歐祥琴　張林　鄭學菊

摘要 目的：采用網(wǎng)絡藥理學方法探索薏苡附子敗醬散治療盆腔炎性疾?。≒ID）潛在作用機制，并通過動物實驗對相關(guān)炎癥指標進行驗證。方法：通過“中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）”檢索薏苡附子敗醬散成分和靶點，人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCard）及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）檢索PID靶基因?？梢暬ぞ呃L制“疾病-藥物”蛋白互作用網(wǎng)絡圖，行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，通過動物實驗對相關(guān)炎癥指標進行驗證。結(jié)果：薏苡附子敗醬散治療PID有21個有效成分及197個靶基因，“疾病-藥物”有47個交集基因。GO富集有77個條目，主要與氧化應激反應、上皮細胞增殖等有關(guān)，KEGG富集分析有125條通路，主要涉及糖基化終產(chǎn)物受體配體通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、促分裂素原活化蛋白激酶信號通路等。這些通路與炎癥反應相關(guān)。故由此推測薏苡附子敗醬散可能通過抗炎治療PID。動物實驗證明：薏苡附子敗醬散可降低PID大鼠血清及子宮組織中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及提高白細胞介素-10（IL-10）水平及表達，改善結(jié)果呈劑量依賴性關(guān)系。結(jié)論：薏苡附子敗醬散可通過調(diào)節(jié)IL-6、IL-10、TNF-α水平及其蛋白表達情況而發(fā)揮治療PID的作用。

關(guān)鍵詞 薏苡附子敗醬散;盆腔炎性疾病;藥理學機制;炎癥介質(zhì)

Potential Pharmacological Mechanism of Yiyi Fuzi Baijiang San in the Treatment of Pelvic Inflammatory Diseases

OU Xiangqin1，ZHANG Lin2，ZHENG Xueju3

（1 Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 560000，China; 2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 The First Affiliated Hospital of Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001，China）

Abstract Objective：To explore the potential mechanism of Yiyi Fuzi Baijiang San in the treatment of pelvic inflammatory diseases（PID） by network pharmacology，and to verify the related inflammatory indexes by animal experiments.Methods：The components and targets of Yiyi Fuzi Baijiang San were searched by “Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis platform（TCMSP）”.The target genes of PID were searched by Genecard and OMIM database.The “disease-drug” protein-protein interaction network map was drawn by visualization tools and enriched and analyzed by Gene Ontology（GO） functional enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome（KEGG） pathway enrichment analysis.The relevant inflammatory indexes were verified by animal experiments.Results：There were 21 active components and 197 target genes in the treatment of PID with Yiyi Fuzi Baijiang San and 47 overlapping genes in the “disease-drug” network.There were 77 items in GO enrichment，which were mainly related to oxidative stress and epithelial cell proliferation.KEGG enrichment analysis had 125 pathways，including advanced glycation end product receptor-ligand pathway，liquid shear stress and atherosclerosis，mitogen-activated protein kinase signal pathway，and so on.These pathways were associated with inflammation.Therefore，it was speculated that Yiyi Fuzi Baijiang San may treat PID with anti-inflammation.Animal experiments showed that Yiyi Fuzi Baijiang San decreased the levels of interleukin-6（IL-6） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） in serum and uterine tissues of rats with PID and increased the level and expression of interleukin-10（IL-10） in a dose-dependent manner.Conclusion：Yiyi Fuzi Baijiang San can treat PID by regulating the levels of IL-6，IL-10，TNF-α，and protein expression.

Keywords Yiyi Fuzi Baijiang San; Pelvic inflammatory disease; Pharmacological mechanism; Inflammatory factors

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.02.004

盆腔炎性疾?。≒elvic Inflammatory Disease，PID）是女性常見的上生殖道感染性疾病，其急性發(fā)作時可導致敗血癥、感染性休克，若其未能得到及時有效治療，可導致不孕癥、異位妊娠、慢性盆腔痛等，給患者造成嚴重的生理、心理負擔［1］。2017年《中醫(yī)藥單用/聯(lián)合抗生素治療常見感染性疾病臨床實踐指南：盆腔炎性疾病》［2］指南指出：臨床治療PID應該合理規(guī)范應用中醫(yī)藥治療PID，應用抗生素治療同時，應增加中醫(yī)藥優(yōu)勢和特色。PID主要治療方式為抗生素治療，但長期使用易產(chǎn)生耐藥性［3］。研究證實中藥單獨或聯(lián)合抗生素治療PID可減少慢性盆腔痛的發(fā)生率［4-6］。中醫(yī)從“扶正祛邪”角度出發(fā)，以辨治施治為治則，采用中藥治療PID，可顯著提高療效、縮短療程、預防復發(fā)［7-8］。

