王夢(mèng)凡，黃嘉維，劉春龍, 3，洪 杰，齊 崴, 4

表面增強(qiáng)拉曼光譜法對(duì)侵襲性真菌病相關(guān)病原體的鑒別

王夢(mèng)凡1, 2，黃嘉維1，劉春龍1, 3，洪 杰1，齊 崴1, 4

(1. 天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350；2. 天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072；3. 丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300457；4. 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

表面增強(qiáng)拉曼光譜；侵襲性真菌?。恢鞒煞址治?；正交偏最小二乘判別分析

侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)是危害人類生命安全的一類重要疾病，在過(guò)去的幾十年中，由于放射治療和移植病例的增加以及抗生素和抗腫瘤藥物的濫用，導(dǎo)致免疫缺陷病例的數(shù)量急劇增加，這些病例更容易受到真菌的感染并轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性真菌疾病(IFD)[1-2]．有研究估計(jì)，侵襲性真菌病每年在全球造成150多萬(wàn)人死亡，這與結(jié)核病造成的死亡數(shù)相近，比瘧疾高3倍[3-4]．

在臨床上，引起侵襲性真菌病最主要的病原體是白假絲酵母菌()、新生隱球菌()和煙曲霉菌()[5]．白假絲酵母菌是一種能夠在健康人體的黏膜表面和皮膚感染的病原體，當(dāng)人體免疫系統(tǒng)缺乏相應(yīng)的識(shí)別時(shí)，它會(huì)進(jìn)一步侵染人體并導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病．據(jù)調(diào)查，有40%的侵襲性真菌病死亡病例是由白假絲酵母菌造成的[2]．新生隱球菌是一種機(jī)會(huì)致病菌，最初引起肺部感染之后可傳播到其他器官，最為嚴(yán)重時(shí)會(huì)侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)而導(dǎo)致腦膜炎．每年隱球菌影響超百萬(wàn)人，在拉丁美洲和撒哈拉以南的非洲有著高達(dá)70%的死亡率[6]．煙曲霉菌是人曲霉菌病的主要致病種類，多年來(lái)，煙曲霉菌一般被認(rèn)為是一種較弱的病原體，主要引起過(guò)敏形式的疾病．然而，近年來(lái)煙曲霉菌感染的流行率和疾病的嚴(yán)重程度急劇上升，這與免疫抑制患者數(shù)量的增加直接相關(guān)[7]．

由于治療方案因病原體種類而異，快速準(zhǔn)確地識(shí)別這些IFD相關(guān)病原體對(duì)患者的診斷和后續(xù)治療至關(guān)重要[8]．目前，基于病原體培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)的檢測(cè)仍然是真菌病原鑒定的主要方法．非培養(yǎng)的方法，如G試驗(yàn)(檢測(cè)(1-3)-β-D-葡聚糖)、GM試驗(yàn)(檢測(cè)半乳甘露聚糖)結(jié)合酶聯(lián)免疫法(ELISA)或化學(xué)發(fā)光法(CLIA)的方法越來(lái)越受到人們的關(guān)注[9]．但這些方法都存在特異性低、靈敏度差以及交叉反應(yīng)等問題．近年來(lái)被廣泛關(guān)注的PCR技術(shù)[10]也有對(duì)引物的準(zhǔn)確性以及嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)環(huán)境的要求．

表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是基于金屬納米結(jié)構(gòu)與入射/散射輻射場(chǎng)之間的共振效應(yīng)，由于其有著高靈敏度、快速響應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，在食品控制[11-13]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[14]和化學(xué)物檢測(cè)[15]等領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注．對(duì)于一種待測(cè)分子所產(chǎn)生的拉曼位移信號(hào)是唯一的，所以SERS技術(shù)在檢測(cè)微生物表面化學(xué)指紋特征上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)．通過(guò)結(jié)合數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法，SERS技術(shù)已成為多種微生物物種鑒定和表型分析的有力工具[16-20]．例如Dina等[16]利用無(wú)標(biāo)簽SERS方法，結(jié)合模糊主成分分析、線性判別分析實(shí)現(xiàn)了包括煙曲霉菌、煙曲霉菌復(fù)合體和微小根毛霉3種真菌．Mabbott等[21]利用DNA功能化的銀納米粒子作為探針來(lái)檢測(cè)4種真菌的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，并將得到的光譜進(jìn)行主成分分析，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)真菌的區(qū)分．

