劉旭佳,何緒剛,賴俊翔,黃國強,侯 杰

(1 廣西科學(xué)院,廣西海洋科學(xué)院,廣西近海海洋環(huán)境科學(xué)重點實驗室,廣西 南寧 530007;2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,湖北 武漢 430070;3 廣西海洋研究所有限責(zé)任公司,廣西 北海 536000;4 北部灣海洋產(chǎn)業(yè)研究院,廣西 防城港 538000;5 廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,廣西 南寧 530200)

對蝦池塘養(yǎng)殖污染問題是由高密度養(yǎng)殖與大量投飼引起的,在飼料輸入中,14.5%～28.7%氮和7.5%～16.5%磷轉(zhuǎn)化為對蝦生物量,而其余以非可溶性與可溶性狀態(tài)留在養(yǎng)殖系統(tǒng)中,最終直接外排[1-2]。如果不進行有效處理,有機富集沉積物中的氮超過了養(yǎng)殖系統(tǒng)的凈化能力,可能會通過含氮化合物(如氨和亞硝酸鹽)的積累導(dǎo)致水質(zhì)惡化,對對蝦健康生長產(chǎn)生負面影響。對蝦海水養(yǎng)殖池塘面臨的水質(zhì)污染、病害滋生與水產(chǎn)品安全三大問題,三者之間相互關(guān)聯(lián),最根本的原因是養(yǎng)殖池塘生態(tài)環(huán)境受到破壞,繼而誘發(fā)疾病,病害頻發(fā)致使藥物濫用,最終導(dǎo)致質(zhì)量安全問題。這些問題由池塘養(yǎng)殖模式產(chǎn)生的,因此修復(fù)池塘養(yǎng)殖環(huán)境、創(chuàng)新養(yǎng)殖模式才是解決對蝦池塘養(yǎng)殖問題的關(guān)鍵所在。對蝦養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生大量廢棄物未經(jīng)任何處理直接外排導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境問題,已經(jīng)引起全世界范圍內(nèi)越來越多的關(guān)注[2-4]。

隨著中國環(huán)保政策持續(xù)高壓,池塘養(yǎng)殖尾水生態(tài)處理必將成為今后池塘健康養(yǎng)殖的亟需技術(shù)。國內(nèi)外研究人員一直將微生物系統(tǒng)處理作為循環(huán)水養(yǎng)殖或者尾水處理的核心[5]。養(yǎng)殖實踐表明,固形廢棄物高效收集與利用是養(yǎng)殖系統(tǒng)與尾水處理的首要關(guān)鍵問題[6-8],國內(nèi)外工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖一般采用弧形篩或者顆粒物分離器通過不斷反沖洗去除固形廢棄物[5],但并未進行收集再利用,本質(zhì)上是一種將面源污染變?yōu)辄c源污染的處理方式。因此,固形廢棄物集污效率是零排放養(yǎng)殖系統(tǒng)與模式的重要研究內(nèi)容。人工濕地作為一種生態(tài)友好、效率高、成本低、操作簡單的尾水處理工藝,可以高效去除養(yǎng)殖尾水中氮磷[9-11]。目前,人工濕地在海水池塘養(yǎng)殖廢水處理研究還處于起步探索階段[12-13]。本試驗參照垂直流人工濕地工藝,采用上向折流式布局,研究三級上向垂直流處理桶中基質(zhì)填料以及微生物對養(yǎng)殖尾水處理效果。

研究了對蝦海水池塘養(yǎng)殖固形廢棄物集污效率以及三級上向垂直流尾水處理技術(shù),以期為對蝦池塘養(yǎng)殖環(huán)境修復(fù)技術(shù)提供新的思路和解決方案,為中國海水對蝦池塘健康養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 集污沉淀塔與尾水處理原理

1.2 試驗設(shè)計

(1)固形廢棄物集污效率

在廣西北海市合浦縣閘口鎮(zhèn)選擇3個養(yǎng)殖場,池塘養(yǎng)殖面積、投苗數(shù)量、苗種規(guī)格、養(yǎng)殖周期、養(yǎng)成規(guī)格、養(yǎng)殖產(chǎn)量以及存活率見表1,表1為2020年3個養(yǎng)殖場第一茬的養(yǎng)殖情況。

表1 3個對蝦養(yǎng)殖場的基本情況Tab.1 Basic situation of three shrimp breeding experiment farms

