致體內(nèi)SOD活性逐漸降低。

圖4 不同處理下盆景靈芝的SOD活性Fig. 4 SOD activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5.2 CAT活性變化 CAT可將H2O2分解為O2和H2O，是一種重要的抗氧化酶。如圖5所示，隨著靈芝的生長發(fā)育，體內(nèi)CAT活性逐漸升高，在菌柄期達到峰值，然后急劇下降，到成熟期降至最低。不同處理間進行比較發(fā)現(xiàn)，在整個生長周期內(nèi)T2處理的CAT活性均最高，顯著高于其他處理，T3處理的CAT活性最低；且T2處理CAT活性在不同時期間的變幅也較大。在原基期、菌柄期、菌蓋期和成熟期，T2處理CAT活性較T3處理分別顯著提高68.41%、69.56%、62.50%和50.00%?？梢?，適度遮陽有利于提高盆景靈芝的CAT活性。

圖5 不同處理下盆景靈芝的CAT活性Fig. 5 CAT activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.5.3 POD活性變化 由圖6可知，POD活性的變化趨勢與SOD、CAT不同，在原基期，POD活性較低；到菌柄期逐漸下降；而到菌蓋期則急劇上升；之后至到成熟期又呈下降趨勢。在原基期、菌蓋期和成熟期均表現(xiàn)為T2處理的POD活性最高，顯著高于其他處理；T0處理最低。在菌柄期，T2處理的POD活性最高，與T1處理差異不顯著，但顯著高于T0和T3處理；T3處理最低?？梢姡诠馓幚韺ε杈办`芝體內(nèi)POD活性有較大影響。

圖6 不同處理下盆景靈芝的POD活性Fig. 6 POD activity of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

2.6 光照強度對靈芝不同生長時期體內(nèi)MDA含量的影響

由圖7可知，在盆景靈芝整個生長發(fā)育過程中，其體內(nèi)MDA含量呈上升趨勢，在原基期最低，成熟期最高。從原基期到菌蓋期，靈芝體內(nèi)MDA含量表現(xiàn)為T3＞T0＞T1＞T2，且處理間均存在顯著差異；在成熟期，靈芝體內(nèi)MDA含量表現(xiàn)為T0＞T3＞T1＞T2，且T0和T3處理顯著高于T1和T2處理。在原基期，T3處理的MDA含量最高，T2處理最低，可見，在原基期時盆景靈芝需要較多的光照，過度遮陰對靈芝生長影響較大。綜上所述，過度遮陰和過度直曬都嚴重影響靈芝的生長發(fā)育，只有適度遮陰才能減緩光照強度對細胞膜的損傷，促進靈芝生長發(fā)育。

圖7 盆景靈芝不同生長期MDA含量Fig. 7 MDA content of bonsai Ganoderma lucidum under different treatments

3 討論

3.1 光照強度對靈芝活性成分的影響

食用菌生長發(fā)育過程中，光照是重要的環(huán)境因素，食用菌不同種類或同一種類不同生長發(fā)育時期對光照條件的需求不同[18]。在靈芝栽培的發(fā)菌階段，光照過強不僅會抑制菌絲的生長，還會導(dǎo)致菌絲分泌色素體提前老化；而在靈芝子實體生長階段則需要適度的光照作為誘導(dǎo)。光強作為關(guān)鍵的環(huán)境因素之一，不僅影響靈芝子實體的形態(tài)特征，還對靈芝的生長發(fā)育和代謝物質(zhì)形成有著重要影響。袁學軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝中多糖、三萜和蛋白質(zhì)含量受光照強度影響較大，自然光照強度下蛋白質(zhì)含量較高、多糖含量較低，適度遮陽處理提高了三萜含量，降低了蛋白質(zhì)含量。孫恬等[20]通過覆蓋不同顏色的光膜來改變靈芝栽培大棚的光照強度，弱光照強度處理子實體的多糖和三萜含量顯著高于強光照處理。本研究通過覆蓋不同密度遮陽網(wǎng)研究了不同光照強度對盆景靈芝生長發(fā)育及體內(nèi)活性成分含量的影響，結(jié)果顯示，無遮陽處理時靈芝子實體的多糖含量較低，可溶性蛋白含量較高；遮陽率為70%時多糖含量較高；遮陽率為90%時，三萜含量較低，與前人研究結(jié)果一致。由此可見，光照強度不僅影響靈芝的生長發(fā)育，還會影響靈芝內(nèi)次生代謝物含量。因此，明確具體的遮光度對于提高盆景靈芝性狀具有重要的理論和實踐意義。光照強度對靈芝生長發(fā)育的作用機制十分復(fù)雜，并受外部多種環(huán)境因素影響，其具體的作用機制還有待進一步研究。