在本研究中，SERS技術(shù)被用于檢測(cè)和鑒別白假絲酵母菌、新生隱球菌以及煙曲霉菌這3種IFD的主要病原體．筆者在真菌表面原位生長(zhǎng)了銀納米粒子并收集其拉曼信號(hào)，從而獲得了3種真菌在633nm激發(fā)波長(zhǎng)下的拉曼光譜．隨后利用主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)兩種數(shù)學(xué)分析方法對(duì)3種真菌的拉曼指紋譜進(jìn)行分析，從而完成了對(duì)3種真菌的鑒別和區(qū)分．本研究有望為侵襲性真菌病相關(guān)病原體的檢測(cè)及臨床疾病診斷提供一種新思路．

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

硝酸銀(AgNO3，99%)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；鹽酸羥胺(H2NOH·HCl，99%)，購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；白假絲酵母菌、新生隱球菌和煙曲霉菌，由丹娜(天津)生物技術(shù)有限公司提供．其他化學(xué)試劑均從商業(yè)渠道購(gòu)買．

紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1900)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；納米粒度及ZETA電位儀(Nano ZS)，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；多功能掃描探針顯微鏡(NTEGRA Spectra)，俄羅斯NT-MDT公司；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(JEM-2100F)，日本電子公司．

1.2 真菌培養(yǎng)

白假絲酵母菌和新生隱球菌的復(fù)蘇是先將其從保存的斜面上劃線接種至沙氏葡萄糖瓊脂平板上，于30℃下生長(zhǎng)3d．之后用無(wú)菌接種環(huán)取平板上的單菌落接種至500mL的YM肉湯培養(yǎng)基中，在30℃下以200r/min轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，直至OD600值達(dá)到0.5～0.6．煙曲霉菌的復(fù)蘇是將煙曲霉凍存菌株取20μL加至沙氏葡萄糖瓊脂平板上，用無(wú)菌涂布器涂抹均勻后在30℃下培養(yǎng)66h．之后將單個(gè)菌落接種于1000mL無(wú)菌高壓滅菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)液中，在37℃下以200r/min轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48h．此時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)有大量微小菌體產(chǎn)生，取100mL菌液加入1000mL滅菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基液中，在37℃下200r/min培養(yǎng)72h，直至產(chǎn)生真菌球．

1.3 真菌檢測(cè)樣品的制備

為去除菌液中培養(yǎng)基對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，先對(duì)菌液進(jìn)行清洗．分別取200μL隱球菌、念珠菌的菌液和一個(gè)曲霉菌球加生理鹽水至總體積為500μL，5000離心去除上清后再分別加入500μL生理鹽水，5000離心去除上清，重復(fù)2次．之后分別加入200μL生理鹽水重懸，振蕩1min，完成對(duì)菌體的 清洗．

本研究采用原位生長(zhǎng)的方式在菌體表面直接合成銀納米粒子．實(shí)驗(yàn)前預(yù)先配制所需的還原劑，還原劑由0.1mol/L的鹽酸羥胺和氫氧化鈉溶液按17∶33的體積比配制[22]．在清洗過(guò)的菌液中加入200μL 0.01mol/L硝酸銀溶液并靜置1min，使銀離子緊密地吸附在菌體表面．待溶液顏色變白后，各加入1.8mL還原劑并靜置3min，使吸附在菌體表面的銀離子充分被還原而形成銀納米粒子．

1.4 拉曼光譜檢測(cè)

