畢建璐 魏敏 孫曉敏 聶曉莉 趙曉山 羅仁

摘要：目的 本研究通過對腎陰虛證和腎陽虛證共同的血漿蛋白差異表達進行研究，挖掘腎虛證的本質。方法 對腎陰虛證、腎陽虛證和健康正常人進行蛋白芯片表達譜的比較研究。結果 選取典型腎陰虛證5例、腎陽虛證5例、正常健康人6例進行蛋白芯片檢測，與正常健康人對比，獲得2組間共同表達上調的差異蛋白BMP-5。結論 腎陰虛、腎陽虛證之間存在著共同的差異蛋白，這可能是2者均有腎虛的表現有關，這為探討腎虛證的發(fā)生機制，特別是在蛋白水平的改變提供了依據。

關鍵詞：腎陰虛證；腎陽虛證；蛋白組學；免疫紊亂

中圖分類號：R692 文獻標志碼：B 文章編號：1007-2349（2023）04-0031-03

腎是人的先天根本，腎藏精，精化氣，即為腎氣，腎氣有陰陽，故腎虛最先表現為腎氣虛，腎氣虧虛日久，則轉化為腎陰虛或腎陽虛，由此可見，腎陰虛與腎陽虛有著共同的物質基礎，那么這些共同物質基礎是否有共同的基因、蛋白的改變？本課題組^［1-4］前期對腎陰虛證、腎陽虛證進行了基因芯片的研究，發(fā)現腎陰虛證、腎陽虛證之間存在多個差異表達基因，但由于其中差異表達基因過多，每個差異表達基因又與多個信號通路、蛋白表達相關，非常復雜，不能深入探討腎虛證的本質。蛋白質是基因表達的產物，能夠更好地反映機體的功能特性，因此，本課題組招募腎陰虛證、腎陽虛證、正常人志愿者，對比三者的蛋白表達，挖掘腎虛證的本質。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在某三甲醫(yī)院招募腎陰虛證5例、腎陽虛證5例，正常健康人6例，其中男3例，年齡分別為30、32、35歲；女3例，年齡分別為年齡32、37、48歲。按1986年頒布的《中醫(yī)虛證辨證參考標準》^［5］判定陰虛證、腎陽虛證。

1.1.1 腎陰虛證的辨證標準^［5］（1）主癥：腰膝酸軟，五心煩熱。（2）次癥：眩暈耳鳴，或耳聾，口燥咽干，潮熱盜汗，或骨蒸發(fā)熱，形體消瘦，失眠健忘，齒松發(fā)脫，遺精，早泄經少，經閉，舌質紅、少津，少苔或無苔，脈細數。（3）診斷：主癥具備2項（腰膝酸軟必備），次癥至少具備2項以上者即可確診。

1.1.2 腎陽虛證的辨證標準^［5］（1）主癥：腰膝酸軟，性欲減退，畏寒肢冷。（2）次癥：精神萎靡，夜尿頻多，下肢浮腫，動則氣促，發(fā)槁齒搖，舌質淡苔白，脈沉遲，尺無力。（3）診斷：主癥具備2項（腰膝酸軟必備），次癥至少具備2項以上者即可確診。

1.1.3 排除標準 （1）年齡小于18歲，或者大于65歲。（2）妊娠或哺乳期婦女。（3）有心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重疾病患者。（4）有精神性疾病的。

1.1.4 主要試劑與儀器^［6-8］人類生物素標記法抗體芯片，美國RayBiotech，貨號：AAH-BLG-1-4）。主要儀器：超凈工作臺，低溫高速離心機（Sigma-Aldrich公司），微量移液器（Eppendoff公司）。

1.2 實驗方法^［6-8］200 μL 1×PBS（pH=8）（20ul血漿＋80 μL 1×PBS）稀釋5倍，并將稀釋液裝入透析管，4℃ 500 mL 1×PBS（pH=8）透析。更換1×PBS再次透析。芯片每個子陣加入400 μL封閉液，室溫孵育30 min。去除封閉液，加400 μL樣品，室溫孵育2 h或4 ℃過夜。去除溶液，芯片放入30 mL離心管，加30 mL 1×洗滌液I，震蕩10 min，去除洗滌液。重復2次。30 mL 1×洗滌液II洗滌芯片。30 mL蒸餾水洗滌，存于-20℃或-80℃。熒光掃描儀，Cy3通道檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 用SAM軟件分析，比較腎陰虛證組、腎陽虛證組與正常對照組的蛋白表達。篩選條件：︱Score（d）︱控制在2倍以上，代表該蛋白可能屬于差異表達（d即difference，代表差值）。

2 結果

芯片掃描分析結果：對腎陰虛證5例、腎陽虛5例、正常健康人6例進行蛋白芯片分析，芯片對比507種靶蛋白，分析得出腎陰虛證組、腎陽虛證與正常健康人之間有明顯差異的上調蛋白BMP-5（見圖1）。檢索公共數據庫后，獲得此差異蛋白的基本信息（見表1）。

3 討論

中醫(yī)認為，腎氣的盛衰是機體生、長、壯、老、已的基石，是人體陰陽的根本。腎氣與人的生長、發(fā)育、生殖，骨骼的生長密切相關。腎氣虧虛則會出現腰膝酸軟、五心煩熱或畏寒肢冷、五更泄瀉、五遲五軟等，腎氣虧虛日久，則會出現腎陰虛或腎陽虛的表現，也就是說，兩者是存在共同的基礎——腎氣虛。本課題組應用蛋白芯片技術，與正常健康人比較，發(fā)現腎陽虛證與腎陰虛證共同的差異表達蛋白骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（BMP5），主要涉及細胞凋亡、骨的合成等方面。中醫(yī)認為，腎藏精，主人體的生長、發(fā)育和生殖，在體合骨，生髓。BMP5也與骨合成相關，與中醫(yī)基礎理論符合。

