謝博歡,李雁,常艷賓,林騰龍,李琳琳
黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150036
穩(wěn)定型心絞痛(stable angina pectoris,SAP)又可稱(chēng)勞力性心絞痛,是慢性冠狀動(dòng)脈綜合征 (chronic coronary syndrome,CCS)中的較為常見(jiàn)的疾病。隨著SAP 患病率以及病死率的逐年升高,近年來(lái)SAP被WTO 認(rèn)為是心血管疾病中最常見(jiàn)的威脅人類(lèi)健康的主要死因[1]。臨床常用藥為:β 受體拮抗劑、ACEI/ARB 類(lèi)、硝酸酯制劑、抗血小板藥、鈣通道阻滯劑、降脂藥等藥物,雖然治療效果不錯(cuò),但是服用這些藥物有可能會(huì)出現(xiàn)某些不良反應(yīng)導(dǎo)致患者停藥,又或長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生耐藥性,此外還有患者依從性差等其他原因,進(jìn)而會(huì)影響整體的治療效果。而在祖國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,隨著對(duì)SAP 認(rèn)識(shí)的逐漸加深,中醫(yī)藥不僅具備療效好、安全性高、不良反應(yīng)發(fā)生率低這些優(yōu)點(diǎn),而且還同時(shí)具有延緩病情發(fā)展、降低疾病復(fù)發(fā)率、改善預(yù)后等其他方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),擁有非常廣闊的研究前景。
陳皮、半夏作為臨床常用藥,兩者常相須為用,而且通常作為治療心血管疾病的核心藥對(duì)被廣泛使用,用來(lái)治療較為常見(jiàn)的痰濁阻滯型SAP[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建藥物的“活性成分-靶標(biāo)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò),是建立在生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)等多個(gè)學(xué)科的技術(shù)和知識(shí)的基礎(chǔ)之上,可以幫助我們更加得清楚藥認(rèn)識(shí)藥物疾病之間的關(guān)系,了解藥物作用于疾病的機(jī)制,是一種可以全面、系統(tǒng)得進(jìn)行科學(xué)研究的方法,為中醫(yī)藥的進(jìn)一步研究提供了新方法、新角度,為廣大學(xué)者所喜愛(ài)。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),研究藥對(duì)“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機(jī)制,從而為其治療SAP 的藥理學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步參考。
在TCMSP(https://tcmsp-e.com/)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)分別以陳皮、半夏作為關(guān)鍵詞檢索、獲取其活性成分,并篩選活性成分,篩選的條件設(shè)置為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類(lèi)藥性(drug-likeness,DL)≥ 0.18,篩選得到活性成分后選擇“R elated Targeted”,進(jìn)一步檢索篩選出來(lái)的活性成分,得到藥物活性成分的相關(guān)靶點(diǎn),再利用Uniport(https://www.uniprot.org/)統(tǒng)一整合成Gene ID。
將陳皮、半夏得活性成分以及靶點(diǎn)導(dǎo)入CytoScape 3.8.0 構(gòu)建出網(wǎng)絡(luò)圖,在構(gòu)建出的網(wǎng)絡(luò)中藥物活性成分、活性成分的靶點(diǎn)基因用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示,二者之間的關(guān)系用“邊”(edge)表示;使用CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 工具分析這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖特征,包括網(wǎng)絡(luò)連接度(degree)、介度(betweenness)和緊密度(closeness)等數(shù)據(jù),以此研究藥物的活性成分與靶點(diǎn)基因及兩者之間的關(guān)系。
將“stable angina pectoris”作為關(guān)鍵詞,在Gene cards(https://www.genecards.org)、Drug bank(https://go.drugbank.com/)、OMIM(http://www.omim.org)、OMIM-Gene Map(http://wwwomim.org/search/advanced/geneMap)等疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、篩選,整理得出的結(jié)果,之后在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一規(guī)范,并借助VENNY2.1 獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)基因(靶點(diǎn)蛋白)。
使用String(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)。將“陳皮-半夏”與SAP 的交集靶點(diǎn)分別導(dǎo)入String 內(nèi),生成PPI 網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)出結(jié)果,利用CytoScape3.8.0,繪制高級(jí)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用CytoScape 中的MCODE 插件,通過(guò)分子復(fù)合物檢測(cè)算法對(duì)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析,構(gòu)建不同功能模塊。
