龔夢(mèng)華 吳倩雯 李一純 唐佳瑤 林麗莉

摘要：目的 基于NF-κB通路探究捏脊療法對(duì)自閉癥模型大鼠焦慮樣行為及海馬神經(jīng)炎癥的影響。方法 將12只 Wistar 孕鼠隨機(jī)分為正常組和造模組，每組6只。于妊娠12.5 d，2組孕鼠均按體質(zhì)量0.24 mL/100 g，腹腔注射給藥，造模組腹腔注射250 mg/mL丙戊酸鈉溶液（VPA），正常組腹腔注射等體積生理鹽水；所產(chǎn)子代經(jīng)睜眼試驗(yàn)、方向趨向性實(shí)驗(yàn)篩選后確定為自閉癥模型大鼠。造模成功后將自閉癥模型大鼠隨機(jī)分為模型組和捏脊組，每組12只；正常組隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組。捏脊組出生后第23 d開始干預(yù)，每天1次，21遍/次，連續(xù)干預(yù)30 d。末次干預(yù)后采用曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠焦慮水平，Western blot檢測大鼠海馬組織中NF-κB p65、TNFR 1和TNFR 2蛋白表達(dá)，Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組仔鼠比較，造模組仔鼠睜眼時(shí)間更晚，方向趨向性機(jī)能降低（P<0.01）；與正常對(duì)照組比較，模型組Rd值下降（P<0.01），NF-κB p65、TNFR1蛋白和TNF-α mRNA表達(dá)升高（P<0.01）；與模型組比較，捏脊組Rd值明顯上升（P均<0.01），NF-κB p65、TNFR 1蛋白和TNF-α mRNA表達(dá)降低（P<0.01）；3組TNFR 2蛋白和IKKα mRNA表達(dá)水平無差異（P>0.05）。結(jié)論 捏脊療法可有效改善自閉癥大鼠焦慮樣行為，其作用可能是通過抑制NF-κB通路的過度激活而實(shí)現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：捏脊療法；自閉癥；NF-κB通路；焦慮樣行為

中圖分類號(hào)：R244.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2023）04-0081-05

Effect of Chiropractic Therapy on Anxiety-like Behaviorand NF-κB Pathway in Rats with Autism

GONG Meng-hua¹， WU Qian-wen¹， LI Yi-chun¹， TANG Jia-yao¹， LIN Li-li²

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;2. Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of chiropractic therapy on anxiety-like behavior and hippocampal neuroinflammation in rats with autism based on NF-κB pathway. Methods： 12 Wistar pregnant mice were randomly divided into normal group and modeling group， 6 mice each group. At 12.5 days of gestation， the pregnant mice in the two groups were injected intraperitoneally according to their body weight of 0.24mL / 100g. The modeling group was injected intraperitoneally with 250 mg/mL sodium valproate solution （VPA）， and the normal group was injected intraperitoneally with normal saline. The offspring were selected by eye opening test and orientation test as autistic model rats. The model rats were randomly divided into model group and chiropractic group， 12 rats each group. 12 rats in the normal group were randomly selected as the normal control group. In the chiropractic group， intervention began on the 23rd day after birth， once a day， 21 times/time， continuous intervention for 30 days. After the last intervention， the anxiety level of the rats was detected by open field test， the protein expressions of NF-κB p65， TNFR 1 and TNFR 2 in the hippocampus were detected by Western Blot， and the mRNA expressions of TNF-α and IKKα in the hippocampus were detected by Real-time PCR. Results： Compared with that of the normal group， the eye opening time of the rats in the model group was later and the direction-oriented function was decreased （P<0.01）. Compared with that in the normal control group， Rd value in the model group was decreased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR1 protein and TNF-α were increased （P<0.01）. Compared with that in the model group， Rd value in the chiropractic group was significantly increased （P<0.01）， and mRNA expressions of NF-κB p65， TNFR 1 protein and TNF-α were decreased （P<0.01）. There were no differences in the expression levels of TNFR 2 protein and IKKα mRNA among the three groups （P>0.05）. Conclusion： Chiropractic therapy can effectively improve anxiety-like behavior in autistic rats， which may be achieved by inhibiting the over-activation of NF-κB pathway.