養(yǎng)殖前先進行蝦塘改造,將蝦塘底部改為鍋底狀,開挖底部預(yù)埋集污管,池塘中央鋪設(shè)集污管道(PVC材質(zhì)),直徑110 mm,管道終端與相同孔徑的集污管道相連,管道從蝦塘底部延伸至沉淀塔,由4 kW真空泵進行吸污,底部鋪設(shè)黑膜。3個試驗池塘均配置2個沉淀塔,沉淀塔架設(shè)在蝦塘陸基岸上(具體參數(shù)見圖2),沉淀塔底部為錐形,設(shè)置開關(guān)閥,用于固形廢棄物定時排出與收集,計算不同養(yǎng)殖階段固形廢棄物的集污效率。

圖2 沉淀塔(左)與處理桶(右)的具體參數(shù) Fig.2 Specific parameters of sedimentation tower(left)and processing bucket(right)

(2)三級上向垂直流尾水處理試驗

沉淀塔出口(進三級處理桶之前)需要增加一個三通(出水閥門)。尾水處理系統(tǒng)運行時間是2020年6月20日,三級處理桶毛刷進行自然掛膜,在8月20日將一級處理桶進行充氣,溶氧(DO)保持在1.5 mg/L左右,二級處理桶不曝氣,三級處理桶曝氣,DO保持在5 mg/L左右。

(3)對蝦飼料表觀消化率試驗

計算對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)生固形廢棄物集污效率涉及對蝦飼料表觀化率,因此在室內(nèi)開展對蝦飼料表觀消化率試驗。

飼料制作:購買廣東海大南美白對蝦商品飼料,選用粒徑為1.2 mm、1.6 mm、2.0 mm的0號料各5 kg,粉碎后過60 目篩,按0.1%含量加三氧化二釔(Y2O3),邊加水邊攪拌,混合均勻后制粒。壓制成相應(yīng)粒徑的顆粒飼料,風(fēng)干后放入-20 ℃冰箱中保存待用。

養(yǎng)蝦管理:2020年6月5日,選擇粵海蝦苗0.5萬尾,規(guī)格0.02 g/尾,在廣西科學(xué)院、廣西海洋研究所竹林海水增養(yǎng)殖基地D2棟車間進行暫養(yǎng),養(yǎng)殖5 d后,分出規(guī)格均勻200尾進行表觀消化率試驗。試驗裝置為PVC箱,數(shù)量10個,體積為120 L(50 cm×40 cm×60 cm),每日分別07:00,11:00和17:00進行飽食投喂,飼料量分別占日投喂量的40 %、20 %、40 %。對蝦養(yǎng)殖至8月18日,共74 d。試驗期間海水鹽度29～31,pH7.9～8.1,DO保持在5.0 mg/L,光照周期為自然光照周期,約14L∶10D。養(yǎng)殖期間,PVC箱用1 cm網(wǎng)眼的網(wǎng)片遮蓋以防止其跳出。

1.3 樣品收集與處理

(1)集污樣品的采集

在3個養(yǎng)殖場,養(yǎng)殖期間每20 d連續(xù)抽取污水3次,污水以抽污時出水口的污水變清澈時為準(zhǔn),記錄抽入沉淀塔污水的總體積。將底層沉積物全部取出,攪拌均勻后用1 L的采水器取3個樣品,分別置于1 L的錐形瓶中靜置4 h,完全沉淀后用虹吸法抽取上清液作為廢水樣品。將底層的沉淀物倒入玻璃皿中,60 ℃烘干稱重,冷藏待測,記錄固形廢棄物總干重。

(2)三級上向垂直流處理桶尾水樣品收集

(3)毛刷細菌樣品收集

在C養(yǎng)殖場,8月1日分別在三級處理桶取樣,剪刀用75 %乙醇消毒,剪取少量毛刷。樣品未經(jīng)曝氣增氧的分別標(biāo)記為B1、B2、B3。9月21日再次在三級處理桶取樣,標(biāo)記為B4、B5、B6。所有樣品采集后立即放入液氮中保存。

(4)對蝦飼料表觀消化率糞便樣品的采集

用添加0.1 % Y2O3蝦料投喂,每20 d連續(xù)5 d收集糞便與殘飼。采用虹吸法收集糞便與殘飼于燒杯中,60 ℃烘干后冷藏待測。

1.4 樣品測定

(1)集污效率測定

集污效率包括固形廢棄物以及總氮(TN)集污效率,固形廢棄物集污效率為沉淀塔收集固形廢棄物的總量與用對蝦表觀消化率計算產(chǎn)生固形廢棄物總量的比值;TN集污效率為沉淀塔收集TN含量與用對蝦對飼料TN表觀消化率計算產(chǎn)生TN含量的比值。沉淀塔收集的TN由固形廢棄物中的TN和溶解在水體中的TN組成。表觀消化率按照水產(chǎn)動物表觀消化率測定方法[14];飼料、糞便和固形物TN采用元素分析儀VarioEL III CHONS analyzer(Elementar Analysensysteme GmbH,Germany);三氧化二釔(Y2O3)采用離子體發(fā)射光譜儀(IVAO200,Singpore),消化法測定釔含量。水中TN含量測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[15]。