將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://metascape.org) 進(jìn) 行GO-BP(biological process)、GO-CC(cellular component)、GO-MF(molecular function)KEGG 分析,保存分析結(jié)果并通過(guò)微生信網(wǎng)站進(jìn)行可視化。
借助CytoScape3.8.0 來(lái)構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,圖中“節(jié)點(diǎn)”代表活性成分、通路,“邊”代表二者之間的作用關(guān)系;使用CytoScape 中的Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)特征,包括連接度(degree)、介度(betweenness)及緊密度(closeness)等,以研究活性成分、通路及靶點(diǎn)基因及其相互之間的關(guān)系。
在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)初步獲取成分陳皮63 個(gè),半夏116 個(gè),通過(guò)OB 和DL 參數(shù)篩選后,獲得活性成分陳皮5 個(gè),半夏13 個(gè),共18 個(gè)見(jiàn)表1。選擇Related Targets 預(yù)測(cè)陳皮、半夏篩選出的活性成分的靶點(diǎn),并利用Uniport 轉(zhuǎn)換成gene ID,獲得陳皮活性成分靶點(diǎn)基因66 個(gè),半夏活性成分的靶點(diǎn)基因136,共獲得202 個(gè)靶點(diǎn)基因。
表1 “陳皮-半夏”活性成分
將陳皮、半夏的活性成分以及其相應(yīng)的靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoScape3.8.0 繪制其關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖并分析,共獲得106 個(gè)節(jié)點(diǎn)與219 條關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)圖1(節(jié)點(diǎn)表示活性成分、靶點(diǎn)基因,連線(xiàn)表示作用關(guān)系,節(jié)點(diǎn)大小、節(jié)點(diǎn)顏色深淺和節(jié)點(diǎn)透明度均按degree 值從大到小依次排列,即degree 值越大,節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深,透明度越高)。
圖1 “陳皮-半夏”活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)
利用Gene cards、Drug bank 、OMIM、OMIM-Gene Map 等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)搜索“stable angina pectoris”,得到的靶點(diǎn)個(gè)數(shù)分別為854、119、101、8,篩選并去除重復(fù)值后得到靶點(diǎn)1016 個(gè)。利用VENNY2.1 繪制韋恩圖可得出藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集為48 個(gè),見(jiàn)圖2(list1為疾病靶點(diǎn)基因,list2 為藥物靶點(diǎn)基因)。
圖2 韋恩圖
4.1 “陳皮-半夏”治療SAP 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖繪制 運(yùn)用String 構(gòu)建“陳皮-半夏”與SAP 共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò),將交集靶點(diǎn)基因提交至String 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái),得到PPI 網(wǎng)絡(luò),剔除掉游離基因后如圖3A,保存結(jié)果將其導(dǎo)入CytoScape3.8.0,繪制高級(jí)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖3B。
圖3 A PPI 網(wǎng)絡(luò)
圖3 B CytoScape 美化后的PPI
PPI 網(wǎng)絡(luò)圖之所以是無(wú)向圖,是因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)中的蛋白質(zhì)是相互作用的。community 或module 是PPI 中隱藏的子網(wǎng),是網(wǎng)絡(luò)中密度較高的區(qū)域,是具有生物學(xué)意義的合集,可表示蛋白質(zhì)復(fù)合體(protein complex)或者功能模塊(functional module)[3]。故為更精確地分析“陳皮-半夏”治療SAP 的作用機(jī)制,在構(gòu)建出PPI 網(wǎng)絡(luò)后運(yùn)用CytoScape3.8.0 中的MCODE 工具,通過(guò)其特有算法對(duì)活性成分與靶點(diǎn)得相互作用關(guān)系進(jìn)行分析,構(gòu)建出module1、module2、module3 三個(gè)功能模塊,見(jiàn)圖4A、4B、4C。根據(jù)P 值,分別保留Module中3 個(gè)最佳評(píng)分的生物學(xué)進(jìn)程對(duì)其進(jìn)行功能描述,見(jiàn)表2。
圖4 A Module1
圖4 B Module2
圖4 C Module3
表2 Module1、2、3 最佳生物進(jìn)程
