劉金瑋 巴林超 張勁夫 范正軍

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的腫瘤類型,約占80%～90%,具有較高的發(fā)病率和死亡率,預(yù)后較差,全球每年因HCC導(dǎo)致的癌癥性死亡人數(shù)在所有類型的腫瘤中居第3位[1],5年生存率<5%。目前,對于肝癌的治療方法包括部分肝切除術(shù)、射頻消融、肝動脈化療栓塞、免疫靶向藥物治療等。近年來肝癌的治療有所突破,但肝癌的治療效果及預(yù)后并未取得滿意的結(jié)果[2]。尋找有效的HCC預(yù)后分子并轉(zhuǎn)化為臨床和醫(yī)療成果至關(guān)重要。低氧脂滴誘導(dǎo)相關(guān)蛋白(hypoxia-induced lipid droplet-associated protein,HILPDA)又被稱為缺氧誘導(dǎo)基因,其過表達(dá)導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性,促進(jìn)肝硬化進(jìn)程[3],而肝硬化是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要生物學(xué)過程。本研究通過生物信息學(xué)分析方法探討HILPDA在HCC中的表達(dá)情況及其與預(yù)后之間的關(guān)系。

對象與方法

一、資料獲取和篩選

從TCGA數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Altas, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)中下載HCC的項目的高通量RNA測序(RNA-sep)和病人的臨床數(shù)據(jù)。TCGA共收錄HCC樣本424例,其中包含腫瘤組織樣本374例和癌旁組織樣本50例。根據(jù)要求篩選符合條件的樣本:(1)基因樣本量表達(dá)不為0;(2)臨床信息完整。篩選后符合要求的病例373例。本研究使用R語言對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析。從TIMER數(shù)據(jù)庫下載HILPDA的泛癌圖。收集我院32例HCC組織及對應(yīng)癌旁組織,所有均獲得病人及家屬同意,并獲得鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、分析方法

1.HILDPA mRNA 在HCC和相應(yīng)癌旁組織的表達(dá):使用perl語言對下載篩選后的TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理,整理R語言可讀取的矩陣文件,利用R語言軟件的“l(fā)imma”包對提取的HILPDA基因表達(dá)量在癌旁組織和腫瘤樣本的表達(dá)進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用箱線圖顯示HILPDA基因在癌旁組織和腫瘤樣本中的不同表達(dá)水平。

2.HILPDA mRNA表達(dá)與HCC病人臨床因素及預(yù)后之間的關(guān)系:TCGA數(shù)據(jù)庫中下載HCC病人的臨床相關(guān)資料。利用R包“survival”和“survminer”進(jìn)行生存分析。根據(jù)373例腫瘤樣品的HILPDA基因表達(dá)水平中位數(shù)值將HCC樣本分為高、低表達(dá)組,并采用Kaplan-Meier生存曲線比較高、低表達(dá)組之間的生存差異。

3.HILPDA mRNA表達(dá)與HCC病人臨床特征的相關(guān)性分析:收集HCC病人的性別、年齡、病理學(xué)分級、TNM分期等臨床特征,刪除臨床數(shù)據(jù)不完整的樣本,保留373例臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。采用χ2檢驗比較HILPDA基因表達(dá)水平在不同臨床特征上的差異,采用單因素Cox回歸計算所研究變量的風(fēng)險比率(hazard ratio,HR),采用多因素Cox回歸探索HILPDA mRNA 表達(dá)水平作為預(yù)后因素的獨立性。

4.HCC病人預(yù)后模型的建立:采用多因素Cox回歸分析和赤池信息準(zhǔn)則(AIC)方法確定最佳預(yù)后模型。此外,通過R包rms構(gòu)建列線圖(Nomogram)預(yù)后預(yù)測模型。根據(jù)風(fēng)險評分的中位數(shù)將病人分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。高危組與低危組總生存期(OS)差異采用Kaplan-Meier法,雙側(cè)Log-rank檢驗。構(gòu)建受試者工作特征(ROC)曲線,評價預(yù)后模型強度的預(yù)測精度。

5.HILPDA表達(dá)水平與HCC中免疫細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性分析:應(yīng)用R中GSV A包中的ssGSEA(single-sample Gene Set Enrichment Analysis)方法,通過整合已發(fā)表的免疫基因列表中的基因表達(dá)水平來量化免疫細(xì)胞類型的相對腫瘤浸潤水平[4]。采用Wilcoxon秩和檢驗和Pearson相關(guān)性分析評估免疫細(xì)胞浸潤與不同HILPDA mRNA表達(dá)組之間的關(guān)系。