分別取5μL制備好的新生隱球菌和白假絲酵母菌檢測(cè)樣品以及一個(gè)包覆了銀粒子的煙曲霉真菌球于載玻片上，干燥后對(duì)其收集拉曼光譜．拉曼光譜儀選擇633nm激發(fā)波長(zhǎng)，光譜掃描范圍400～1800cm-1，積分時(shí)間為10s，積分次數(shù)為5，顯微系統(tǒng)放大倍數(shù)為50．

1.5 數(shù)據(jù)處理

拉曼光譜數(shù)據(jù)使用OriginPro 2016軟件(版本為b9.3.226)進(jìn)行歸一化處理．使用R(版本4.0.2)和R studio(版本1.3.1056.0)對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析．使用SIMCA軟件(版本13.0.0.0)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析．

2 結(jié)果討論

2.1 檢測(cè)樣品的表征

拉曼光譜雖然可以通過(guò)將微生物置于在激光下，收集豐富的微生物成分化學(xué)信息，但較差的信噪比仍然是統(tǒng)計(jì)分析的主要挑戰(zhàn)．而SERS技術(shù)由于納米金屬的局域表面等離子體共振(local surface plasmon resonance，LSPR)效應(yīng)可以產(chǎn)生很強(qiáng)的拉曼信號(hào)，因此將納米金屬附著在微生物表面，可以產(chǎn)生微生物表面成分的強(qiáng)烈信號(hào)．在此，通過(guò)原位生長(zhǎng)將銀納米粒子包覆在真菌表面，采用透射電鏡(TEM)對(duì)銀納米粒子包覆后真菌的形態(tài)進(jìn)行了表征．酵母菌(白假絲酵母菌和新生隱球菌)的生物學(xué)顯著特征是它能夠以多種形態(tài)生長(zhǎng)，從單細(xì)胞芽殖酵母到具有平行側(cè)壁的假菌絲[23-24]．如圖1(a)和(b)所示，由于白假絲酵母菌和新生隱球菌的培養(yǎng)溫度較低(30℃)，因此呈現(xiàn)出出芽的形態(tài)．圖中也可以看出銀納米粒子更容易在真菌的交界處形成，而銀納米粒子在白假絲酵母菌(圖1(a))上的分布比在新生隱球菌(圖1(b))上的更均勻，粒徑更小．圖1(c)為煙曲霉菌絲頂端被銀納米粒子覆蓋的放大圖像．此外，還發(fā)現(xiàn)銀納米粒子更容易集中在分生組織中，如芽胞壁或菌絲頂端，推測(cè)這可能與出芽過(guò)程中細(xì)胞壁多糖的變化有關(guān)[25]．雖然銀納米粒子在單個(gè)真菌表面的分布不是很均勻，但由于真菌的大小與激光光斑的直徑相差不多(約1μm)，因此吸附的銀納米粒子仍然可以為SERS檢測(cè)提供增強(qiáng)的電磁場(chǎng)．

圖1 銀納米粒子包覆下3種真菌的TEM圖

Zeta電位分析也證明了銀納米粒子附著在了真菌表面．由于真菌細(xì)胞壁上甘露糖側(cè)鏈的磷酸基團(tuán)以及其他脂多糖[26]，真菌通常帶負(fù)電荷．因此在原位生長(zhǎng)了銀納米粒子后，這些真菌的表面電位都一定程度上被中和(圖2)．這也證明了銀粒子成功附著在真菌表面，可以達(dá)到增強(qiáng)拉曼信號(hào)的效果．