(2)集污效率計算

① 對蝦對飼料的表觀消化率計算公式為:

(1)

式中:D是對蝦對飼料的表觀消化率;Md是飼料中Y2O3百分含量;Mf是糞便中Y2O3含量。

② 對蝦對飼料TN的表觀消化率的計算公式為:

(2)

式中:Dd是對蝦對飼料TN的表觀消化率;Nf是糞便中TN的百分含量;Nd是飼料中TN的百分含量;Md是飼料中Y2O3百分含量;Mf是糞便中Y2O3百分含量。

③ 固形廢棄物集污效率的計算公式為:

(3)

式中:ωs是固形廢棄物集污效率;Ms是收集的固形廢棄物總質(zhì)量(kg);Mf是投喂飼料質(zhì)量(kg);D是對蝦對飼料的表觀消化率。

④ TN集污效率的計算公式為:

(4)

式中:ωN是集污裝置對總氮的集污效率;Ns是收集的固形廢棄物中總氮含量(g);Nd是排污溶解于廢水中的總氮含量(g);Nf是投喂飼料中總氮含量(g);Dd是對蝦對飼料中氮的表觀消化率。

(3)尾水水質(zhì)指標(biāo)測定

(4)生物毛刷細菌樣品分析

將每個樣品剪碎,用E.Z.N.A Water DNA Extraction Kit試劑盒(Omega Bio-Tek,USA)提取DNA。對16S rDNA基因可變區(qū)V3～V4區(qū)進行PCR擴增,所用引物序列為細菌特異性引物:341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測,送百邁克生物信息公司(北京)進行基于Illumina HiSeq 2500測序平臺,利用雙末端測序的方法,構(gòu)建小片段文庫進行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)采用Excel與SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計與分析,不同試驗組比較采用單因子方差分析,P<0.05認(rèn)為差異顯著。

首先使用Trimmomatic v0.33軟件,對測序得到的 Raw Reads進行過濾;然后使用Cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除,得到不包含引物序列的高質(zhì)量Reads;使用Flash v1.2.7軟件,通過overlap對每個樣品高質(zhì)量的 Reads 進行拼接,得到的拼接序列即Clean Reads;使用 UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective Reads)。使用Usearch軟件對Reads在97.0%的相似度水平下進行聚類、獲得OTU。以SILVA為參考數(shù)據(jù)庫使用樸素貝葉斯分類器對特征序列進行分類學(xué)注釋,得到每個特征對應(yīng)的物種分類信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 集污效率

經(jīng)測定,不同養(yǎng)殖時期對蝦對飼料的表觀消化率分別為80.9%±0.4%、81.0%±0.2%、81.3%±0.6%,且不同時期表觀消化率間無顯著差異(P>0.05);對蝦對飼料TN表觀消化率分別為83.8%±0.3%、84.7%±1.2%、89.6%±2.4%,不同養(yǎng)殖期間無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 對蝦的表觀消化率和集污效率Tab.2 White shrimp apparent digestibility and sewage efficiency

在3個養(yǎng)殖場對蝦實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中,C養(yǎng)殖場是從中培苗開始養(yǎng)殖,因此C養(yǎng)殖場只進行中期和后期固形廢棄物集污率計算。根據(jù)集污效率計算公式得出:沉淀塔對固形廢棄物集污效率分別為10.6%±1.8%、31.1%±5.7%、52.2%±5.2%,養(yǎng)殖前期、中期與后期固形廢棄物集污效率差異顯著(df=2,F=63.983,P=0.001),3個時期間差異均顯著(P<0.05)。TN集污效率分別為1.4%±0.2%、3.4±0.6%、9.1±0.1%,養(yǎng)殖前期、中期與后期TN集污率差異顯著(df=2,F=307.970,P=0.000),3個時期間差異均顯著(P<0.05)(表2)。其中,養(yǎng)殖前期20 d取樣時間點,是在次日早上收集前日產(chǎn)生固形廢棄物,殘飼與糞便等有機質(zhì)經(jīng)過長時間礦化分解,所以導(dǎo)致固形廢棄物集污效率與TN集污率均較低。在中期21～50 d和后期51～70 d取樣時,在第一次投喂前將蝦塘底部固形廢棄物全部抽出,然后再投喂,2 h后開始抽污。隨著對蝦規(guī)格生長,投喂量大幅增加,因此中后期對蝦養(yǎng)殖固形廢棄物集污效率與TN集污率顯著增加(P<0.05)。

