卿越雷 王秋 余嬌 代瓊花 秦竹

摘要：目的 探討疏調(diào)解郁湯核心藥對治療MMD可能的機制。方法 利用TCMSP平臺對藥物的活性成分及作用靶點進行篩選，利用GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD、DurgBank數(shù)據(jù)庫對MMD疾病靶點進行篩選。將藥物成分與疾病靶點取交集，采用string數(shù)據(jù)庫、及Cytoscape3.8.2軟件繪制蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)，篩選核心靶點。利用R（V4.1.2）軟件引用Bioconducter數(shù)據(jù)庫對交集基因進行GO分析和KEGG分析，并對篩選出的核心靶點和排名靠前的藥物關(guān)鍵成分進行分子對接驗證。結(jié)果 共篩選獲得藥物有效化合物成分 88個，作用靶點233個。MMD相關(guān)基因靶點1744個。將藥物作用靶點與疾病基因靶點取交集后，得到105個靶點。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)拓撲分析后得到MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT3共6個核心靶點。GO分析顯示疏調(diào)解郁湯核心藥對作用于MMD涉及了多個生物過程及分子功能，其中生物過程主要涉及對異物刺激的反應、對金屬離子的反應、對脂多糖的反應等。細胞成分主要涉及膜筏、膜微域、突觸膜、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。分子功能主要涉及DNA的結(jié)合轉(zhuǎn)錄、RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄等。KEGG分析顯示MMD的發(fā)病與多個通路，多種疾病均有關(guān)系。除與MMD相關(guān)通路外還與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、化學致癌受體激活通路、人巨細胞病毒感染、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路等有關(guān)。分子驗證顯示其中MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT3共6個關(guān)鍵靶點與藥物關(guān)鍵成分槲皮素、木樨草素進行分子對接驗證，結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol，表明關(guān)節(jié)化合物與核心靶點結(jié)合較好。結(jié)論 疏調(diào)解郁湯核心藥對MMD的治療作用可能與MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT3共6個關(guān)鍵靶點及PI3K-AKT信號通路、MAPK 信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、血管平滑肌收縮、膽堿能突觸、MTOR信號通路、MAPK信號通路、多巴胺神經(jīng)能突觸、甲狀腺激素信號通路、AMPK信號通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：抑郁癥；疏調(diào)解郁湯；網(wǎng)絡(luò)藥理學；分子對接；信號通路

中圖分類號：R749.4+1 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2023）03-0054-10

抑郁癥（major depressive disorder，MDD）是以顯著而持久的心境低落、思維遲鈍、認知功能障礙、興趣活動減退為主要表現(xiàn)的心境障礙類疾病^［1］。據(jù)WHO統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球約3.5億人患有抑郁癥，每年自殺行為的發(fā)生率約為28.5%～63.7%。我國抑郁癥患者占總?cè)丝诘?%～8%，目前其患病人數(shù)已超過2600萬，已成為危害人類健康的第四大疾患^［2］。根據(jù)相關(guān)文獻顯示抑郁癥在近些年的發(fā)病中表現(xiàn)出了患病及復發(fā)率高、同時致殘率高的特點^［3］，預計到2030年我國抑郁癥的疾病造成的社會經(jīng)濟負擔將位于首位^［4］。抑郁癥是一個由多種機制及多種因素共同參與而導致的疾病，被認為與遺傳、神經(jīng)生物學、社會文化心理因素及單胺遞質(zhì)等作用機制均相關(guān)^［5-9］。抑郁癥屬中醫(yī)“郁證、臟躁癥、百合病”范疇，相關(guān)研究顯示中醫(yī)學對郁證具有較為系統(tǒng)的理論認識和豐富的診治經(jīng)驗，在抑郁癥防治中發(fā)揮積極作用，尤其是對輕中度抑郁及抑郁癥鞏固治療、維持治療階段可發(fā)揮重要作用^［10］。疏調(diào)解郁湯由云南首位國醫(yī)大師張震研究員創(chuàng)立，張老強調(diào)在疾病的治療過程中，須注意氣機的疏達和調(diào)暢，方可取得較好的臨床療效，同時疏調(diào)人體氣機需將疏利肝氣與調(diào)護脾腎相結(jié)合。疏調(diào)解郁湯由疏調(diào)氣機湯加刺蒺藜、佛手、石菖蒲、玫瑰花、素馨花、厚樸花化裁而來。張老認為疏調(diào)解郁湯中之核心成份柴胡、白芍、枳實具有四逆散之意可助氣機之條暢與敷布，有緩解抑郁之作用；刺蒺藜可疏肝氣之郁積，平抑肝陽之上亢，解心經(jīng)之郁火；石菖蒲能開宣心竅腎竅，寧神益智；佛手疏調(diào)肝氣，甘松解郁暢中；玫瑰花氣味甘香，芳香襲人，能柔肝散郁，行氣活血^［11］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學探討疏調(diào)解郁湯中核心藥對（柴胡、白芍、枳實、刺蒺藜、石菖蒲、甘松、佛手、玫瑰花）治療MMD的生物學機制，并利用分子對接技術(shù)對其進行驗證。擬為闡明疏調(diào)解郁湯核心藥對治療MMD的作用機制和后續(xù)的實驗研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 藥物成分篩選與靶點預測 疏調(diào)解郁湯核心藥對，主要由柴胡、白芍、枳實、刺蒺藜、石菖蒲、甘松、佛手、玫瑰花8味藥物組成。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）^［12］，以藥物名稱“柴胡”、“白芍”、“枳實”、“刺蒺藜”、“石菖蒲”、“甘松”、“佛手”、“玫瑰花”作為關(guān)鍵詞，對藥物主要化學成分進行檢索。設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件，將篩選出的有效成分利用TCMSP的有數(shù)據(jù)庫進行靶點蛋白預測。并將預測的有效靶點蛋白利用Uniport（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫查詢對應基因名，將靶點蛋白與基因信息對應。

