林潔華 周 賽 吳光付 劉雅詩(shī) 李貴娟

廣東省江門(mén)市五邑中醫(yī)院 1 腎病科 2 三門(mén)診 529000

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)常見(jiàn)而且較嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]。DN起病隱匿,早期往往無(wú)明顯臨床癥狀,隨著病情逐漸進(jìn)展,會(huì)出現(xiàn)高血壓、尿蛋白陽(yáng)性等癥狀,進(jìn)入DN蛋白尿期,最終發(fā)展至終末期腎功能衰竭,這是糖尿病致死最重要的原因之一[2]。DN早期,多種促炎癥因子如CRP、IL-6、TNF-α等會(huì)出現(xiàn)不同程度的升高,與TGF-β、NF-кB構(gòu)成炎癥因子網(wǎng)絡(luò),參與了DN及DM微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。大量研究顯示IL-23介導(dǎo)Th17的炎癥反應(yīng)生成IL-23/Th17炎癥軸參與了慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[5-6],可能是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

腎康丸是經(jīng)過(guò)臨床可以有效治療DN的經(jīng)驗(yàn)方劑,可以延緩DN病情進(jìn)展以及腎衰竭的發(fā)生。前期研究顯示:腎康丸可以降低脾腎氣虛血瘀型T2DM尿毒癥患者的炎癥因子水平、改善腎功能,并且可以作用于早期臨床DN患者及DN大鼠模型炎癥因子網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生腎保護(hù)[7]。本研究建立了DN大鼠模型,通過(guò)檢測(cè)IL-23/Th17炎癥軸相關(guān)細(xì)胞因子的水平,初步探討IL-23/Th17炎癥軸對(duì)T2DM大鼠腎臟損傷的作用及可能的機(jī)制;進(jìn)一步通過(guò)腎康丸作用于DN大鼠,觀察其對(duì)于T2DM大鼠IL-23/Th17炎癥軸表達(dá)的影響,為DN的防治尋找新的理論依據(jù),促進(jìn)腎康丸的推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。8～12周齡SPF 級(jí)雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量為(220±20)g。大鼠自由飲水?dāng)z食,溫度25℃,相對(duì)濕度50%,適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑。腎康丸(組成:黃芪、芡實(shí)、金櫻子、玉米須等)、STZ(ABT650,美國(guó)Sigma公司)、檸檬酸緩沖液、4%多聚甲醛(PT028S,上海博古生物有限公司)、IL-1 ELISA試劑盒(CSB-E08055r, 武漢華美生物工程有限公司)、IL-6 ELISA試劑盒(ab100772,美國(guó)Abcam公司)、IL-8 ELISA試劑盒(386m0914,天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司)、IL-17 ELISA試劑盒(CSB-E07451r, 武漢華美生物工程有限公司)、IL-22 ELISA試劑盒(CSB-E13418h,武漢華美生物工程有限公司)、IL-23 ELISA試劑盒(I11018354,武漢華美生物工程有限公司)、TNF-α ELISA 試劑盒(ab100785,美國(guó)Abcam公司)、TGF-β ELISA 試劑盒(ab119558,美國(guó)Abcam公司)、PCNA抗體(ab92552,美國(guó)Abcam公司)、TGF-β抗體(AF1027,Affinity)、NF-κB抗體(ab220803,美國(guó)Abcam公司)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP) 標(biāo)記IgG 抗體(BHR101,北京博爾西科技有限公司)、FITC-IL17A抗體(11-7177-81,上海北諾生物科技有限公司)、Trizol(CW0580,康為世紀(jì)公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(639503,Takara公司)、q-RT-PCR試劑盒(RR430S,Takara公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 T2DM大鼠模型構(gòu)建。隨機(jī)選取10只大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料正常喂養(yǎng)設(shè)定為正常對(duì)照組(CT組)。20只大鼠用于T2DM模型構(gòu)建,采用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠8周后,對(duì)小鼠進(jìn)行禁食處理12h,隨后腹腔注射STZ-檸檬酸緩沖液(60mg/kg),72h后尾靜脈采血測(cè)血糖,連續(xù)2次空腹血糖(FBG)≥13.5mmol/L者即為T(mén)2DM大鼠模型成功,設(shè)定為模型組(DN組);正常對(duì)照組大鼠注射相同體積的檸檬酸緩沖液。

