吳 蘭,仝澤方,賈漢忠,馬英輝,盧美歡,李利軍

(1. 陜西省微生物研究所,西安 710043;2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,陜西楊凌 712100)

硒是生物體生長所必需的微量元素,在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能。與無機(jī)硒和有機(jī)硒相比,納米硒屬無定型單質(zhì)硒,由于其吸收率高、毒性低、生物活性高的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物生產(chǎn)、醫(yī)藥及保健領(lǐng)域[1-7]。目前,國內(nèi)外研究報(bào)道集中于納米硒的制備方法以及生物學(xué)功能和應(yīng)用方面。納米硒的合成方法有化學(xué)法與生物轉(zhuǎn)化法,化學(xué)納米硒的合成方法主要有載體模板法[8-9]、溶膠法[10]、固相法[11]。然而,工業(yè)產(chǎn)生的納米硒成本較高、副產(chǎn)品有毒。微生物法轉(zhuǎn)化合成的納米硒低毒、穩(wěn)定、高效,呈規(guī)則的球狀,性能優(yōu)于化學(xué)合成的納米硒[12]。目前,許多微生物可以將硒酸鹽或亞硒酸鹽還原成納米硒,如蠟樣芽孢桿菌[13]、地衣芽孢桿菌[14]、分支桿菌[15]等,通過SEM電子掃描電鏡光譜分析,發(fā)現(xiàn)其菌體周圍分散著大量納米硒顆粒,且顆粒呈規(guī)則的球形,通過分離純化技術(shù)可將菌體與納米硒顆粒分離以得到純凈的納米硒顆粒。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥劑

酵母提取物,北京奧博興生物技術(shù)有限公司。尿素、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、正辛醇和無水乙醇,天津天力化學(xué)試劑有限公司。葡萄糖、蔗糖,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。亞硒酸鈉,國藥集團(tuán)。5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物(DMPO,97%)、二甲基亞砜,國家化學(xué)試劑有限公司(中國上海)。

DHZ-D恒溫?fù)u床,蘇州培英測(cè)試設(shè)備有限公司。HC-3018R高速離心機(jī),安徽中科眾佳科學(xué)儀器有限公司。96Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎儀,西安必朗生物技術(shù)有限公司。掃描電子顯微鏡,日本電子有限公司(Hitachi S-3400N)。電子順磁共振波譜儀(EPR),EMXmicro-6 /1 / P / L,德國。

1.2 微生物對(duì)納米硒的合成

解淀粉芽孢桿菌Lxz-41于2016年分離自陜西省安康市紫陽縣富硒土壤,并于2016-10-18將該菌株保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為 CCTCC M2016578。將保藏的菌株接入固體斜面LB培養(yǎng)基,30 ℃靜置活化24 h,而后接至液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化鈉0.5%,pH自然),30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h后按1%接種到納米硒合成培養(yǎng)基中(蔗糖4.5%,尿素0.1%,酵母粉1%,磷酸氫二鉀0.3%,磷酸二氫鉀0.1%,氯化鈉0.5%,亞硒酸鈉0.15%,初始pH為7.0), 40 ℃、160 r/min 培養(yǎng)18 h,然后4 ℃、6 000 r/min 離心10 min,取沉淀用無菌生理鹽水沖洗3次,沉淀-20 ℃冷凍保存,備用,同時(shí)取未加硒的沉淀作為對(duì)照。以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 硒納米粒子的純化及表征

將上步獲得的沉淀,用無菌蒸餾水進(jìn)行懸浮,進(jìn)行冰浴超聲破壁(150 W,超聲10 s,間歇5 s)20次,獲得菌體裂解液,10 000 r/min 4 ℃冷凍離心10 min,沉淀用無菌去離子水清洗3次,并懸浮,加入同體積氯仿萃取30 min(4 ℃),重復(fù)2～3次,合并下層萃液,依次用100%、70%、30%、生理鹽水清洗,然后用混懸儀均勻懸浮,-20 ℃預(yù)凍24 h后,凍干后即為純化納米硒粉末。

將純化后的納米硒顆粒用無水乙醇懸浮,然后吸取一滴滴于硅片上,待乙醇自然揮發(fā)后可用于電子掃描電鏡檢測(cè)。同時(shí)取未純化的帶硒菌體、正常菌體進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。

1.4 自由基測(cè)量

為了進(jìn)行不同樣品的EPR分析,將20 mg固體樣品放入高純度石英EPR管中,并在室溫下進(jìn)行分析。為了檢測(cè)潛在的ROS形成,將200 μL新鮮制備的DMPO(0.1 mmo/L)的水或二甲基亞砜溶液添加到1.5 mL離心管中,并添加10 mg固體樣品。然后使懸浮液通過0.45 μm注射器過濾器(Whatman,Dassel,德國)以從溶液中分離硒顆粒。將濾液轉(zhuǎn)移到EPR毛細(xì)管中,并在一端用真空油脂密封。將毛細(xì)管放入EPR管中并固定在EPR諧振器中。儀器和操作參數(shù)如下:中心場(chǎng),3515 G;微波頻率9.7 GHz;微波功率,2.0 mW;調(diào)制頻率,4.0 G;掃描寬度200 G;接收機(jī)增益3.54×104,時(shí)間常數(shù)41.0 ms;掃描時(shí)間80.0 s;10次掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒納米顆粒的表征