【Key words】Chiropractic Therapy; Autism; NF-kB Pathway; Anxiety-like Behavior

自閉癥（ASD）是一種以社會(huì)交往障礙、重復(fù)刻板動(dòng)作和興趣狹窄為核心癥狀的綜合性神經(jīng)發(fā)育障礙性疾，兒童是其主要患病人群，在中國6～12歲的兒童中，ASD患病率約為0.7%^［1-2］。ASD個(gè)體共病率高，其中焦慮是本病最普遍的共病之一，嚴(yán)重焦慮可加重自閉癥核心癥狀，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性行為問題^［3-4］。ASD具有高度異質(zhì)性，且致病因素復(fù)雜，有證據(jù)表明，ASD患者腦內(nèi)誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的上調(diào)與自閉癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)^［5］。

捏脊療法是祖國醫(yī)學(xué)中常用的中醫(yī)外治法，具有調(diào)陰陽、和臟腑、疏經(jīng)絡(luò)、理氣血、培元?dú)?、健脾胃等功?sup>［6^］。臨床研究表明，捏脊療法可顯著改善精神發(fā)育遲滯患兒社交障礙、焦慮等自閉樣行為^［7-9］，但是捏脊通過何種途徑產(chǎn)生效應(yīng)仍尚未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過產(chǎn)前宮內(nèi)暴露戊丙酸鈉（VPA）建立自閉癥模型，探究捏脊療法對(duì)自閉癥模型大鼠焦慮樣行為的影響及其可能機(jī)制，為臨床捏脊療法的推廣應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠雌雄各12只，7～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，恒溫（22±1）℃，每日12h固定照明（8：00開燈），并可自由攝取食物和水，合格證號(hào)為SYXK（閩）2014-001。

1.1.2 主要試劑 丙戊酸鈉（美國sigma公司）；RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：P0013B、RT506、P0010）；NF-κB p65一抗、TNFR1一抗、GAPDH一抗、二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：15506-1-AP、21574-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）；TNFR2一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol（南京諾維贊生物科技有限公司R401-01）；所用引物均由上海尚亞生物公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成。

1.1.3 主要儀器 曠場實(shí)驗(yàn)箱（上海欣軟信息科技有限公司）；PowerPac Universa電泳儀（美國BIO-RAD公司）；ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；Infinite M200 PRP 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 模型制備^［10］育齡期SPF級(jí)Wistar大鼠雌雄各12只，雌雄1∶1合籠過夜，次日清晨查看，觀察雌鼠出現(xiàn)陰栓記為胚胎第0.5天（embryofoday，E0.5）后，將雌雄分籠飼養(yǎng)，并將孕鼠隨機(jī)分成正常組和造模組。2組孕鼠均按體質(zhì)量0.24 mL/100 g，腹腔注射給藥，造模組腹腔注射250 mg/mL丙戊酸鈉溶液（VPA），正常組腹腔注射等體積生理鹽水；所產(chǎn)子代經(jīng)方向趨向性實(shí)驗(yàn)、睜眼實(shí)驗(yàn)篩選后確定為自閉癥模型鼠。

1.2.1.2 發(fā)育行為學(xué)檢測 仔鼠出生一周后進(jìn)行發(fā)育行為學(xué)檢測，與正常組比較，篩選出具有明顯自閉癥樣行為的小鼠為自閉癥模型鼠。仔鼠出生當(dāng)日為產(chǎn)后第1天，記PN1（postnatal day，PN）。（1）方向趨向性檢測：于PN7～PN10對(duì)仔鼠進(jìn)行檢測，將仔鼠頭朝向下方置于傾斜角度25°的光滑斜板上，記錄其轉(zhuǎn)身角度180°所需時(shí)間。（2）睜眼試驗(yàn)：于幼鼠PN12～PN16時(shí)觀察其睜眼情況，以未睜眼記０分、睜1只眼記1分、全睜眼記為2分。

1.2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組及捏脊干預(yù) 造模成功后將自閉癥模型大鼠隨機(jī)分為模型組和捏脊組，每組12只，正常組隨機(jī)選取12只作為正常對(duì)照組。捏脊組PN23開始干預(yù)，每日3：00～5：00pm（膀胱經(jīng)循行時(shí)間段）進(jìn)行捏脊，1次/d，21遍/次（根據(jù)課題組前期研究結(jié)果確定^［7］），連續(xù)干預(yù)30 d。