1.2.2 分組與給藥。將構(gòu)建成功的T2DM模型大鼠隨機(jī)分為兩組:模型組(DN組)和腎康丸治療組(SK組),每組10只。SK組大鼠每天通過(guò)灌胃給予腎康丸350mg,相當(dāng)于成人每天服用18g;CT組和DN組大鼠每天通過(guò)灌胃給予等量的生理鹽水。各組大鼠均連續(xù)給藥8周。

1.3 樣本采集和指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本采集和處理。隨機(jī)選取CT、DN和SK組大鼠各6只,禁食12h后稱量大鼠體重,采用腹腔注射水合氯醛(10%,300mg/kg)的方法對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉,隨后采集腹主動(dòng)脈血液,一部分保留全血用于流式細(xì)胞檢測(cè),一部分靜置后3 000r/min,離心15min,分離血清,用于生化指標(biāo)檢測(cè)。處死大鼠后選取左側(cè)腎臟,用PBS沖洗干凈,去包膜和腎周脂肪組織,取一半置于4%多聚甲醛中固定保存用于免疫組化染色,另一半右腎放入液氮保存,用于q-RT-PCR檢測(cè)。

1.3.2 血清生化指標(biāo)及炎癥因子表達(dá)水平檢測(cè)。各組大鼠全血采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞含量;分離血清;隨后利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中C反應(yīng)蛋白(CPR)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平,采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL8水平,具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.3 腎臟組織 TNF-α、IL-17、IL-23、TGF-β和NF-κВ mRNA表達(dá)水平檢測(cè)。提取腎臟組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平,利用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 大鼠PCDNA、TGF-β、NF-κB陽(yáng)性面積。對(duì)PFA固定好的腎臟組織進(jìn)行逐級(jí)脫水,隨后進(jìn)行石蠟包埋,切片后經(jīng)過(guò)脫蠟、抗原修復(fù)等過(guò)程進(jìn)行PCDNA、TGF-β、NF-κB免疫組化染色,并用顯微鏡拍攝圖像。采用ImageJ-ProPlus6.0 對(duì)圖像中的陽(yáng)性反應(yīng)部位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血清生化水平 DN組大鼠Scr、BUN和CRP水平相對(duì)于CT組顯著升高(P<0.05),SK組Scr、BUN和CRP水平較DN組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Scr、BUN、CRP水平對(duì)比

2.2 IL-23/Th17炎癥軸相關(guān)細(xì)胞因子 與CT組相比,DN組大鼠血清的TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL-8、Th17水平顯著升高(P<0.05);SK組大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-17、IL-22、IL-23、TGF-β、IL-6、IL-8、Th17水平較DN組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清IL-23/Th17炎癥軸相關(guān)細(xì)胞因子水平對(duì)比

2.3 大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達(dá)水平 DN組大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達(dá)水平與CT組相比顯著上調(diào)(P<0.05);與DN組相比,SK組TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎臟TNF-α、IL-16、IL-23、TGF-β、NF-κB mRNA表達(dá)水平對(duì)比

2.4 大鼠腎臟PCNA百分比和TGF-β、NF-κB的陽(yáng)性面積 通過(guò)免疫組化染色發(fā)現(xiàn):與CT組相比,DN組PCNA的棕色陽(yáng)性區(qū)域顯著增加,說(shuō)明DN組腎小球的細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)(P<0.05);而腎康丸治療后SK組陽(yáng)性面積顯著減少,說(shuō)明PCNA表達(dá)顯著下降(P<0.05)。且DN組TGF-β、NF-κB陽(yáng)性面積相比于對(duì)照組顯著升高(P<0.05),SK組相對(duì)于DN組TGF-β、NF-κB陽(yáng)性表達(dá)顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腎臟PCNA百分比和TGF-β、NF-κB陽(yáng)性面積對(duì)比