3.2 光照強度對靈芝木質(zhì)素酶活性的影響

靈芝作為一種重要的白腐真菌，可分泌漆酶和錳過氧化物酶。漆酶不僅能夠降解環(huán)境中的木質(zhì)素，還具有聚合木質(zhì)素的作用，單獨存在時降解木質(zhì)素的效率較低，與錳過氧化物酶等共同作用才能實現(xiàn)較高的木質(zhì)素降解效率[21]。漆酶和錳過氧化物酶作為靈芝分泌的胞外酶，在靈芝生長發(fā)育過程中通過降解環(huán)境中的木質(zhì)素為靈芝提供營養(yǎng)成分，促進靈芝的生長發(fā)育及形態(tài)建成。研究表明，在靈芝的生長過程中，只有胞外酶活性的動態(tài)變化符合其生長發(fā)育規(guī)律才能使靈芝由菌絲體階段向子實體階段轉(zhuǎn)變[22]。光作為靈芝子實體生長階段重要的外部環(huán)境因素之一，不僅會影響靈芝子實體的活性代謝物質(zhì)，還對靈芝生理生化反應(yīng)具有調(diào)控作用，研究表明，當光照條件適宜植物生長時，其木質(zhì)素酶活性較穩(wěn)定，當光照條件對植物生長造成脅迫時，木質(zhì)素酶活性則發(fā)生較大變化，這種應(yīng)變性使植物能更好地適應(yīng)外部環(huán)境[23]。本研究通過覆蓋不同密度遮陽網(wǎng)研究了光照強度對盆景靈芝不同生長時期體內(nèi)木質(zhì)素酶活性的影響，結(jié)果表明，光照強度對盆景靈芝子實體內(nèi)漆酶和錳過氧化物酶活性有顯著影響，隨著遮陽率的加重，錳過氧化物酶活性逐漸降低，而漆酶活性先升高后降低。其中漆酶在原基期時活性最低，然后急劇升高，在菌蓋期活性最高，到成熟期活性又顯著降低；而錳過氧化物酶在原基期活性最高，然后逐漸降低到菌柄期，到菌蓋期活性急劇降低，成熟期相對平穩(wěn)。綜上所述，過度光強和過度遮陽均會降低盆景靈芝子實體內(nèi)錳過氧化物酶和漆酶活性。

3.3 光照強度對靈芝抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶系統(tǒng)是生物應(yīng)對環(huán)境脅迫時重要的防御體系，由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等組成，能夠有效地緩解環(huán)境脅迫對其造成的損傷。為探討光照對靈芝抗氧化酶系統(tǒng)的影響，王立華等[24]研究發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)處理靈芝的抗氧化酶活性差異較大，綠光處理下POD活性變化較大，白光處理下CAT活性較高，黑暗處理下SOD活性較高；郝俊江[25]研究發(fā)現(xiàn)藍色可使靈芝子實體維持較高的抗氧化酶活性水平。由此表明，靈芝生長需要一定的光照。然而這些研究主要集中于不同光質(zhì)對靈芝菌絲體、子實體生長的影響。本研究采用不同光照強度處理盆景靈芝，研究了其不同生育期抗氧化酶活性的變化，結(jié)果表明，不同光照強度處理下靈芝體內(nèi)抗氧化酶活性存在顯著差異，當遮陽率為70%時，盆景靈芝體內(nèi)的SOD、CAT和POD活性均最高，可見，70%遮陽率時的光照強度對靈芝生長最有利，此時體內(nèi)活性氧積累較少，酶活性最高；另外，不同光強處理下，雖然靈芝體內(nèi)抗氧化酶活性在整個生長周期內(nèi)的變化規(guī)律基本保持一致，但酶活變化最大的節(jié)點卻出現(xiàn)在不同時期，這表明在靈芝子實體的生長過程中除光照強度對靈芝生長造成的影響之外，抗氧化酶活性可能還與子實體發(fā)育間存在某種內(nèi)在的調(diào)控機制。