李波,徐世成,趙安容,李垚,張磊

急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)是一種發(fā)病率較高的腦血管疾病,具有較高的致殘率和病死率,呈現(xiàn)年輕化趨勢[1-2]。顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型是其重要分型,其發(fā)病因素復雜,顱內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊破裂形成的血栓是其病因之一[3]。顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷會影響ACI患者病情嚴重程度,大部分ACI患者伴有顱內(nèi)動脈粥樣硬化,累及多個動脈節(jié)段[4-5]。故研究與ACI顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關的血清標志物,對ACI防治、改善預后有重要臨床價值。膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2)是一種磷脂結(jié)合蛋白,可增強吞噬細胞的吞噬作用,誘導產(chǎn)生炎性細胞因子,促進動脈粥樣硬化斑塊形成,且與頸動脈斑塊穩(wěn)定性有關[6-7]。微小RNA(microRNA,miRNA)參與炎性反應、內(nèi)皮細胞損傷、腫瘤、代謝性疾病、ACI等過程[8-9]。miR-9-5p作為一種miRNA分子能減輕腦缺血再灌注損傷并抑制炎性反應,在腦血管動脈急性梗死的發(fā)生發(fā)展中起保護作用,并且參與血管損傷修復、血管新生等過程[10]。因此,現(xiàn)分析血清Annexin A2、miR-9-5p表達與顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度的關系,旨在為臨床該病診治提供依據(jù),報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2022年10月四川省巴中市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者170例作為研究組,同期選取體檢健康志愿者173例作為健康對照組。研究組男90例,女80例,年齡(60.84±9.68)歲;合并高血壓20例,糖尿病52例;家族遺傳史10例;發(fā)病至入院時間(36.82±9.04)h。健康對照組男97例,女76例,年齡(60.03±8.99)歲。2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、飲酒史、吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);研究組三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高敏C反應蛋白(hs-CRP)水平均明顯高于健康對照組(P<0.05),見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(BYLS2018-11-3),受試者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

表1 健康對照組和研究組臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①患者均符合ACI相關診斷標準,且均屬于顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型[11];②首次發(fā)病;③住院期間未發(fā)生感染者;④臨床檢查證實有梗死病灶;⑤發(fā)病至入院時間小于72 h。(2)排除標準:①出血性腦梗死、小動脈閉塞、心源性栓塞等腦梗死;②合并自身免疫疾病、腫瘤及感染者;③有頸動脈或顱內(nèi)手術(shù)史;④發(fā)病后已進行溶栓治療;⑤顱內(nèi)動脈瘤等其他病變;⑥精神疾病者。

1.3 觀測指標與方法 患者于入院后次日清晨、體檢健康者于體檢時采集空腹肘靜脈血8 ml,離心留取血清,-70℃貯存。

1.3.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達檢測: 取凍存的血清樣本,解凍后,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清Annexin A2水平,試劑盒購自天津康爾克生物科技有限公司(批號SYH-36071)。以RNA提取試劑盒(購自北京擎科生物科技有限公司,批號TOA307)獲取血清中總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測血清miR-9-5p相對表達量(PCR試劑盒購自重慶致宏生物科技有限公司,批號19635M)。qRT-PCR反應條件為95℃,3 min;91℃ 30 s、60℃ 35 s、73℃ 29 s,共37個循環(huán)。miR-9-5p、內(nèi)參U6由廣州盧卡科技有限公司合成,引物序列見表2。采用2-△△CT法檢測血清miR-9-5p水平。

表2 miR-9-5p引物序列

1.3.2 顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷測定:患者入院后24 h內(nèi),采用磁共振掃描儀(荷蘭飛利浦公司,型號Achieva 3.0T)分析ACI患者顱內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊和管壁結(jié)構(gòu)的成分,通過掃描患者大腦動脈3D-TOF序列獲得血管完整的圖像,然后進行高分辨率掃描垂直于血管狹窄的部位,然后將獲得的血管完整影像和狹窄部位影像資料由專業(yè)影像科醫(yī)生進行數(shù)據(jù)分析和定量測量,在高分辨率大腦動脈圖像上測得血管總面積、最狹窄血管的管腔面積。顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷=(血管總面積-最狹窄血管的管腔面積)/血管總面積。