3 討論

DN是糖尿病患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,同時(shí)也是引起終末期腎病(End stage renal disease,ESRD)的主要誘因之一。近些年來(lái),我國(guó)DN的發(fā)病率也出現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[8]。研究表明,當(dāng)人體血液長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境時(shí),體內(nèi)糖代謝會(huì)出現(xiàn)紊亂,誘導(dǎo)腎臟產(chǎn)生過(guò)量的活性氧,促使大量炎癥因子的合成、釋放,進(jìn)而引發(fā)腎臟產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致腎細(xì)胞壞死,最終引發(fā)終末期腎病[9-11]。DN一旦發(fā)展為末期腎病,治療難度增加,且效果不佳。因此,糖尿病患者中DN的及時(shí)防治,對(duì)腎組織的保護(hù)意義重大[12]。

腎康丸是魏連波教授通過(guò)多年的臨床觀察與摸索,篩選提煉的治療DN經(jīng)驗(yàn)方劑。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),腎康丸具有益氣健脾、滋陰養(yǎng)腎等功效,可以作用于早期臨床DN患者及DN大鼠模型炎癥因子網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生腎保護(hù),并且對(duì)脾腎氣虛血瘀型T2DM尿毒癥患者具有降低炎癥因子、改善腎功能的作用,可多方面延緩DN的發(fā)生、發(fā)展[7,13-14]。研究發(fā)現(xiàn),IL-23可以促進(jìn)輔助性T細(xì)胞17(Th17)分泌IL-17、IL-21等多種炎癥因子,進(jìn)而引發(fā)腎臟的局部炎癥反應(yīng)[15]。此外,多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),在DN早期存在多種促炎癥因子(如TNF-α、CRP和IL-6等)顯著升高,與TGF-β、NF-кB構(gòu)成炎癥因子網(wǎng)絡(luò),參與了DN及DM微血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

在本研究中,與CT組相比,DN模型組大鼠血清中IL-23、IL-17、IL-21等炎癥因子及Th17細(xì)胞比例水平顯著升高,提示IL-23/Th17炎癥軸可能DN大鼠的腎臟損傷。而與DN組大鼠相比,腎康丸治療組大鼠IL-23/Th17炎癥軸相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平下降,說(shuō)明腎康丸治療可以調(diào)控IL-23/Th17炎癥軸從而對(duì)DN大鼠的腎臟起保護(hù)作用。此外,DN組IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥因子的表達(dá)水平顯著上升。研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)高血糖可以導(dǎo)致腎臟內(nèi)性氧及糖基化終末產(chǎn)物增加,啟動(dòng)炎性反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙,進(jìn)而激活NF-кB信號(hào)通路,增強(qiáng)NF-кB活性,進(jìn)一步促進(jìn)TNF-α、TGF-β等趨化因子和細(xì)胞黏附分子的釋放增加[16]。過(guò)量的IL-6、TNF-α、TGF-β可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,炎癥水平升高,NF-кB可影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等多種信號(hào)通路的表達(dá),導(dǎo)致血管細(xì)胞損傷及血管生成,促進(jìn)DN的發(fā)生[17]。而在本研究中,DN組大鼠IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)水平顯著上升,而腎康丸治療之后相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平顯著下降,提示腎康丸可能通過(guò)調(diào)控IL-23/Th17炎癥軸,減少NF-кB等炎癥因子的表達(dá),通過(guò)減輕DN患者的炎性反應(yīng),緩解疾病的發(fā)展進(jìn)程。此外,DN組大鼠PCNA陽(yáng)性面積的顯著升高,而腎康丸治療組可以顯著降低PCNA的陽(yáng)性面積,提示腎康丸可以降低DN組細(xì)胞增殖的異常升高。

綜上所述,腎康丸可改善糖尿病腎臟損傷,其作用機(jī)制可能與抑制IL-23/Th-17炎癥通路,進(jìn)而抑制IL-6、TNF-α、TGF-β、NF-кB等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)以及腎小球細(xì)胞的異常增殖有關(guān)。腎康丸在細(xì)胞、分子水平對(duì)IL-23/Th-17炎癥通路的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究。