1.2 MMD疾病靶點篩選 以“major depressive disorder”作為關(guān)鍵詞，在GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）^［13］、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）^［14］、PharmGkb數(shù)據(jù)庫（https：//www.pharmgkb.org/）^［15］、TTD數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）^［16］、DurgBank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/）^［17］檢索，物種條件設(shè)置為智人（homo sapiens）其中將GeneCard數(shù)據(jù)庫中的Relevance score設(shè)定為≥10分，以篩選出與疾病相關(guān)度更高的基因。將篩選出的基因取并集，并去除重復基因，獲得與MMD疾病相關(guān)基因。

1.3 疏調(diào)解郁湯核心藥對治療MMD靶點預測 利用venny（V2.1）軟件對篩選出的藥物作用基因與疾病相關(guān)基因取交集，并繪制韋恩圖，將交集中的基因作為疏調(diào)解郁湯核心藥對作用于MMD的預測基因靶點。

1.4 構(gòu)建藥材-化合物-靶點作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵靶點 （1）將藥物名稱、藥物成分、與疾病基因靶點名稱對應，利用Excel輸出為network（網(wǎng)絡(luò)）文件。并將藥物名稱、藥物成分、疾病基因靶點利用Excel輸出為type（類型）文件。將兩個文件導入Cytoscape 3.8.2軟件中作圖。（2）將篩選出的藥物及疾病共有的基因，寫入Excel文件中，并導入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將作圖條件設(shè)定如下：物種為智人（“homo sapiens”），可信度≥0.9。如有游離節(jié)點，可設(shè)置為隱藏。（3）將圖導出為tsv文件，并用Cytoscape 3.8.2軟件打開進，利用軟件中的Network Analyzer工具進行拓撲分析，以Closeness、degree、LAC、Eigenvector 4個參數(shù)作為參考標準，按degree值排序，重復2次，篩選關(guān)鍵基因靶點。

1.5 GO富集分析與KEGG富集分析及可視化處理 將1.3中篩選出的疾病和藥物作用的共有基因，做生物學過程GO分析和KEGG通路分析。利用R（V4.1.2）軟件，引用colorspace、stringi、ggplot2、BiocManager數(shù)據(jù)包、并導入DOSE、clusterProfiler、enrichplot插件。對共有基因的生物過程、分子功能、細胞組分進行富集分析，篩選矯正P值<0.05的項目。對共有基因進行KEGG通路富集分析，設(shè)定P值<0.05，并對相關(guān)通路進行排序。最后利用R軟件對GO分析及KEGG分析的結(jié)果作圖對其進行可視化處理。