薏苡附子敗醬散出自《金匱要略》，原為腸癰專方，但現(xiàn)代臨床已廣泛應用于婦科、消化、呼吸等多科病癥［9-10］。在婦科疾病中，薏苡附子敗醬散治療PID療效較好［11-14］，研究證實薏苡附子敗醬散能有效促進盆腔血液循環(huán)，改善患者血清C反應蛋白水平［14］，但薏苡附子敗醬散治療PID相關(guān)機制尚未明確，本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學、高通量基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）基因芯片技術(shù)、實驗驗證，探索藥物-疾病潛在靶點及治療作用，為相關(guān)實驗和臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物成分收集和篩選 基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）平臺［15］，以“薏苡仁”“附子”“敗醬草”為關(guān)鍵詞檢索薏苡附子敗醬散藥物成分靶點，以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18作為標準，選出薏苡附子敗醬散主要活性成分，建立成分數(shù)據(jù)列表。

1.2 藥物靶點篩選 將TCMSP平臺獲取的藥物活性成分作用靶點，利用通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，UniProt）（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫［16］對靶點信息進行規(guī)范化處理，限定物種為人（Homo Sapiens），查找蛋白質(zhì)名稱，篩選對應基因。

1.3 PID相關(guān)靶標篩選 根據(jù)人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）（https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/）［17］及在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//www.omim.org/）［18］，直接檢索關(guān)鍵詞“Pelvic inflammatory disease”信息，將獲取的靶蛋白數(shù)據(jù)根據(jù)通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Universal Protein，UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對應基因，校正標準化靶點基因名稱。

1.4 構(gòu)建方劑-成分-靶標-疾病網(wǎng)絡示意圖 通過R語言對藥物靶點及PID相關(guān)靶標數(shù)據(jù)集取交集處理，得到與PID相關(guān)潛在藥效成分和作用靶標，導入蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫（Search Tool for the Retrieval of Interaction Gene/Protein，String）（https：//string-db.org/cgi/input.pl）［19］中，物種設置為人（Homo sapiens），最低閾值設置為0.400，其他參數(shù)默認。通過Cytoscape 3.7.1軟件可視化多元素多水平間作用關(guān)系，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖。

1.5 通路富集分析 通過RStuidio1.2.5042版本R4.0.0中clusterProfile、pathview、org.Hs.eg.db等相關(guān)生物包，進行藥物與盆腔炎性疾病相關(guān)靶基因基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，篩選相關(guān)生物學過程和信號通路。

1.6 GEO基因芯片驗證 在GEO數(shù)據(jù)庫中，找到GSE110106［20］基因芯片，根據(jù)R4.0.0中l(wèi)imma和impute程輯包，將數(shù)據(jù)進行分組，找到PID相關(guān)基因表達差異，與1.2.3中找到的疾病-藥物基因交集進行比較，檢測相關(guān)基因表達。

2 結(jié)果

2.1 藥效成分統(tǒng)計 薏苡附子敗醬散共有21個有效成分，其中敗醬草12個，薏苡仁6個，附子6個，谷甾醇是三者共有成分，豆甾醇是敗醬草和薏苡仁共有成分。見表1。

2.2 藥物靶點篩選 共獲得藥物靶基因198個，度值排名前5位分別是槲皮素、山柰酚、木犀草素、谷固醇、豆甾醇。黃色為敗醬草成分;粉紅色為附子成分;綠色為薏苡仁成分;紅色是共有成分。薏苡附子敗醬散靶點共有99個。見圖1。

2.3 “疾病-藥物”PPI網(wǎng)絡 PID相關(guān)靶標基因共197個，與2.2所得藥物靶基因共有47個相交基因。見表2。分子互作用網(wǎng)絡圖顯示白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular Endothelial Growth Factor A，VEGFA）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha Serine/threonine-protein Kinase，AKT1）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）是核心靶點（圖2）分子相互作用條形圖（圖3）顯示度值排名前五分別是IL-6蛋白、VEGFA蛋白、細胞腫瘤抗原P53（Cellular Tumor Antigen P53，TP53）蛋白、AKT1蛋白、TNF蛋白。

2.4 GO功能和KEGG富集分析

2.4.1 GO功能富集分析 顯示共有77個相關(guān)靶點（P<0.05）。前20核心交互靶點見圖4。主要涉及氧化應激反應（Response to Oxidative Stress）、上皮細胞增殖（Epithelial Cell Proliferation）、放射反應（Response to Radiation）等。