圖2 銀納米粒子包覆3種真菌前后的Zeta電位圖

2.2 拉曼光譜分析

通過(guò)對(duì)銀納米粒子包覆的真菌進(jìn)行拉曼檢測(cè)，收集樣品在633nm激發(fā)波長(zhǎng)下的SERS光譜．對(duì)于每一種真菌，均制備了多組樣品，共收集到20組SERS光譜數(shù)據(jù)(圖3)，得到的光譜數(shù)據(jù)反映了真菌細(xì)胞壁和代謝產(chǎn)物的組成，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析區(qū)分不同真菌種類的潛力．之后，20組光譜經(jīng)過(guò)平滑處理、基線校正和歸一化，最后取平均得到該真菌的平均拉曼指紋光譜圖(圖4)．對(duì)光譜中的一些主要特征峰進(jìn)行了峰位歸屬(表1)，從表中可以看出由于不同種類真菌的細(xì)胞壁主要組成相同，白假絲酵母菌、新生隱球菌和煙曲霉菌有一些相似的特征峰，這些特征峰分別代表著鳥嘌呤和酪氨酸(640～682cm-1)、碳水化合物中的C—C拉伸和C—N拉伸(1022～1060cm-1)、苯丙氨酸、半乳甘露聚糖和C—C鍵(1116～1126cm-1)、鳥嘌呤、腺嘌呤、蛋白質(zhì)的酰胺Ⅲ和蛋白質(zhì)中的C—H彎曲鍵(1315～1345cm-1)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的CH2彎曲鍵(1440～1475cm-1)、腺嘌呤、鳥嘌呤和苯丙氨酸的C＝C彎曲鍵(1570～1595cm-1)、酰胺Ⅰ和C＝C鍵(1612～1680cm-1)．

圖3 3種真菌的拉曼光譜圖

圖4 3種真菌的平均拉曼指紋光譜圖

Fig.4 Averaged SERS fingerprint spectra of three fungi

表1 真菌拉曼光譜峰位歸屬

Tab.1 Tentative band assignments of the Raman spectra of fungi

注：＋＋表示特征峰信號(hào)強(qiáng)度大；＋表示出現(xiàn)特征峰；－表示無(wú)特征峰；所有峰位歸屬信息均來(lái)自文獻(xiàn)[11, 16-17, 27-38].

此外，每種真菌也有其獨(dú)特的拉曼峰，說(shuō)明這些真菌之間存在差異．白假絲酵母菌特有的拉曼特征峰分別代表了碳水化合物的C—O—C糖苷環(huán)變形(536cm-1)、幾丁質(zhì)(1194cm-1)、鳥嘌呤、腺嘌呤、半乳甘露聚糖和脂質(zhì)的CH2剪式振動(dòng)(1413cm-1)、蛋白質(zhì)的酰胺Ⅱ(1539cm-1)和酰胺Ⅰ(1699cm-1)．新生隱球菌在1002cm-1處有著其特有的拉曼特征峰，歸屬于半乳甘露聚糖、苯丙氨酸和C—C芳香環(huán)拉伸.煙曲霉菌特有的特征峰分別歸屬于幾丁質(zhì)和半乳甘露聚糖(492cm-1)、COO—對(duì)稱拉伸(1408cm-1)、腺嘌呤、鳥嘌呤(環(huán)拉伸)和C＝C彎曲模式(1590cm-1).每種真菌病原體都有其特定的指紋圖譜，收集的光譜中所有的特征峰及其分配列于表1中．

2.3 光譜數(shù)據(jù)的主成分分析

主成分分析是一種主要用于描述不同數(shù)據(jù)之間的微小差異的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法．主成分分析可以降低多變量數(shù)據(jù)的維數(shù)，使大量的變量可以轉(zhuǎn)換成少量的新變量，而這些新變量就被稱為主成分．各主成分用方差來(lái)表示包含的原始數(shù)據(jù)的信息，方差數(shù)值越大表示主成分包含的原始數(shù)據(jù)的信息越多，一般來(lái)說(shuō)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于80%時(shí)可以認(rèn)為包含了原始數(shù)據(jù)的大部分信息．為了避免光譜采集時(shí)強(qiáng)度差異引起的干擾，這里對(duì)采集的原始光譜進(jìn)行了歸一化處理，之后將3種真菌的60組SERS光譜進(jìn)行主成分分析．圖5(a)為分析后的主成分得分圖，圖中可以看出主成分分析的前2個(gè)主成分(PC1和PC2)的方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了91.7%，不同種的真菌被區(qū)分在了3個(gè)不同的區(qū)域，不同種真菌的分值點(diǎn)周圍有一個(gè)95%置信橢圓，大部分的數(shù)據(jù)點(diǎn)都落在了置信橢圓中．由此可以表明第一、第二主成分包含了原始光譜數(shù)據(jù)的大部分信息，并且利用主成分分析對(duì)3種隱球菌的區(qū)分效果較好且可信度高．