捏脊的具體操作方法：實(shí)驗(yàn)者左手以毛線手套蓋住大鼠頭部并以輕柔的方式固定，右手的拇指指腹與食中二指相對(duì)用力，捏起大鼠脊柱兩側(cè)的皮膚進(jìn)行提捏。仿照臨床上對(duì)人類捏脊的手法，從大鼠脊中線尾根部開始，邊捏邊向上推移，捏3提1，一直捏到大椎穴處停止，計(jì)為1遍，手法的刺激強(qiáng)度以大鼠忍耐為度（即大鼠不發(fā)出尖叫，較平靜）。捏脊療法中涉及到的相關(guān)穴位按《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》比照人體穴位來選取。

1.2.1.4 組織標(biāo)本的采集 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開始禁食、禁水，24h之后用戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉大鼠后斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側(cè)視神經(jīng)后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個(gè)腦組織。按照《大鼠腦立體定位圖譜》剝離兩側(cè)海馬，用0.9% 氯化鈉溶液沖洗干凈，置于事先做好標(biāo)記的凍存管中，經(jīng)液氮速凍后取出，轉(zhuǎn)存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 曠場試驗(yàn) 末次干預(yù)后（PN53）進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。利用SuperMaze軟件在曠場箱內(nèi)劃分中央?yún)^(qū)和邊緣區(qū)，優(yōu)先記錄實(shí)驗(yàn)鼠在曠場箱內(nèi)5min（T）活動(dòng)的總距離（DT）和中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離（Dc），計(jì)算出小鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離占總活動(dòng)距離的比值Rd（Rd=Dc/DT）。比較各組Rd值，數(shù)值越小焦慮程度越高。

1.2.2.2 Western blot檢測海馬組織中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表達(dá) 稱取凍存的海馬組織置入勻漿器，PBS沖洗后加入RIPA 裂解緩沖液，研磨離心后提取蛋白、BCA法測定濃度。配制電泳所需的分離膠與濃縮膠，上樣到 SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，每條泳道蛋白樣品上樣量為20μg。電泳時(shí)，恒流200mA電流轉(zhuǎn)膜，1.5 h。轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育（NF-κB p65、TNFR1、TNFR2、GAPDH抗體，1∶400）、二抗孵育、使用ImageLab系統(tǒng)進(jìn)行圖象掃描和結(jié)果分析。

1.2.2.3 Real-time PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達(dá)水平 取各組大鼠海馬組織樣本，采用RT-PCR檢測大鼠海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA表達(dá)水平。提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA按擴(kuò)增流程進(jìn)行擴(kuò)增，StepOneSoftwarev2.2.2收集數(shù)據(jù)，延伸結(jié)束后收集熒光。根據(jù)擴(kuò)增曲得出每個(gè)樣品的Ct值（thresholdcycle，Ct值），由此算出基因的相對(duì)表達(dá)量（管家基因/參照基因：GAPDH）。引物序列見表1所列。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS26.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步采用LSD檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的以中位數(shù)和四分位數(shù)來表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 模型制備-發(fā)育行為學(xué)檢測

2.1.1 2組仔鼠方向趨向性測試結(jié)果比較 見圖1。

2.1.2 2組仔鼠睜眼實(shí)驗(yàn)評(píng)分比較 見圖2。

2.2 各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見表2。

2.3 各組海馬組織中NF-κB p65、TNFR1和TNFR2蛋白表達(dá)比較 見表3。

2.4 各組海馬組織中TNF-α、IKKα mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以VPA誘導(dǎo)的ASD模型大鼠作為研究對(duì)象，該模型在可重復(fù)性、表面效度、構(gòu)建效度和預(yù)測效度等方面均受到廣泛認(rèn)可^［11］。然而目前ASD模型的確立仍缺乏較統(tǒng)一的生物學(xué)指標(biāo)，其構(gòu)建成功與否主要依賴于子代發(fā)育行為學(xué)評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組仔鼠比較，造模組仔鼠出現(xiàn)睜眼時(shí)間延后及方向趨向性機(jī)能降低的特點(diǎn)，這表明造模組仔鼠存在生長發(fā)育遲緩、前庭功能及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)機(jī)能低下的特點(diǎn)，符合臨床上自閉癥患兒的發(fā)育行為學(xué)特征，提示ASD模型制備成功。