2.2 三級上向垂直流處理桶中溶氧變化

三級上向垂直流處理桶DO變化見圖3。

圖3 三級上向垂直流處理桶溶氧變化Fig.3 Change of dissolved oxygen content in the three-stage upward vertical flow processing bucket

6月20日至8月20日,選擇C養(yǎng)殖場,將三級處理桶中生物毛刷進行自然掛膜,8月20日在一級處理桶和三級處理桶分別安裝充氣泵進行曝氣增氧,至8月25日上清液、一級處理桶、二級處理桶、三級處理桶中DO含量分別在5.38～8.54 mg/L、0.34～3.31 mg/L、0.16～0.56 mg/L、0.31～4.05 mg/L范圍。8月25日后三級處理桶中DO基本保持穩(wěn)定,上清液與三級處理桶DO含量分別為5.00～7.38 mg/L、1.11～1.98 mg/L、0.27～0.45 mg/L、4.60～5.82 mg/L。

對蝦池塘養(yǎng)殖過程中溫度變化范圍29.0～33.9℃,pH 7.89～9.04,鹽度變化范圍10.27～12.27。

2.3 三級上向垂直流處理桶尾水生物水質(zhì)分析

圖4 三級上向垂直流處理桶中總氮變化Fig.4 Change of total nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

圖5 三級上向垂直流處理桶中總磷變化Fig.5 Changes of total phosphorus content in three-stage upward vertical flow processing bucket

圖6 三級上向垂直流處理桶氨氮變化Fig.6 Change of ammonia nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

圖7 三級上向垂直流處理桶亞硝酸鹽氮變化Fig.7 Changes of nitrite nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

圖8 三級上向垂直流處理桶硝酸鹽氮變化Fig.8 Changes of nitrate nitrogen content in three-stage upward vertical flow processing bucket

圖9 三級上向垂直流處理桶無機磷變化Fig.9 Changes of inorganic phosphorus content in three-stage upward vertical flow processing bucket

2.4 三級上向垂直流處理桶中毛刷細菌多樣性

高通量測序及其數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:三級處理桶B1、B2、B3與曝氣增氧三級處理桶B4、B5、B6中毛刷細菌歸屬于 27 門類、63 綱、167 目、301 科、520 屬、557種。表3是6個樣品生物毛刷細菌門水平細菌組成結(jié)果,按豐度排序前十位分析高通量測序結(jié)果,各個樣品在門水平、屬水平的細菌結(jié)構(gòu)組成基本相似。

表3 三級上向垂直流處理桶毛刷細菌門水平類群組成和比率Tab.3 Composition and proportion of bacterial phylum level of the biological brushin three-stage upward vertical flow processing bucket

一級處理桶B1(厭氧60 d)優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria),經(jīng)過低氧曝氣后,B4(厭氧60 d→低氧30 d)優(yōu)勢菌門為變形菌門、藍藻門(Cyanobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi);二級處理桶B2(厭氧60 d)優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes),二級處理桶B5(厭氧60 d→厭氧30 d后)優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門(Actinobacteria);三級處理桶B3(厭氧60 d)優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門,三級處理桶B6(厭氧60 d→高氧30 d)優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、變形菌門、放線菌門。另外,還有浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)。

三級處理桶硝化細菌類群和比率見表4。除樣品B6外,其余樣品均發(fā)現(xiàn)2個菌屬氨氧化細菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB),主要是亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),均屬于變形菌門。除樣品B4外,檢測到一個亞硝酸鹽氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)主要是硝化螺菌屬(Nitrospira)。B3與B6樣品硝化細菌豐度明顯最高。

表4 三級上向垂直流處理桶中硝化細菌類群組成和比率Tab.4 Composition and proportion of nitrifying bacteria in three-stage upward vertical flow processing bucket