圖5(b)為第一主成分的載荷圖，載荷圖顯示了影響第一主成分的最重要的變量．如圖所示，拉曼位移處于667cm-1、731cm-1、792cm-1、853cm-1、1328cm-1、1538cm-1和1584cm-1的光譜信息對(duì)第一主成分在負(fù)方向有著重要的貢獻(xiàn)，而拉曼位移處于581cm-1、675cm-1、780cm-1、1326cm-1、1457cm-1和1547cm-1的光譜信息對(duì)第二主成分有著重要的貢獻(xiàn)(圖5(c))．處于這些拉曼位移處的特征峰正是圖4中顯示的3種真菌最有差異的特征峰，這也表明主成分分析可以通過(guò)降維的方法排除光譜中大量信息的干擾，準(zhǔn)確識(shí)別出3種真菌指紋光譜的細(xì)微差別并完成區(qū)分．

圖5 主成分分析結(jié)果得分圖與第一主成分、第二主成分的載荷圖

2.4 正交偏最小二乘法處理光譜數(shù)據(jù)

圖6 3種真菌SERS光譜的OPLS-DA得分圖

表2 OPLS-DA法的模型參數(shù)

Tab.2 Parameters of OPLS-DA

注：模型1用于鑒別白假絲酵母菌和煙曲霉菌；模型2用于鑒別白假絲酵母菌和新生隱球菌；模型3用于鑒別新生隱球菌和煙曲霉菌.

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，侵襲性真菌感染對(duì)人類健康造成的危害越來(lái)越受到重視，因此對(duì)相關(guān)病原體的檢測(cè)和鑒別提出了更高的需求，SERS光譜分析具有非標(biāo)記的指紋特征優(yōu)勢(shì)，在微生物的高效檢測(cè)與鑒別方面展示出良好的應(yīng)用潛力．真菌作為一種復(fù)雜的微生物，其拉曼光譜提供的信息量大且復(fù)雜，本研究通過(guò)在白假絲酵母菌、新生隱球菌和煙曲霉菌表面原位生長(zhǎng)銀納米粒子，獲得了這3種侵襲性真菌的拉曼指紋光譜．根據(jù)指紋譜中特征峰的峰位歸屬分析了3種真菌表面的主要化學(xué)成分及其異同；隨后分別利用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析對(duì)3種真菌的SERS光譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)3種真菌的區(qū)分．該工作不僅為侵襲性真菌病相關(guān)病原體的鑒別、鑒定、耐藥性研究以及疾病的臨床診斷提供了新方法，同時(shí)也為真菌“拉曼組學(xué)”的研究提供了原始數(shù)據(jù)．

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Identification of Invasive Fungal DiseaseRelated Pathogens Using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy

Wang Mengfan1, 2，Huang Jiawei1，Liu Chunlong1, 3，Hong Jie1，Qi Wei1, 4

(1. School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China；2. School of Life Sciences，Tianjin University，Tianjin 300072，China；3. Dynamiker Biotechnology(Tianjin)Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；4. Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering(Tianjin)，Tianjin 300072，China)

surface-enhanced Raman spectroscopy；invasive fungal disease；principal components analysis (PCA)；orthogonal partial least-squares discriminant analysis(OPLS-DA)

10.11784/tdxbz202205011

Q5-33

A

0493-2137(2023)09-0927-08

2022-05-08；

2022-06-24.

王夢(mèng)凡（1983— ），女，博士，教授.Email：m_bigm@tju.edu.cn

王夢(mèng)凡，mwang@tju.edu.cn.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21621004，22178260)；天津市科學(xué)技術(shù)局重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(20ZXGBSY00040).

the National Natural Science Foundation of China(No. 21621004，No. 22178260)，the Major Project of Tianjin Science and Technology Bureau(No. 20ZXGBSY00040).

(責(zé)任編輯：田 軍)