將48 個(gè)交集基因?qū)隡etascape 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行富集分析,分別進(jìn)行KEGG 以及GO 的BP、CC、MF 富集分析,保存結(jié)果,并運(yùn)用微生信網(wǎng)站將結(jié)果中Log10(P)值排名為前20 的繪制氣泡圖進(jìn)行可視化,KEGG的可視化結(jié)果見(jiàn)圖5,GO-BP、CC、MF 的可視化結(jié)果見(jiàn)圖6(氣泡面積大小代表通路中的基因數(shù)多少,氣泡的顏色由綠到紅代表-Log10(P)值從小到大,橫軸代表P 值,豎軸代表通路名稱(chēng))
圖5 KEGG 富集分析
圖6 GO 富集分析-BC、CC、MF
排除與本病無(wú)關(guān)的通路后,使用CytoScape 軟件制作“藥物成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖,見(jiàn)圖7(藥物成分用菱形表示,通路用倒三角表示,疾病靶點(diǎn)用圓形表示,作用關(guān)系用連線(xiàn)表示,degree 值大小用節(jié)點(diǎn)面積大小代表)。并通過(guò)CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù),分析表明,β-谷甾 醇(Degree)為32,介 度(Betweenness Centrality)為0.2557,緊密度(Closeness Centrality)為0.4474,預(yù)測(cè)β-谷甾醇為“陳皮-半夏”藥對(duì)治療SAP 的關(guān)鍵成分,其次為Cavidine(連接度為27,介度為0.1861,緊密度為0.4182)、川陳皮素(連接度為25,介度為0.2090,緊密度為0.4212),見(jiàn)表3。PTGS2 在網(wǎng)絡(luò)中的連接度為14,介度為0.1441,緊密度為0.4978,預(yù)測(cè)PTGS2 為“陳皮-半夏”藥對(duì)治療SAP 的最主要靶點(diǎn)。HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。
圖7 “藥物成分-疾病靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖
表3 “陳皮-半夏”治療SAP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)
穩(wěn)定型心絞痛(SAP)在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中學(xué)中歸為“胸痹”“心痛”病的范疇,引起疾病發(fā)生的內(nèi)外因素包括:情志失調(diào)、飲食不節(jié)、勞倦內(nèi)傷、寒邪內(nèi)侵、體虛等,其病位在心、肝、腎、脾等臟腑,主要在心,基本病機(jī)為“陽(yáng)微陰弦”,為本虛標(biāo)實(shí)之證,本虛為氣、血、陰、陽(yáng)虧虛以致心脈失養(yǎng);標(biāo)實(shí)為寒凝、血瘀、氣滯、痰濁導(dǎo)致胸陽(yáng)不展、心脈不通[4]。由于現(xiàn)在人們飲食上膏粱厚味,導(dǎo)致痰濁內(nèi)生,阻滯氣機(jī),所以臨床中痰濁阻滯型SAP 較為常見(jiàn),“陳皮-半夏”在臨床中是常用的理氣祛痰藥對(duì),陳皮味苦、辛,性溫,燥濕化痰、理氣開(kāi)胸,半夏味辛,性溫,溫化寒痰,尤善治臟腑之痰,兩者相須為用,可理氣化痰,通痹止痛[5],有效治療“痰濁阻滯型”SAP。
本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步篩查“陳皮-半夏”的主要活性成分為naringenin(柚皮素)、nobiletin(川陳 皮 素)、coniferin(松 柏 苷)、baicalein(黃 芩 素)、beta-sitosterol(β- 谷 甾 醇)、Baicalin(黃 芩 苷)、Stigmasterol(豆甾醇)等18 個(gè)活性成分,篩選出與SAP 相 關(guān) 的 靶 點(diǎn) 基 因MAPK3、TP53、HSP90AA1、PPARG、JUN 等48 個(gè)。PPI 可 分 解 出 三 個(gè) 功 能 模塊,三個(gè)模塊中最佳評(píng)分的生物學(xué)進(jìn)程為:Cellular response to chemical stress、Positive regulation of heart rate by epinephrine-norepinephrine、Blood coagulation,fibrin clot formation。GO 富集分析集中作用于regulation of tube diameter(管徑調(diào)節(jié))、blood vessel diameter maintenance(血 管 直 徑 維 持)、regulation of tube size(管 尺 寸 調(diào) 節(jié))、regulation of muscle contraction(調(diào) 節(jié) 肌 肉 收 縮)、regulation of blood pressure(調(diào)節(jié)血壓)、regulation of blood circulation(調(diào)節(jié)血液循環(huán))、adenylate cyclase-modulating G proteincoupled receptor signaling pathway(腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路)、regulation of muscle system process(肌肉系統(tǒng)過(guò)程)、vascular process in circulatory system(循環(huán)系統(tǒng)中的血管進(jìn)程)、blood circulation(血液循環(huán))等相關(guān)生物過(guò)程(biological process),KEGG 功能富集集中于Adrenergic signaling in cardiomyocytes(心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào))、Calcium signaling pathway(鈣信號(hào)通路)、Lipid and atherosclerosis(脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化)、cAMP signaling pathway(cAMP 信號(hào)通路)、Apoptosis(細(xì)胞凋亡)等信號(hào)通路。這證明“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯型”SAP 具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路聯(lián)合生效的優(yōu)點(diǎn)。