6.RT-PCR方法檢測HCC組織中的表達(dá):應(yīng)用RNA提取液提取HCC組織及癌旁組織中總RNA,融于無酶水中。使用分光光度儀進(jìn)行RNA濃度及純度測定,當(dāng)A260/A280處于1.8～2.0時,于-80 ℃超低溫冰箱備用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。引物根據(jù)Gen Bank數(shù)據(jù)HILPDA參考序列設(shè)計,HILPDA引物上游5'-TGATGGAGTCCCTAGAGGGCTTA-3'、下游5'-TCTGGATGGATGGTCTGGAAG-3',應(yīng)用Universal Blue SYBR-Green qPCR Master Mix試劑盒,每個反應(yīng)體系中加入Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl,上下游引物各0.4 μl,cDNA 2 μl,滅菌水9.2 μl,共20 μl反應(yīng)體系。采用兩步擴(kuò)增法,共進(jìn)行40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCT相對定量法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Wilcoxon秩和檢驗和Wilcoxon符號秩檢驗分析HILPDA在非配對樣本和配對樣本中的表達(dá)情況。使用pROC包生成ROC曲線,評估HILPDA表達(dá)的診斷性能。采用Kruskal-Wallis檢驗、Wilcoxon符號檢驗、Chi-Squared檢驗分析臨床病理特征與HILPDA表達(dá)的關(guān)系。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制,Log-rank檢驗評估組間差異。使用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析來估計死亡風(fēng)險。P<0.05(雙側(cè))為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用R(3.6.1版本)和SPSS(24.0版本)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

結(jié)果

1.差異表達(dá)和泛癌分析:與癌旁正常組織相比,HCC腫瘤組織中HILPDA高表達(dá)(P<0.001,圖1A)。配對標(biāo)本中,HCC腫瘤組織中HILPDA mRNA表達(dá)高于相鄰癌Pangaea癌旁組織(P<0.001)(圖1B)。ROC曲線顯示,HILPDA mRNA的表達(dá)量對HCC具有診斷價(AUC值為0.740, 95% CI:0.653-0.826)(圖1C)。為了進(jìn)一步評估人類癌癥中HILPDA mRNA的表達(dá),本研究利用TCGA的癌癥RNA-seq數(shù)據(jù)檢測了HILPDA mRNA的表達(dá)。腫瘤組織與癌旁正常組織間HILPDA mRNA的差異表達(dá)見圖1D。與癌旁正常組織相比,TCGA數(shù)據(jù)庫中幾乎所有腫瘤類型中HILPDA mRNA表達(dá)均顯著過表達(dá),見圖1D。

A:TCGA數(shù)據(jù)庫中配對肝癌癌組織中HILPDA mRNA水平上調(diào);B:TCGA數(shù)據(jù)庫中非配對HCC癌組織中HILPDA mRNA水平上調(diào);C:判斷HILPDA具有良好診斷HCC價值的ROC曲線;D:HILPDA在TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤組織表達(dá)水平差異(P<0.01);E:在不同肝癌腫瘤大小HILPDA mRNA水平上調(diào)(P<0.001);F:HILPDA mRNA水平在HCC是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有差異(P<0.05);G:HILPDA mRNA水平在HCC是否發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移無差異(P=0.32);H:HILPDA mRNA水平在不同病理分級的肝癌組織樣本中有差異(P<0.001);I:HILPDA mRNA水平在不同血清AFP水平的肝癌組織樣本中有差異(P<0.01)

2.HILPDAmRNA與HCC病人臨床特征和預(yù)后的關(guān)系:HILPDA mRNA表達(dá)與腫瘤直徑、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級和甲胎蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)(圖1E～I(xiàn)),而與是否發(fā)生器官轉(zhuǎn)移(圖1G)無關(guān)。本研究共有252例男性和121例女性病人,中位年齡為62歲(54～68歲)。將HCC中HILPDA mRNA的表達(dá)水平根據(jù)中位數(shù)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。Kaplan-Meier生存分析顯示,TCGA-HCC數(shù)據(jù)集中HILPDA高表達(dá)病人的OS低于低表達(dá)組(HR=3.05,95%CI:2.10～4.22,P<0.001;圖2A)。多因素Cox分析顯示,HILPDA mRNA表達(dá)是HCC病人OS的獨立預(yù)后因素(HR=1.254,95%CI:1.052～1.494,P<0.05)。此外,TNM分期(HR=1.593,95%CI:1.282～1.980,P<0.001)也是OS的獨立預(yù)后因素(表1)。HILPDA mRNA高表達(dá)病人的無進(jìn)展生存期(PFS)較低表達(dá)組更差(HR=1.670,95%CI:1.25～2.24,P=0.001)(圖2B)。根據(jù)Kalan-Meier法中P值最小的方法,HILPDA mRNA表達(dá)截斷值為2.099。生存分析顯示,高HILPDA表達(dá)的HCC病人OS和PFS(HR=3.05,95%CI:2.10～4.42,P<0.001)較差(圖2A、B)。