1.3.3 病情嚴重程度評估及分組:顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者入院后24 h內(nèi)采用美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分對患者進行病情嚴重程度評估,總分為42分,分值越大,表示神經(jīng)功能缺損越嚴重(病情越嚴重)。根據(jù)NIHSS評分分值分為輕度ACI亞組39例(NIHSS<5分)、中度ACI亞組56例(5～15分)和重度ACI亞組75例(NIHSS>15分)[12]。

2 結(jié) 果

2.1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達比較 與健康對照組比較,研究組血清Annexin A2水平明顯升高(P<0.01),miR-9-5p表達明顯降低(P<0.01),見表3。

表3 健康對照組和研究組血清Annexin A2、miR-9-5p表達比較

2.2 顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分情況 顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷為(0.71±0.16),NIHSS評分為(16.40±4.81)分。

2.3 不同病情程度患者血清Annexin A2、miR-9-5p、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分比較 輕度ACI亞組、中度ACI亞組、重度ACI亞組血清Annexin A2水平、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分依次升高(P<0.01),miR-9-5p表達依次降低(P<0.01),見表4。

表4 3組ACI亞型患者血清Annexin A2、miR-9-5p、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分比較

2.4 血清Annexin A2、miR-9-5p表達及其與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分的相關性分析 Pearson法相關分析顯示,顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2與miR-9-5p表達呈負相關(P<0.01);血清Annexin A2水平與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈正相關(P<0.01),血清miR-9-5p表達與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈負相關(P<0.01),見表5。

表5 血清Annexin A2、miR-9-5p表達及其與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分的相關性分析

2.5 影響顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的多因素Logistic回歸分析 以發(fā)生顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI為因變量,以TG、TC、hs-CRP、Annexin A2、miR-9-5p、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷為自變量納入Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,血清Annexin A2水平高、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷高是ACI發(fā)生的危險因素(P<0.05),miR-9-5p表達高是其保護因素(P<0.05),見表6。

2.6 血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的預測價值 繪制血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的預測效能ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清Annexin A2、miR-9-5p及二者聯(lián)合預測重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的AUC分別為0.833、0.791、0.925,二者聯(lián)合的AUC優(yōu)于血清Annexin A2、miR-9-5p單獨預測的AUC(Z/P=2.530/0.011、3.364/0.001),見圖1、表7。

圖1 血清Annexin A2、miR-9-5p表達預測重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的ROC曲線

表7 血清Annexin A2、miR-9-5p表達對重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生的預測價值

3 討 論

ACI是由多種因素引發(fā)的腦血管疾病,隨著高血壓、冠心病、高血脂等發(fā)生率增加,ACI的發(fā)病率也呈逐年升高趨勢[13]。顱內(nèi)動脈粥樣硬化是ACI形成的病因之一,顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷對判斷ACI嚴重程度具有較高的價值,并且顱內(nèi)動脈粥樣硬化嚴重程度又與患者神經(jīng)功能恢復有關[14-15]。因此,研究ACI患者顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關的血清標志物對ACI的防治和改善ACI患者的生活質(zhì)量具有非常重要的意義。

Annexin又稱為鈣磷脂結(jié)合蛋白,其可參與細胞信號傳導、形成生物膜、調(diào)控細胞生物學活動等[16]。Annexin A2以四聚體的結(jié)構(gòu)形式存在,分子量約為36 000,是一種新型的炎性標志物,存在于中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等細胞中,其中約有1/3的Annexin A2是由血管內(nèi)皮細胞生成的,具有促進炎性反應的作用[17]。近期有研究顯示,Annexin A2在不穩(wěn)定性斑塊患者中表達水平高于穩(wěn)定性斑塊,是急性缺血性腦卒中患者頸動脈斑塊穩(wěn)定性的影響因素[6]。本研究發(fā)現(xiàn),顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,說明Annexin A2參與ACI病理過程。血清Annexin A2水平隨ACI病情嚴重程度加重而升高,提示血清Annexin A2可能參與ACI的發(fā)生發(fā)展過程。已有研究證實,Annexin A2在冠心病患者血清中呈高表達,Annexin A2可調(diào)控血脂的轉(zhuǎn)運及血管內(nèi)皮生長因子,在粥樣硬化性腦血管損傷中具有重要作用[18]。根據(jù)以往研究推測Annexin A2可能通過促進炎性反應加速內(nèi)皮細胞損傷參與疾病的發(fā)生,加重中性粒細胞及吞噬細胞對腦組織損傷的干預作用。NIHSS評分越高,ACI患者病情越嚴重,顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷越高,說明ACI患者顱內(nèi)供血嚴重不足[19-20]。經(jīng)Pearson法分析顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈正相關,提示Annexin A2與ACI顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷及病情嚴重程度有關,說明Annexin A2可在一定程度上反映ACI病情,從而利于輔助臨床治療。

miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,廣泛存在于真核生物中,已有研究證實miRNA參與ACI發(fā)生發(fā)展[21-22]。miR-9-5p作為一種miRNA分子,廣泛參與多囊卵巢綜合征、大腦中動脈閉塞等多種疾病的發(fā)生[23-24]。Wang等[25]研究表明,miR-9a-5p在大腦中動脈閉塞大鼠模型中表達下調(diào),miR-9a-5p可能會減輕大腦中動脈閉塞誘導的缺血損傷。本研究發(fā)現(xiàn),顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清miR-9-5p表達明顯降低,且miR-9-5p表達隨ACI病情嚴重程度的加重而降低,提示miR-9-5p在ACI發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用,推測miR-9-5p可能通過減少內(nèi)皮細胞損傷,促進血管生成抑制疾病的發(fā)生。過表達miR-9-5p通過靶向ERMP1,介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來提高細胞活力并抑制神經(jīng)元凋亡,減輕缺血性卒中,且大腦中miR-9-5p表達有助于神經(jīng)修復[26]。Pearson相關性分析結(jié)果顯示,顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清miR-9-5p表達與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、NIHSS評分呈負相關,提示miR-9-5p與ACI患者病情嚴重程度及顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷有關,miR-9-5p可調(diào)控血管內(nèi)皮因子,維護血管完整性,促進新生血管形成,在顱內(nèi)動脈粥樣硬化ACI中發(fā)揮積極作用。本研究還發(fā)現(xiàn),顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2與miR-9-5p表達呈負相關,說明Annexin A2與miR-9-5p可能在ACI中存在調(diào)控作用,但具體機制仍需要后續(xù)探究。Logistic回歸分析顯示,血清Annexin A2水平高、miR-9-5p水平低、顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷高是ACI發(fā)生的危險因素,說明Annexin A2水平升高,miR-9-5p表達降低,介導血管平滑肌細胞增殖、遷移,損害內(nèi)皮細胞,造成動脈硬化,促進ACI發(fā)生,及時監(jiān)測血清Annexin A2、miR-9-5p等指標水平變化,對臨床預防ACI發(fā)生甚是有益。同時,顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷較高者臨床應建立高危預警體系,給予重點關注,以降低ACI風險。本研究ROC曲線結(jié)果顯示,血清Annexin A2聯(lián)合miR-9-5p表達預測重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI的AUC為0.925,優(yōu)于單一指標預測效能,說明監(jiān)測血清Annexin A2、miR-9-5p表達變化能夠為重度顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI發(fā)生提供參考。

綜上所述,顱內(nèi)大動脈粥樣硬化型ACI患者血清Annexin A2水平升高,miR-9-5p表達降低,二者呈負相關,且均與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度有關,能夠為臨床病情預測、病理機制解析提供參考。本研究不足之處:引起ACI發(fā)生的可能影響因素納入不足,導致結(jié)果存在偏倚;樣本量小,未探究血清Annexin A2、miR-9-5p表達與ACI患者預后的關系;尚未明確血清Annexin A2、miR-9-5p表達與顱內(nèi)動脈粥樣斑塊負荷、病情嚴重程度的具體調(diào)控機制,仍需要基礎實驗探究血清Annexin A2、miR-9-5p表達異常的機制和作用,隨后擴大樣本,追蹤隨訪,展開深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

李波:設計研究方案,課題設計,實施研究過程,論文撰寫;徐世成:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;趙安容:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;李垚、張磊:進行統(tǒng)計學分析