三級處理桶反硝化細菌類群和比率見表5。6個樣品中共發(fā)現(xiàn)放線菌門2個菌屬,厚壁菌門3個菌屬,擬桿菌門1個菌屬,變形菌門7個菌屬的反硝化細菌。B1優(yōu)勢菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、蒼白桿菌(Ochrobactrum)等。B2優(yōu)勢菌為不動桿菌屬(Acinetobacter)。B3優(yōu)勢菌為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)。B4優(yōu)勢菌新出現(xiàn)固氮弧菌屬(Azoarcus)。B5與B6優(yōu)勢菌豐度大幅降低。Anammox厭氧氨氧化菌屬于浮霉菌門(Planctomycetes),與已有文獻報道進行比對,三級處理桶生物毛刷未檢測出。

3 討論

3.1 集污效率

池塘養(yǎng)殖污染問題主要由養(yǎng)殖過程中固形廢棄物沉積、礦化與分解引起的,而養(yǎng)殖固形廢棄物則是高投飼養(yǎng)殖模式的必然產(chǎn)物。目前對蝦池塘養(yǎng)殖的集污裝置與效率的研究幾乎是空白,可參考的文獻資料非常少。本試驗中養(yǎng)殖前期固形廢棄物集污效率與TN集污效率較低(10.6%±1.8%、1.4%±0.2%),隨著對蝦生長與投喂量增加,可以提高到52.2%±5.2%、9.1±0.1%。分析集污效率整體偏低的原因,一是前期投飼量少,集污不及時,長時間的有機質(zhì)礦化分解導(dǎo)致固形廢棄物集污效率與TN集污效率均較低;二是對蝦是底棲動物,在蝦塘底部的活動擾動也會增加殘餌與糞便的分解,減緩沉降[20];三是在開始蝦塘底部改造時,養(yǎng)殖戶只針對池塘中間位置,而不是整個池塘底部,導(dǎo)致集污面小、集污不徹底,這也是集污效率低的重要原因之一。養(yǎng)殖系統(tǒng)的集污效率與池底結(jié)構(gòu)、池型結(jié)構(gòu)直接相關(guān),池底結(jié)構(gòu)設(shè)定以切向射流形成池內(nèi)二次流,且在池底中心設(shè)置排污口,這種結(jié)構(gòu)最有利于固廢排出。池型以圓弧角方形、八角形池最佳,兼具空間利用率高與流場特性優(yōu)勢[7]。趙樂等[21]對循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)集污特性研究表明,射流速度固定時,40°左右射流角度的集污效果最好,采用底部抽污模式。此試驗主要在室內(nèi)開展,且養(yǎng)殖池面積小(長4.4 m、寬3.4 m),很難簡單應(yīng)用到0.33～0.53 hm2蝦塘。因此,在池底結(jié)構(gòu)、池型確定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)上,研究符合對蝦池塘底部具體結(jié)構(gòu)參數(shù)是顯著提高池塘養(yǎng)蝦固形廢棄物集污效率的關(guān)鍵。

3.2 三級上向垂直流處理桶尾水處理效果

3.3 三級上向垂直流處理桶中細菌群落結(jié)構(gòu)

微生物是生物凈化過程中的主要執(zhí)行者,養(yǎng)殖廢水中的有機碳、有機氮和有機磷的分解與轉(zhuǎn)化主要靠微生物完成,因此研究處理桶中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能非常重要[29]。三級上向垂直流處理桶中變形菌門是6個樣品中細菌豐度較高的共有菌門,含有多種代謝種類,大多數(shù)細菌兼性或?qū)Ｐ詤捬跫爱愷B(yǎng)細菌,其主要功能是降解有機物[30-31]。本試驗中,檢測最多的是α-變性菌綱和γ-變性菌綱,亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)屬于β-變性菌綱,可以氧化氨為亞硝酸的無機化能自養(yǎng)細菌,同時又具有反硝化能力。γ-變性菌綱包括一些反硝化菌,如假單胞菌屬(Pseudomonas),在廢水脫氮起重要作用。厚壁菌門在第二大優(yōu)勢菌,由于其細菌可以產(chǎn)生內(nèi)生孢子,在極端環(huán)境中具有較強生存能力,常存在于廢水處理系統(tǒng)[32]。

4 結(jié)論

通過“沉淀塔固廢集污”+“三級上向垂直流處理桶”模式,對蝦池塘養(yǎng)殖固形廢棄物與總氮集污效率可以達到52.2% ±5.2%、9.1%±0.1%,尾水中總氮與氨氮去除率可以達到 45.5%、93.6%,實現(xiàn)對蝦池塘養(yǎng)殖“零排放”。本研究較好地解決了傳統(tǒng)對蝦池塘養(yǎng)殖的污染問題,為對蝦綠色健康養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型升級提供參考。