表1 HILPDA表達(dá)水平與HCC病人總生存期的單因素Cox和多因素Cox分析

A:來自TCGA數(shù)據(jù)的OS生存曲線;B:來自TCGA數(shù)據(jù)的PFI生存曲線;C:Nomogram標(biāo)準(zhǔn)曲線;D:整合了來自TCGA數(shù)據(jù)庫的HCC的HILPDA和其他預(yù)后因素的Nomogram圖

3.HCC預(yù)后模型的建立:通過前面的研究證實了HILPDA mRNA的高表達(dá)是HCC預(yù)后的獨立危險因素。為了驗證這一點,我們從TCGA數(shù)據(jù)中擬合LIHC mRNA表達(dá)和其他臨床病理參數(shù),建立了OS的預(yù)測模型。我們構(gòu)建了OS的Nomogram信息圖譜,整合了HILPDA與其他預(yù)后因素,包括、T分型、M分型、病理分期等(圖2C)。Nomogram圖示越高,預(yù)后因子越差。校準(zhǔn)曲線評估了LIHC的Nomogram性能。通過納入HILPDA mRNA表達(dá)水平及其他臨床因素構(gòu)建起獨立的預(yù)后模型,能夠更加簡單、有效、準(zhǔn)確的評估肝癌病人的總生存情況。

4.臨床組織標(biāo)本的驗證:應(yīng)用RT-PCR方法檢測HCC組織及對應(yīng)癌旁組織HILPDA的表達(dá),結(jié)果顯示,HCC組織中HILPDA表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01)。見圖3。

圖3 HCC中HILPDA的表達(dá)

5.HILPDA表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系:考慮到GO和GSEA富集分析均發(fā)現(xiàn)HILPDA可能參與腫瘤免疫應(yīng)答,我們進(jìn)一步應(yīng)用ssGSEA分析HILPDAmRNA表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的關(guān)系。免疫細(xì)胞浸潤與HILPDA mRNA表達(dá)的相關(guān)性,見圖4A。結(jié)果顯示,HMMR mRNA表達(dá)Th2細(xì)胞(R=0.358,P<0.001,圖4D)和Macrophages呈正相關(guān)(R=0.277,P<0.001,圖4F)。ssGSEA也顯示HILPDA表達(dá)與 T細(xì)胞(R=0.029,P=0.579,圖4A)、B細(xì)胞(R=0.016,P=0.725,圖4B)、Th1細(xì)胞(R=0.081,P=0.117,圖4B)和NK細(xì)胞無關(guān)(R=0.001,P=0.988,圖4E)。

A:HILPDA表達(dá)與T細(xì)胞浸潤無相關(guān)性;B:HILPDA表達(dá)與B細(xì)胞浸潤無相關(guān)性;C:HILPDA表達(dá)與Th1細(xì)胞浸潤不相關(guān);D:HILPDA表達(dá)與Th2細(xì)胞浸潤呈顯著正相關(guān);E:HILPDA表達(dá)與NK細(xì)胞浸潤無相關(guān)性;F:HILPDA表達(dá)與Macrophages細(xì)胞浸潤呈顯著正相關(guān)

討論

HILPDA是在缺氧的情況下形成的一種蛋白,也被認(rèn)為是一個腫瘤抗原,在細(xì)胞類型癌中的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了誘導(dǎo)作用,而HCC作為細(xì)胞癌中的其中一個類型[5-6]。相關(guān)研究表明,HILPDA mRNA 在富含脂質(zhì)的細(xì)胞類型中過表達(dá),包括結(jié)直腸癌和腎透明細(xì)胞癌[6],在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,甚至參與了腫瘤對血管的侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。眾所周知,HCC的肝硬化背景引起的門靜脈高壓會導(dǎo)致肝臟血流減少而使肝細(xì)胞處于相對缺氧的狀態(tài),這種情況會可能導(dǎo)致HILPDA表達(dá)上調(diào),并且這種反應(yīng)也與增加的甘油三酯和脂滴積累相關(guān),可調(diào)節(jié)富含脂質(zhì)的腫瘤正向調(diào)控,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖等[8]。