《難經(jīng)》曰：“督脈者……上至風(fēng)府，入屬于腦^［12］?！倍矫}自人體尾骶部而起終入絡(luò)腦，上輸臟腑精微，若督脈虧虛瘀滯，則腦髓虛空而致病。因此，素有“病變?cè)谀X，首取督脈”之說。捏脊療法的記載首見于晉·葛洪的《肘后備急方》：“治卒腹痛……拈取其脊骨皮，深取痛引之，從龜尾至頂乃止，未愈更為之”，其主要作用于督脈和膀胱經(jīng)，能夠起到通督調(diào)神、治療神志病的作用^［6］。曠場實(shí)驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于鋸齒類動(dòng)物焦慮及抑郁行為測試中，觀察被測試動(dòng)物在面對(duì)新環(huán)境時(shí)出現(xiàn)的興奮性和適應(yīng)性表現(xiàn)，分析其焦慮水平，其中“中央?yún)^(qū)活動(dòng)距離比值（Rd）”為測試ASD模型焦慮水平的常用指標(biāo)^［13］。

NF-κB信號(hào)通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。NF-κB普遍存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在靜息狀態(tài)下以p65/p50二聚體的形式被核因子κB（inhibitor of nuclear factor kappa-Bα，IκBα）結(jié)合并錨定在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在信號(hào)分子的作用下，IκBα的激酶 IKKα /β 被磷酸化并激活，IκBα發(fā)生磷酸化并降解，使NF-κB暴露并增強(qiáng)核定位信號(hào)，由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)，產(chǎn)生炎性因子^［14-15］。NF-κB調(diào)控轉(zhuǎn)錄的炎性因子具有正反饋的瀑布效應(yīng)^［16］，在自閉癥發(fā)生、發(fā)展過程中，NF-κB被激活，活化后的NF-κB可促進(jìn)大量炎性因子的釋放，而這些因子亦可反作用于NF-κB的激活，從而放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、破壞血腦屏障并導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)元損傷，最終影響認(rèn)知功能及焦慮抑郁樣行為^［17］。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）作為一種多效性細(xì)胞因子，由過度活化的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，參與神經(jīng)炎癥、細(xì)胞存活等多種生物學(xué)活動(dòng)，TNF-α及其跨膜受體腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor，TNFR1）是有效的促炎細(xì)胞因子，在引發(fā)和維持炎癥反應(yīng)中起著核心作用^［18］。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VPA誘導(dǎo)的自閉癥模型大鼠焦慮樣行為與海馬組中NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表達(dá)明顯升高有關(guān)。NF-κB p65高度表達(dá)，可促進(jìn)炎性因子TNF-α釋放，TNF-α不僅可以直接產(chǎn)生神經(jīng)毒性，亦可通過與TNFR1結(jié)合而引發(fā)NF-κB的瀑布效應(yīng)，導(dǎo)致ASD反應(yīng)的發(fā)展和加重，進(jìn)而誘發(fā)或加重焦慮樣行為。予以捏脊療法干預(yù)后，海馬組織中的NF-κB p65、TNF-α和TNFR1表達(dá)均明顯減少，提示捏脊療法可通過抑制神經(jīng)炎癥的過度反應(yīng)，達(dá)到改善ASD焦慮樣行為的作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF所引起的NF-κB激活在IKKα和IKKβ雙缺陷小鼠身上被完全消除，因此，IKKα和IKKβ被認(rèn)為是NF-κB激活中必不可少的一環(huán)^［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組和捏脊組海馬組織中IKKα表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在TNF介導(dǎo)的NF-κB激活途徑中，激酶IKKβ或許扮演著更為重要的角色。

綜上，捏脊療法可顯著改善ASD模型大鼠焦慮樣行為，其作用可能是通過抑制NF-κB炎癥通路的過度激活，減輕大腦炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。自閉癥的發(fā)生、發(fā)展與小腦、皮質(zhì)和胼胝體等多個(gè)腦區(qū)有關(guān)，然而本實(shí)驗(yàn)因技術(shù)、時(shí)間有限，未涉及其它自閉癥相關(guān)腦區(qū)，這將是本團(tuán)隊(duì)下一步研究方向，為臨床實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2022-08-10）