1.6 成分和靶點分子對接驗證 利用RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/），下載關(guān)鍵基因靶點的3D結(jié)構(gòu)的PDB文件，并使用PyMol（V2.4.0）軟件刪除文件中的水分子和小分子配體。利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載有效成分2D 結(jié)構(gòu)的SDF 格式文件，并用ChemOffice轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)，并用Mgitools（V1.5.6）軟件使其能量最小化保存為pdbqt格式文件。最后用AutoDockVina（V1.1.2）軟件進行分子對接驗證。

2 結(jié)果

2.1 藥物成分篩選與靶點預測結(jié)果 使用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索藥物有效成分，共獲得有效化合物成分 88個。其中柴胡17個，枳實22個，白芍13個，刺蒺藜12個，石菖蒲4個，佛手5個，甘松5個，玫瑰花10個。運用Uniport數(shù)據(jù)庫對TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出的基因名稱進行規(guī)范化處理，經(jīng)匯總后共得到1344個基因靶點，其中柴胡342個，枳實305個，白芍123個，刺蒺藜122個，石菖蒲103個，佛手48個，甘松68個，玫瑰花233個。經(jīng)去重后共有233個靶點。

2.2 MMD疾病靶點篩選結(jié)果 在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索共獲得1038個基因，Durgbank數(shù)據(jù)庫中共獲得109個基因，OMIM數(shù)據(jù)庫中共獲得4個基因，PharmGkb數(shù)據(jù)庫中共獲得701個基因，TTD數(shù)據(jù)庫中共獲得67個基因。經(jīng)去重并取并集后，獲得與MMD相關(guān)基因靶點共1744個。（如圖1所示）

2.3 疏調(diào)解郁湯核心藥對治療MMD靶點預測結(jié)果 利用venny（V2.1）軟件，對篩選出的藥物作用靶點和疾病基因靶點取交集。共得到105個靶點，作為疏調(diào)解郁湯作用于MMD的預測靶點。（如圖2所示）

2.4 藥材-化合物-疾病靶點作用網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵靶點結(jié)果 （1）圖3為得到的藥材-化合物-疾病靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖。圓圈為藥物成分，其大小以degree值排列與圓圈越大疾病相關(guān)性越大。其中圓形中的不同顏色代表不同藥物的有效成分。綠色為佛手，淡黃色為柴胡，紫色為刺蒺藜，紅色為玫瑰花，淡藍色為白芍，橘黃色為枳實，粉紅色為甘松，深藍色為石菖蒲。一個圓形有多種顏色代表該成分為多個藥物共有。圓圈的大小按degree值排列，藥物作用的靶點越多，則圓圈越大。中間的方形圖標為藥物作用于疾病相關(guān)靶點，相關(guān)性degree值排列，與疾病相關(guān)性越高，作用于該靶點的藥物越多，圖形越大，顏色越深。

（2）圖4為得到的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。其中蛋白質(zhì)之間作用相互度越高，基因越處于圖中間，且基因之間的連線越多。將由string數(shù)據(jù)庫得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，保存為tsv文件，用Cytoscape 3.8.2軟件打開，使用Analyzer軟件進行拓撲分析后，選取degree值超過中位數(shù)的基因，作為核心靶點。第一次degree值為5，黃色圖標為首次篩選的核心靶點（圖5所示）。將上述過程重復一次，第二次degree值為11，得，最終篩選出的核心靶點分別為MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT3。（圖6所示）

2.5 關(guān)鍵成分篩選結(jié)果 根據(jù)藥材-化合物-疾病靶點作用網(wǎng)絡(luò)中，藥物成分的degree值篩選出關(guān)鍵藥物成分。選取degree大于平均值的成分作為關(guān)鍵成分。前20味的成分信息見表1。

2.6 生物學過程GO分析結(jié)果 共富集到2052條生物過程相關(guān)條目，113條分子功能相關(guān)條目，155條細胞成分相關(guān)條目。使用R用R（V4.1.2）軟件，引用colorspace、stringi、ggplot2、BiocManager數(shù)據(jù)包、并導入DOSE、clusterProfiler、enrichplot插件。選取分子數(shù)量參與程度高的前10位繪制生物過程，細胞成分，分子功能的氣泡圖（如圖7、8、9所示）。由圖可見，生物過程主要涉及對異物刺激的反應、對金屬離子的反應、對脂多糖的反應、對氧氣水平的反應、對細菌的反應等。細胞成分主要涉及膜筏、膜微域、突觸膜、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。分子功能主要涉及DNA的結(jié)合轉(zhuǎn)錄、RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄、G蛋白偶聯(lián)受體激酶活動、神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、蛋白酶結(jié)合等。