通過SEM觀察硒納米顆粒(SeNPs)的形貌特征。如圖1-a所示,由細(xì)菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的硒納米顆粒的尺寸小于300 nm。分離純化后產(chǎn)生的硒納米顆粒尺寸均勻,純度高,且大部分雜質(zhì)被分離出來。圖1-b顯示了帶有硒納米顆粒的菌體(bacteria-SeNPs),可以看出納米硒顆粒由菌體外泌后部分分散沉淀在菌體表面。圖1-c顯示了無硒存在下細(xì)菌的微觀形態(tài)。細(xì)菌通過離心冷凍干燥后,它們以疊層狀態(tài)出現(xiàn),且表面沒有納米硒。

圖1 純化納米硒(a)、帶菌體納米硒(b)和菌體(c)的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.1 SEM of Se-NPS (a),bacteria with SeNPS and bacteria

2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化的納米硒體系中的形成

GSH.谷胱甘肽;GR.谷胱甘肽還原酶;TR.硫氧還蛋白還原酶GSH.Glutathione;GR.Glutathione reductase;TR.Thioredoxin reductase圖2 解淀粉芽孢桿菌Lxz-41轉(zhuǎn)化納米硒的反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of conversion of nanometer selenium by Bacillus amyloliquefaciens LXZ-41

圖3 不同樣品中活性氧自由基EPR譜圖Fig.3 EPR image of ROS in different samples

2.3 持久性自由基(PFRs)在細(xì)菌轉(zhuǎn)化的SeNPs中產(chǎn)生

使用EPR分別檢測(cè)SeNPs(1),帶納米硒菌體(2)和對(duì)照菌體(3)中PFRs的信號(hào)。如圖4所示,在對(duì)照細(xì)菌(3)和SeNPs(1)中檢測(cè)到PFRs信號(hào),而在SeNPs-細(xì)菌(2)中未檢測(cè)到PFRs信號(hào)。SeNPs有很好的生物相容性,在納米硒轉(zhuǎn)化過程中所用的培養(yǎng)液一般含有蛋白質(zhì)或含有O、N、S的生物分子,如糖、氨基酸等。通過分離提純沉降得到SeNPs粉。生成的SeNPs通常以SeNPs-surf的形式存在,具有特定的粒徑和特殊的形貌[24-25]。在SeNPs轉(zhuǎn)化的微環(huán)境中,SeNPs與修飾劑之間不是簡單的物理吸附結(jié)合,而是在界面通過化學(xué)鍵牢固地結(jié)合在一起[26-28]。主要原因是納米硒由于其高的反應(yīng)活性,當(dāng)遇到具有能夠產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)的活性作用基團(tuán)的小分子和生物大分子時(shí),可形成一定數(shù)量的化學(xué)鍵,與許多小分子以及生物大分子都能配位結(jié)合。這種SeNPs與生物分子之間的電子交換作用促進(jìn)生物分子的電子轉(zhuǎn)移[29],因此,表面的電子轉(zhuǎn)移可能會(huì)產(chǎn)生孤對(duì)電子,這可能就是細(xì)菌轉(zhuǎn)化生成的SeNPs-surf上檢測(cè)到EPFRs的主要原因。同時(shí),這種界面配位作用和界面兩相間的化學(xué)反應(yīng)增強(qiáng)了SeNPs體系的穩(wěn)定性,使其可在環(huán)境中長久存在。

圖4 不同樣品中環(huán)境持久性自由基的EPR圖譜Fig.4 EPR image of PFRs in different samples

具已有報(bào)道,SeNPs具有良好的抗氧化活性,主要原因與其表面修飾劑有關(guān)。他們認(rèn)為SeNPs是以SeNPs-surf形態(tài)參與清除自由基反應(yīng),這表明SeNPs與修飾劑之間以及SeNPs-surf與自由基之間均發(fā)生了相互作用,而SeNPs-surf的抗氧化作用實(shí)際上是表面修飾粒子所發(fā)生的界面化學(xué)反應(yīng)[27-28,30-31]。從本試驗(yàn)結(jié)果中得出細(xì)菌轉(zhuǎn)化后生成的SeNPs-surf上帶有PFRs,因此,是否所有細(xì)菌轉(zhuǎn)化生成的SeNPs都帶有PFRs,其EPFRs的形成機(jī)制是什么,它是否參與到納米硒生物活性,成為一個(gè)新的研究課題。因此,運(yùn)用界面化學(xué)的原理技術(shù)及自由基檢測(cè)技術(shù)開展SeNPs與表面修飾劑之間以及SeNPs-surf與外部離子、分子和其他個(gè)體之間相互作用的研究,有可能在分子水平上理解SeNPs的生物活性并揭示SeNPs與自由基、蛋白質(zhì)和DNA作用機(jī)制。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究了細(xì)菌轉(zhuǎn)化的納米硒的物理化學(xué)性狀。結(jié)合電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)菌-解淀粉芽孢桿菌Lxz-41可高效轉(zhuǎn)化NaSeO3為納米硒顆粒。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在納米硒轉(zhuǎn)化過程中,EPFRs作為一種新型物質(zhì)在納米硒表面有弱表現(xiàn)。該結(jié)論為細(xì)菌轉(zhuǎn)化納米硒及其轉(zhuǎn)化過程中的產(chǎn)物提供了更多的信息。同時(shí),所得結(jié)果為了解微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒的表面微觀結(jié)構(gòu)變化提供了新的思路。