將“藥 物 成 分-SAP 靶 點(diǎn)- 通 路”網(wǎng) 絡(luò) 用CytoScape 內(nèi)置的Network Analyzer 分析其網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)可以得出:β-谷甾醇、Cavidine、川陳皮素為“陳皮- 半夏”治療SAP 的關(guān)鍵活性成分;PTGS2、HSP90AA1、MAPK3、MAPK1、JUN、PTGS1、TP53 為為“陳皮-半夏”治療SAP 的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。
有實(shí)驗(yàn)[6]發(fā)現(xiàn),Nob(川陳皮素)可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,減輕氧化應(yīng)激損傷。也有實(shí)驗(yàn)[7]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可防止中風(fēng)、靜脈血栓等危險(xiǎn)事件的發(fā)生,是β-谷甾醇經(jīng)過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制凝血酶的活性從而發(fā)揮抗凝作用,使血栓溶解。此外還有實(shí)驗(yàn)[8]得出,β-谷甾醇對(duì)哇巴因、烏頭堿以及心肌缺血引起的心率失常有明顯遏制作用。因此“陳皮-半夏”可能通過(guò)川陳皮素、β-谷甾醇治療SAP。
有研究[9]報(bào)道,COX-2(PTGS2)靶點(diǎn)蛋白在炎癥和動(dòng)脈血栓形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用,血小板聚集和局部炎癥反應(yīng)都是加快血栓形成的重要因素,下調(diào)COX-2 的表達(dá)能夠改善可能引起血栓的細(xì)胞炎性因子變化,降低細(xì)胞炎性反應(yīng),有可能減緩冠心病動(dòng)脈血栓形成。在急性心梗和冠心病患者中血清COX-2水平升高,在大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型中COX-2 的表達(dá)在誘導(dǎo)血栓形成后14 天顯著升高,而下調(diào)COX-2后能顯著改善大鼠的癥狀[10]。
李琳、蔡紅雁、郭濤[11]等做實(shí)驗(yàn)證明,心功能異常、心肌肥大和心臟重塑可由β 腎上腺素能受體信號(hào)(βA R)的長(zhǎng)期激活引起。王彥珍、羅健東[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)外界刺激或體液因子導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí),通過(guò)Ca2+/CaM 激活鈣信號(hào)通路(CaN),活化的CaN 發(fā)生細(xì)胞質(zhì)中的NF-AT3 去磷酸化進(jìn)入細(xì)胞核等一系列反應(yīng),結(jié)果使心肌收縮蛋白基因表達(dá)上調(diào)、蛋白合成增加、細(xì)胞體積增大,心肌從而發(fā)生肥大。過(guò)表達(dá)circUK2 可通過(guò)靶向下調(diào)miR-483-5p 抑制oxLDL 誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡,從而減少心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[13]。因此推測(cè)“陳皮-半夏”治療SAP 主要是通過(guò)β-谷甾醇、川陳皮素作用于PTGS2(COX-2)靶點(diǎn)蛋白刺激心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)、鈣信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等信號(hào)通路來(lái)治療SAP。
結(jié)合上述討論可以看出,“陳皮-半夏”這一藥對(duì)的同一活性成分可作用于不同靶點(diǎn),而同一靶點(diǎn)又可調(diào)控不同生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路,顯現(xiàn)出“陳皮-半夏”治療SAP 擁有多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用的優(yōu)點(diǎn)。這表明如果調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的單個(gè)或多個(gè)重要靶點(diǎn)即可對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)節(jié),這為臨床上使用“陳皮-半夏”治療“痰濁阻滯”型SAP 提供了科學(xué)依據(jù),為后續(xù)審定“陳皮-半夏”臨床療效指標(biāo)提供了標(biāo)準(zhǔn),也為發(fā)掘“陳皮-半夏”的潛在作用機(jī)制提供了新的方向。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)科學(xué)的方法來(lái)研究中藥多方面的藥理特性,用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)來(lái)反饋中藥有效成分的各項(xiàng)理化和生物學(xué)性質(zhì),為探索單味中藥、中藥藥對(duì)、中藥方劑的各種復(fù)雜作用模式提供了新的角度[14],同時(shí)也為其在臨床中的應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù),但由于只是推論,所以仍舊需要實(shí)驗(yàn)來(lái)加以驗(yàn)證,進(jìn)而明確“陳皮-半夏”治療SAP 的主要調(diào)控靶點(diǎn)。