腎主骨，生髓：骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（bone morphogenetic proteins-5，BMP-5），又名成骨蛋白，屬于轉化生長因子β超家族。目前已知的BMPs數量已經達到30余種。根據氨基酸序列的高度同源性，BMP5、BMP6和BMP7組成了BMPs的一個亞家族，其中hBMP5和hBMP6共同定位于人6號染色體上。在胚胎發(fā)育過程中，其與肢體關節(jié)的形成有關，是骨、軟骨組織修復的必要成分之一^［9］。馬真勝等^［10］應用骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5（BMP-5）cDNA探針來檢測骨折愈合過程中外骨痂內 BMP-5 基因表達的定位與分布。實驗結果提示^［11］，創(chuàng)傷可刺激BMP-5的基因表達，其表達局限于骨折周圍的骨痂區(qū)。其表達可以使骨折的血腫具有成骨能力，是骨折愈合中骨痂形成的重要原因之一。筆者結果也表明，腎陰虛證和腎陽虛證有著共同的差異蛋白--骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5（BMP-5），它與骨和軟骨組織修復有著重要的關系，因此，腎虛證中常見的五軟五遲、腰膝酸軟、發(fā)墮齒稿等可能與BMP-5的異常表達有著密切的聯系。

腎主生長、發(fā)育、生殖：中醫(yī)認為，腎為先天之本，在人體生長、發(fā)育、生殖中起著重要作用。BMP-5可以在發(fā)育中的泌尿道上皮細胞中表達，在胚胎發(fā)育期輸尿管、腎、肺、小腸、眼、乳腺等幾乎胚胎分化中的關鍵均有BMPs的表達，其可反映結腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等多種癌癥的預后^［12-13］。劉偉等^［11］研究Bmp5短耳純合型小鼠的耳廓比正常小鼠耳廓短小，純合型突變畸形小鼠體形較小，胸骨、肋骨等骨骼的發(fā)育較正常小鼠存在明顯異常。Bmp5短耳小鼠模型可用于先天性小耳畸形的研究。BMP-5在胚胎發(fā)育中的作用很可能是“腎藏精”的體現之一。

BMPs參與了胚胎的形成和發(fā)育、細胞的分化、增殖、誘導細胞凋亡。而目前尚無BMP5與中醫(yī)腎病的關系的研究，下一步將針對BMP5進行研究。由于本研究的樣本量偏小，今后將擴大樣本量，尋找腎虛證的差異蛋白、基因，為探討腎虛證的發(fā)生機制，特別是在蛋白水平的改變提供了依據。

參考文獻：

［1］魏敏.腎陰虛證和腎陽虛證基因表達譜的比較研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2009.

［2］魏敏，趙曉山，孫曉敏，等.腎陰虛證患者的基因差異表達［J］.廣東醫(yī)學，2010，31（23）：3017-3020.

［3］魏敏，趙曉山，孫曉敏，等.亞健康狀態(tài)腎陽虛證基因差異表達研究［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，31（2）：248-251.

［4］魏敏，趙曉山，孫曉敏，等.腎陰虛證和腎陽虛證基因表達譜的比較研究［J］.山西醫(yī)科大學學報，2012，43（9）：652-654，722.

［5］沈自尹.中醫(yī)虛證辨證參考標準［J］.中西醫(yī)結合雜志，1986：598.

［6］畢建璐.腎陽虛證和腎陰虛證血漿蛋白表達譜的比較研究［D］.廣州：南方醫(yī)科大學，2011.

［7］畢建璐，魏敏，孫曉敏，等.腎陰虛證血漿蛋白質譜的差異表達［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2017，34（3）：308-313.

［8］畢建璐，魏敏，孫曉敏，等.腎陽虛證血漿蛋白質表達譜的研究［J］.河北中醫(yī)，2017，39（3）：343-347.

［9］Pacifici M，Yang E，Mundy C，et al.Domains with highest heparan sulfate-binding affinity reside at opposite ends in BMP2/4 versus BMP5/6/7：Implications for function［J］. The Journal of biological chemistry，2018，293（37）：14371-14383.

［10］馬真勝，胡蘊玉，呂榮，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白5（BMP5）基因在骨折愈合中的定位研究［J］.中國骨傷，2001（11）：31-32.

［11］劉偉，蔣海越，楊慶華，等.Bmp5短耳小鼠動物模型在先天性小耳畸形研究中的應用［J］.中華整形外科雜志，2019，35（12）：1258-1262.

［12］Karim M A，Samad A，Adhikari U K，et al.A Multi-Omics Analysis of Bone Morphogenetic Protein 5（BMP5）mRNA Expression and Clinical Prognostic Outcomes in Different Cancers Using Bioinformatics Approaches［J］.Biomedicines，2020，8（2）：19.

［13］Chen E，Yang J，Zhao X，et al.MiR-32 promotes tumorigenesis of colorectal cancer by targeting BMP5［J］.Biomedicine & pharmacotherapy=：Biomedecine & pharmacotherapie，2018，106（12）：1046-1051.

（收稿日期：2022-04-08）