2.7 KEGG通路富集分析結(jié)果 利用R用R（V4.1.2）軟件，安裝Bioconductor數(shù)據(jù)庫并引用“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”、“pathview”對篩選出的基因進行KEGG通路富集分析。設(shè)定篩選條件為校正P值≤0.05，共富集到168條通路。由此可見，疏調(diào)解郁湯治療MMD可能是通過多條通路，多個靶點起到治療作用，這也體現(xiàn)了中藥復方對疾病多靶點治療的特點。同時篩選排名前20名的通路做通路圖（圖10）。其中涉及多條通路，如與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)。

皰疹病毒感染通路、化學致癌受體激活通路、人巨細胞病毒感染、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路等。在168條通路中與MMD相關(guān)的主要通路為PI3K-AKT信號通路（基因占比21%）、MAPK 信號通路（基因占比17%）、Ras信號通路（基因占比10%）、Rap1信號通路（基因占比7%））、血管平滑肌收縮（基因占比8%）、膽堿能突觸（基因占比12%）、MTOR信號通路（基因占比6%）、MAPK信號通路（基因占比17%）、多巴胺神經(jīng)能突觸（基因占比11%）、甲狀腺激素信號通路（基因占比13%）、AMPK信號通路（基因占比5%）。

2.8 分子對接驗證 使用篩選出的6個關(guān)鍵靶點（MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT3）與化合物中篩選出的排名前2的關(guān)鍵成分（槲皮素、木樨草素）進行分子對接驗證。一般來說，結(jié)合能<0 kJ/mol，則說明受體和配體可以自由結(jié)合。目前對于結(jié)合能尚無統(tǒng)一篩選標準，通過閱讀相關(guān)文獻，采用結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol，作為標準^［18］。（結(jié)果如表2所示）所有成分與關(guān)鍵靶點的分子結(jié)合能均小于上述標準，表明成分與靶點結(jié)合較好。

3 討論

據(jù)相關(guān)流行病學調(diào)查顯示，隨著經(jīng)濟社會的不斷發(fā)展，人們面臨的壓力也日益增大，MMD發(fā)病率在我國呈現(xiàn)逐年上升趨勢。MMD自發(fā)現(xiàn)以來就被認為是多因素導致的疾病。西醫(yī)認為其發(fā)病機制主要與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其受體表達異常、神經(jīng)細胞可塑性及相關(guān)信號通路改變、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸持續(xù)激化引發(fā)功能紊亂、細胞因子的異常分泌引發(fā)抑郁等因素相關(guān)^［19］。較西藥治療MMD而言，中藥治療MMD的優(yōu)勢有心神同治的整體觀及豐富的臨床實踐經(jīng)驗。張老認為在抑郁癥的發(fā)病過程中，核心原因主要為氣血不和。正如《丹溪心法》云：“氣血沖和，萬病不生。一有拂郁，諸病生焉”。因此在治療的過程中不僅要注重疏利調(diào)暢肝的氣機升降，更應注重補益氣血，顧護脾胃功能。疏調(diào)解郁湯核心藥對中，柴胡主結(jié)氣積聚、疏通肝木、推陳致新。白芍入肝家而清風，走膽腑而瀉熱，善調(diào)心中煩悸。枳實瀉痞滿而去濕，消陳腐而還清。刺蒺藜利血，宜入肝經(jīng)，平肝疏肝。石菖蒲開心孔，補五臟，通九竅，明耳目。佛手疏肝理氣，和胃止痛。甘松理脾胃，開氣郁。玫瑰花柔肝醒胃，行氣活血。現(xiàn)代藥理學研究證明，柴胡、白芍、刺蒺藜、石菖蒲可通過單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其離子通道（5羥色胺3受體）對抑郁癥起治療作用^［20-24］。枳實可通過提高海馬GRmRNA表達，抑制下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸亢進、提高海馬及皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA表達、參與提高神經(jīng)遞質(zhì)類表達和釋放及調(diào)節(jié)胃腸激素對MMD起到治療作用^［25］。佛手可通過調(diào)控HPT軸及HPA軸起到抗抑郁作用^［26］。甘松可通過促進神經(jīng)細胞增殖及調(diào)控cAMP、MAPK通路對抑郁癥起治療作用^［27］。玫瑰花能顯著增加抑郁小鼠中血清5-HT含量^［28］。諸藥合用，共同起到疏肝解郁，行氣和血，健運脾胃之功。

