張?chǎng)?程德均,王科程,杜怡穎,郝晉瑤

慢性肺源性心臟病(chronic pulmonary heart disease,CPHD)是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,由長(zhǎng)期的慢性感染炎性滲出導(dǎo)致小氣道血管重構(gòu),進(jìn)而引起肺動(dòng)脈阻力增加,形成肺心病,在代償能力喪失后緩慢誘導(dǎo)右心室肥厚,最終導(dǎo)致心力衰竭[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),CPHD與10%～30%心力衰竭住院病例有關(guān),80%的慢性阻塞性肺疾病(COPD)會(huì)發(fā)展為CPHD[2-3]。CPHD失代償期會(huì)導(dǎo)致電解質(zhì)紊亂、消化道出血等多種并發(fā)癥,增加死亡率。因此,盡早診斷、及時(shí)干預(yù),有助于改善CPHD患者預(yù)后。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種組成型活性激酶,參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄和翻譯等各種生物學(xué)活動(dòng)[4-5]。GSK-3β異常表達(dá)與炎性疾病、糖尿病、帕金森綜合征、心臟疾病等有關(guān)[6]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)屬于連環(huán)蛋白家族,參與多種細(xì)胞增殖和分化,是經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心組成部分,而GSK-3β催化活性是該信號(hào)通路的關(guān)鍵[7]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路與COPD、肺動(dòng)脈高壓、特發(fā)性肺纖維化等肺部及呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)[8-9]。GSK-3β、β-catenin與CPHD預(yù)后的關(guān)系尚未明確。本研究旨在明確血清GSK-3β、β-catenin信使RNA(mRNA)表達(dá)與CPHD預(yù)后的關(guān)系,為改善預(yù)后提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年10月漢中市三二〇一醫(yī)院收治的CPHD患者108例作為CPHD組,原發(fā)病均為COPD,男63例,女45例,年齡51～72(63.50±7.50)歲;以患者肺心功能變化分為失代償亞組(肺心功能失代償)40例、代償亞組(肺心功能代償)68例。收集同期醫(yī)院體檢健康者108例作為健康對(duì)照組,男60例,女48例,年齡52～74(64.92±7.05)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019LHS-9-2),受試者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合CPHD診斷標(biāo)準(zhǔn)[10];②臨床資料完整;③無家族性遺傳病;④既往無治療史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心肌梗死;②肺間質(zhì)疾病或急性肺栓塞者;③支氣管哮喘;④肝腎功能不全;⑤左心功能不全。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料收集:收集CPHD患者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、病程、吸煙史、糖尿病史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、第1秒用力呼氣量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測(cè)血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平:采集CPHD患者入院后24 h內(nèi)、健康者體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血8 ml,離心留取血清,儲(chǔ)存于-70℃環(huán)境中。取血清樣本,RNA提取試劑盒(南京偉沃生物科技有限公司)從血清中提取總RNA,取RNA 2 μg按照逆轉(zhuǎn)錄試劑(南京偉沃生物科技有限公司)得到cDNA。根據(jù)PCR試劑盒(深圳盎然生物科技有限公司)配制成10 μl反應(yīng)體系,以GAPDH為內(nèi)參,在熒光定量PCR儀(型號(hào)QTOWER3G,無錫賽爾博生物科技有限公司)上進(jìn)行PCR反應(yīng),2-ΔΔCt法用于計(jì)算GSK-3β、β-catenin mRNA水平。引物由廣州源井生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

表1 GSK-3β、β-catenin mRNA引物序列

1.3.3 預(yù)后評(píng)估:CPHD患者入院后均依據(jù)“慢性肺源性心臟病基層診療指南(2018年)”[10]中方案接受相關(guān)治療,統(tǒng)計(jì)CPHD患者1年內(nèi)預(yù)后,隨訪起始日期為收治患者當(dāng)日,隨訪截止日期為收治患者當(dāng)日1年后,統(tǒng)計(jì)生存情況并分為存活亞組85例、死亡亞組23例。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較,CPHD組血清GSK-3β mRNA表達(dá)水平顯著降低,β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),見表2。

表2 健康對(duì)照組和CPHD組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

2.2 代償亞組和失代償亞組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 與代償亞組比較,失代償亞組血清GSK-3β mRNA表達(dá)水平顯著降低,β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),見表3。

表3 代償亞組和失代償亞組CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

2.3 存活亞組和死亡亞組臨床資料比較 2亞組性別、年齡、BMI、病程、糖尿病史、飲酒史、高血壓史、冠心病史、FEV1%比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與存活亞組比較,死亡亞組吸煙史比例、PaCO2顯著升高,PaO2顯著降低(P<0.05),見表4。

表4 存活亞組和死亡亞組CPHD患者臨床資料比較

2.4 存活亞組與死亡亞組血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 與存活亞組比較,死亡亞組血清GSK-3β mRNA表達(dá)水平顯著降低,β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),見表5。

表5 存活亞組與死亡亞組CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

2.5 CPHD患者血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson法分析,CPHD患者血清GSK-3β mRNA與β-catenin mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.502,P<0.001)。

2.6 影響CPHD患者死亡的多因素分析 以CPHD患者是否死亡為因變量(死亡=1,生存=0),將吸煙史(是=1,否=0)、PaCO2(連續(xù)變量)、PaO2(連續(xù)變量)、GSK-3β mRNA(連續(xù)變量)、β-catenin mRNA(連續(xù)變量)作為自變量納入多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示,GSK-3β mRNA高表達(dá)是CPHD患者死亡的保護(hù)因素,β-catenin mRNA高表達(dá)是CPHD患者死亡的危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表6。