本研究表明,HCC中缺氧誘導(dǎo)的脂滴相關(guān)蛋白高表達(dá),通過收集HCC組織及對應(yīng)癌旁組織標(biāo)本應(yīng)用RT-PCR檢測HILPDA的表達(dá)并進(jìn)行差異分析也驗證了這一點,這一結(jié)果在神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、胃癌、腎細(xì)胞癌和膀胱癌等多種癌癥中的高表達(dá)情況一致[9]。TCGA數(shù)據(jù)庫中大多數(shù)的腫瘤HILPDA顯著表達(dá),表明HILPDA有望成為這些癌癥的診斷生物標(biāo)志物。通過ROC曲線我們找到HILPDA mRNA的AUC值為0.740,表明根據(jù)HILPDA的表達(dá)有助于區(qū)別HCC病人與普通病人。在肝癌的研究分析表明,HILPDA的基因表達(dá)水平與肝癌的生物學(xué)特性及臨床預(yù)后密切相關(guān)。Nishimura等[10]研究表明,根據(jù)HILPDA的表達(dá)可作為早期卵巢透明細(xì)胞癌的預(yù)測因子和反應(yīng)化療的生物標(biāo)志物。通過分析臨床病例特征的關(guān)系還發(fā)現(xiàn),HILPDA的表達(dá)情況與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分期和血清甲胎蛋白水平相關(guān),這些結(jié)果提示,HILPDA基因的表達(dá)可能會促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。

分析HILPDA的表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系顯示,在HCC中高表達(dá)HILPDA與預(yù)后不良相關(guān)。通過對TCGA中HCC數(shù)據(jù)生存分析顯示,HILPDA mRNA高表達(dá)的病人OS和PFS生存較差,而多因素分析也證實了HILPDA mRNA也是OS和PFS的獨立預(yù)后因素。大量研究表明,HILPDA可能是胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤、腎細(xì)胞癌、肺細(xì)胞癌等腫瘤的不良預(yù)后生物標(biāo)志物[11-14]?？紤]到HILPDA有望成為一個預(yù)后指標(biāo),根據(jù)HILPDA的表達(dá)情況和相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)構(gòu)建了Nomogram預(yù)測模型。Nomogram圖可精準(zhǔn)的預(yù)測3～5年的OS,諾波圖也可以幫助篩查高危病人,并確定為HCC的病人制定更加積極的治療方案作為警醒作用。

作為Wnt信號通路的因子及HIF1特異性下游靶基因,HILPDA可參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、能量代謝等過程[12,15]。通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn)HILPDA表達(dá)與Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Macrophage浸潤呈正相關(guān),而與T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤不相關(guān),提示HILPDA可能有助于參與HCC的免疫逃逸機制。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可參與HCC免疫應(yīng)答的調(diào)控機制以及產(chǎn)生一些細(xì)胞因子[16],由于HILPDA是一種天然的免疫腫瘤抗原,它的高表達(dá)有助于腫瘤免疫微環(huán)境的浸潤,并與腫瘤免疫抑制的狀態(tài)相關(guān)[17],這提示HILPDA可能是肝癌治療的一個新的靶點,考慮到HILPDA會導(dǎo)致惡性腫瘤的進(jìn)展,使用HILPDA蛋白可能是治療HCC的一個新的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn),HILPDA高表達(dá)是HCC的不良預(yù)后的一個因素。本研究提高了我們對HILPDA與HCC關(guān)系的認(rèn)識,但也存在局限性。首先,缺乏體內(nèi)實驗經(jīng)驗,結(jié)果無法得到驗證。由于研究設(shè)計的局限性,可能遺漏了與HILPDA相關(guān)的其他關(guān)鍵信號通路。

綜上所述,HCC中HILPDA mRNA表達(dá)過高,且高HILPDA mRNA與較差的OS和PFS有關(guān)。富集分析提示,HILPDA可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境,并通過促進(jìn)Th2、Macrophages細(xì)胞浸潤抑制適應(yīng)性免疫而成為致瘤因子。本研究證明HILPDA是一種潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物,也是一種潛在的免疫治療靶點。