疏調(diào)解郁湯為張老長期臨床過程中，總結(jié)出的行之有效的處方和藥味的綜合體。體現(xiàn)了張老“調(diào)和氣血”的主要思想。臨床中對于緩解抑郁癥患者的心理和生理癥狀，療效較好。據(jù)前期臨床觀察顯示。服用疏調(diào)解郁湯治療的患者癥狀緩解明顯，抑郁評分量表較服藥前有所改善。本研究通過篩選疏調(diào)解郁湯核心藥對中的藥物活性成分及作用靶點與MMD相關(guān)疾病靶點，結(jié)果顯示疏調(diào)解郁湯治療MMD的作用與MAPK1、CTNNB1、FOS、AR、GSK3B、RUNX2、MYC、NR3C1、JUN、TP53、AKT1、HIF1A、CASP3、NCOA2、RB1等多個靶點相關(guān)。選取其中MAPK1、FOS、JUN、AKT1、ESR1、STAT36個關(guān)鍵靶點與藥物關(guān)鍵成分槲皮素、木樨草素進行分子對接驗證，結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol，表明關(guān)節(jié)化合物與核心靶點結(jié)合較好。

本研究的GO分析顯示疏調(diào)解郁湯核心藥對作用于MMD涉及了多個生物過程及分子功能，其中生物過程主要涉及對異物刺激的反應、對金屬離子的反應、對脂多糖的反應、對氧氣水平的反應、對細菌的反應等。細胞成分主要涉及膜筏、膜微域、突觸膜、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。分子功能主要涉及DNA的結(jié)合轉(zhuǎn)錄、RNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄、G蛋白偶聯(lián)受體激酶活動、神經(jīng)遞質(zhì)受體活動、蛋白酶結(jié)合等。有研究顯示MMD的發(fā)病與細胞信號傳導、線粒體能量代謝有明顯關(guān)系，如cAMP-PKA傳導、NDMA傳導等^［29-30］。KEGG通路分析顯示，MMD的發(fā)病與多個通路，多種疾病均有關(guān)系。如與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、化學致癌受體激活通路、人巨細胞病毒感染、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路等。近年來的研究表明，抑郁癥可與腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等同時發(fā)生或誘發(fā)其他疾病。據(jù)相關(guān)文獻顯示惡性腫瘤和抑郁障礙普遍存在共病關(guān)系，癌癥可能導致產(chǎn)生抑郁同時抑郁癥導致腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險加劇^［31］。同時與免疫相關(guān)的白細胞介素、腫瘤壞死因子也與抑郁癥發(fā)生相關(guān)，TNF-α IL-6、IL-10通過MAPK、JAK/STAT信號通路參與RA發(fā)病的同時可導致抑郁癥的發(fā)生^［32］。

綜上所述，疏調(diào)解郁湯核心藥對MMD的治療作用可能與MAPK1、CTNNB1、FOS、AR、GSK3B、RUNX2、MYC、NR3C1、JUN、TP53、AKT1、HIF1A、CASP3、NCOA2、RB1等多個靶點相關(guān)?？赡軐μ悄虿〔l(fā)癥相關(guān)的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、化學致癌受體激活通路、人巨細胞病毒感染、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路有調(diào)控作用。同時對與MMD 相關(guān)的PI3K-AKT信號通路、MAPK 信號通路、Ras信號通路、Rap1信號通路、血管平滑肌收縮、膽堿能突觸、MTOR信號通路、MAPK信號通路、多巴胺神經(jīng)能突觸、甲狀腺激素信號通路、AMPK信號通路也具有治療作用。因此，疏調(diào)解郁湯核心藥對對MMD的治療和干預是通過多靶點，多通路實現(xiàn)的。其具體機制和通路還需通過進一步動物實驗研究和驗證。

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（收稿日期：2022-05-06）