表6 Cox回歸分析CPHD患者死亡的影響因素

2.7 血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平對(duì)CPHD患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平對(duì)CPHD患者死亡預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線,并計(jì)算AUC,結(jié)果顯示,血清GSK-3β、β-catenin mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)CPHD患者死亡的AUC分別為0.838、0.884、0.913,三者預(yù)測(cè)CPHD患者死亡的效能均較好(Z/P=0.857/0.391、1.660/0.096),見表7、圖1。

圖1 血清GSK-3β、β-catenin mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)CPHD患者死亡的ROC曲線

表7 血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)水平對(duì)CPHD患者死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

CPHD是一種由肺功能下降或肺衰竭引起的心臟病,研究顯示其病理機(jī)制主要涉及慢性缺氧狀態(tài)、血管介質(zhì)如一氧化氮和內(nèi)皮抑素-1的分泌以及血小板衍生生長(zhǎng)因子A和B的減少,引起血管平滑肌細(xì)胞松弛和損傷,最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高[11]。常規(guī)治療雖可有效改善臨床癥狀,但病程沒有明顯縮短,復(fù)發(fā)率、病死率仍較高[12]。因而探究影響CPHD預(yù)后的分子標(biāo)志物,對(duì)于預(yù)后預(yù)測(cè)、臨床治療有重要意義。

Wnt/β-catenin是一種涉及穩(wěn)態(tài)自我更新、胚胎發(fā)育和多種疾病的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng),GSK-3β是負(fù)調(diào)控因子,β-catenin是其正調(diào)控因子。當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路未被激活時(shí),激活的GSK-3β能夠磷酸化β-catenin,導(dǎo)致β-catenin水平減少[13-15]。相反,當(dāng)Wnt/β-catenin途徑被激活時(shí),β-catenin從復(fù)合物中釋放,并在細(xì)胞質(zhì)中積累,并最終轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,促進(jìn)下游靶基因表達(dá)[16-17]。氣道壁內(nèi)的機(jī)械力(拉伸和壓縮)可以激活細(xì)胞中的β-catenin信號(hào),β-catenin的激活在涉及氣道平滑肌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的氣道重構(gòu)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[18]。然而,還未有關(guān)GSK-3β、β-catenin與CPHD的相關(guān)研究。本研究觀察到CPHD患者血清GSK-3β mRNA表達(dá)水平較健康人降低,β-catenin mRNA表達(dá)水平較健康人升高,提示GSK-3β、β-catenin mRNA可能參與CPHD發(fā)生。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),CPHD患者血清GSK-3β mRNA與β-catenin mRNA呈負(fù)相關(guān),提示GSK-3β mRNA和β-catenin mRNA可能存在相互作用,共同影響CPHD的發(fā)生。有研究表明,高氧誘導(dǎo)的新生兒肺損傷與Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活有關(guān),Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制可以減輕高氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓[19]。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示,與健康幼鼠比較,高氧致急性肺損傷幼鼠的肺組織GSK-3β表達(dá)減少[20]。結(jié)合文獻(xiàn)及本研究結(jié)果推測(cè)GSK-3β、β-catenin mRNA可能通過影響氣道重構(gòu),進(jìn)而影響肺動(dòng)脈壓,導(dǎo)致CPHD的發(fā)生。Carlier等[21]證明了Wnt/β-catenin通路在COPD患者中被激活,β-catenin蛋白水平上調(diào),并且與COPD嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),CPHD患者的失代償亞組血清GSK-3β mRNA表達(dá)水平顯著低于代償亞組,β-catenin mRNA表達(dá)水平顯著高于代償亞組,提示血清GSK-3β、β-catenin mRNA異常表達(dá)與CPHD的病情嚴(yán)重程度相關(guān),猜測(cè)低水平GSK-3β mRNA、高水平β-catenin mRNA可能通過調(diào)控下游靶基因表達(dá),導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞松弛和損傷,引起氣道重塑,肺動(dòng)脈壓升高,從而加重CPHD患者病情。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),與存活亞組比較,死亡亞組血清GSK-3β mRNA表達(dá)下調(diào),β-catenin mRNA表達(dá)上調(diào),說明血清GSK-3β、β-catenin mRNA表達(dá)異常可能參與了CPHD患者預(yù)后不良發(fā)生過程,二者可能通過增加肺動(dòng)脈壓,導(dǎo)致肺功能損害,從而加重病情,導(dǎo)致預(yù)后更差。Cox回歸分析顯示,GSK-3β mRNA低表達(dá)、β-catenin mRNA高表達(dá)是CPHD患者死亡的危險(xiǎn)因素,表明GSK-3β mRNA水平越低、β-catenin mRNA水平越高,CPHD患者預(yù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)越高。ROC曲線發(fā)現(xiàn)血清GSK-3β、β-catenin mRNA各自單獨(dú)及二者聯(lián)合均對(duì)CPHD患者預(yù)后有較好預(yù)測(cè)價(jià)值,提示檢測(cè)血清GSK-3β、β-catenin mRNA水平變化可作為CPHD患者預(yù)后死亡的預(yù)測(cè)指標(biāo),有助于指導(dǎo)臨床制定個(gè)體化方案,改善CPHD患者預(yù)后。

綜上所述,CPHD患者血清GSK-3β mRNA呈異常低表達(dá),β-catenin mRNA呈異常高表達(dá),二者均與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān),GSK-3β mRNA聯(lián)合β-catenin mRNA預(yù)測(cè)CPHD患者預(yù)后的效能較佳,對(duì)患者預(yù)后的干預(yù)具有重要意義。然而,本研究中樣本量有限,評(píng)估患者死亡的危險(xiǎn)因素可能存在偏倚,GSK-3β、β-catenin mRNA調(diào)控CPHD的病理機(jī)制有待深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張?chǎng)?設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;程德均:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;王科程、杜怡穎:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;郝晉瑤:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析