2.4.2 KEGG富集分析 顯示共有24條通路（P<0.05）、20個核心通路見圖5。圓圈越大代表Count計數(shù)越大，顏色越深代表P值越小。主要涉及糖基化終產(chǎn)物受體配體通路（AGE-RAGE）、液體剪切應力和動脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、癌癥蛋白聚糖（Proteoglycans in Cancer）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化（Lipid and Atherosclerosis）促分裂原活化的蛋白激酶信號通路（MAPK Signaling Pathway）等。

3 實驗驗證

3.1 材料與方法

3.1.1 動物 無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級6～8周齡SD雌性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供［SYXK（Q黔）2022-0080］，動物倫理審批號：20220911。實驗室普通清潔環(huán)境喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)3 d后開始造模。

3.1.2 藥物 薏苡附子敗醬散（薏苡仁30 g、附子6 g、敗醬草15 g）均由貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥房提供，按湯劑方法煎煮方法制備。

3.1.3 試劑與儀器 混合菌液（由貴州中醫(yī)藥大學實驗室饋贈），IL-6、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒、放射免疫沉淀法（Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解緩沖液、IL-6抗體、IL-10抗體（北京索來寶有限公司，貨號分別為：SEKR-0005、SEKR-0006、SEKR-0006、R0010、K009385P、K009382P）;TNF-α（anbcam公司，英國，貨號：ab255275），β-actin（北京中杉，貨號：TA-09）。增強型化學發(fā)光試劑盒（Enhanced Chemiluminescence，ECL）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：sc-2048），水合氯醛（上海易恩化學技術(shù)有限公司，貨號：302-17-0）;酶標分析儀（無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司，貨號：DR-3518G），低溫高速型離心機（力辰科技，貨號：LC-LX-H185C），AE31熒光倒置顯微鏡（麥克迪奧實業(yè)集團有限公司，型號：AE31 EF-INV）;蛋白濃度定量儀（Eppendorf公司，德國，型號：BioPhotometer Plus）;FluorChem E Alpha型化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（ProteinSimple公司，美國，型號：FluorChem E）。

3.1.4 分組與模型制備 在雌性大鼠32只中隨機選取6只為空白組，剩下26只進行麻醉（10%水合氯醛溶液4 mL/kg）、去毛暴露下腹部皮膚、消毒、開腹、暴露子宮并固定，使用1 mL磨去針尖注射器針頭從子宮分叉處分別進入兩側(cè)宮腔，沿著子宮壁向卵巢方向往返刮2次造成機械損傷，推注0.1 mL細菌混合液（金黃色葡萄球菌∶大腸埃希菌=1∶1，濃度為1.5×108/mL），關(guān)腹。3 d后，隨機處死2只造模大鼠，肉眼觀察盆腔組織粘連、充血，鏡下子宮組織結(jié)構(gòu)紊亂則造模成功。將存活的24只PID大鼠采用簡單隨機化隨機分為模型組、空白組、薏苡附子敗醬散高、中低劑量組，每組6只。

3.1.5 給藥方法 按照人與大鼠體表面積進行換算出合理用藥劑量，高、中、低劑量分別為34.65 g/kg、17.33 g/kg、8.66 g/kg，模型組、空白組分別以10 mL/kg生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。

3.1.6 檢測指標與方法 1）各組大鼠血清中IL-6、IL-10及TNF-α水平：使用酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）檢測各組大鼠血清中炎癥指標水平（IL-6、IL-10及TNF-α）：給藥結(jié)束后，麻醉大鼠后，提取經(jīng)腹動脈血10 mL，離心留取血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測。2）大鼠子宮組織中IL-6、IL-10及TNF-α表達測定：使用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組大鼠子宮組織中炎癥指標水平（IL-6、IL-10及TNF-α）：采血結(jié)束后，取子宮組織剪成碎片，RIPA裂解緩沖液提取蛋白，BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度，加入緩沖液，進行蛋白變性（100 ℃加熱10 min），轉(zhuǎn)膜，各組取等量蛋白，室溫下?lián)u床上封閉2 h，加入一抗（IL-6為1∶500，IL-10為1∶500，TNF-α為1∶1 000）4 ℃反應過夜，二抗（1∶500）作用90 min，ECL發(fā)光試劑盒顯色，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析目的條帶灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與GAPDH的比值為其相對表達量。

3.1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，其中計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差（±s），符合正態(tài)、獨立、方差齊性的數(shù)據(jù)，組間比較采用兩樣本獨立t檢驗；否則采用秩和檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.2 實驗結(jié)果

3.2.1 各組大鼠血清中炎癥介質(zhì)水平比較 與空白組大鼠比較，模型組IL-6、TNF-α水平均上升，IL-10水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，薏苡附子敗醬散高、中、低劑量組，IL-6、TNF-α水平均下降，IL-10水平上升，且呈劑量依賴性關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3.2.2 各組大鼠子宮中炎癥介質(zhì)蛋白表達情況 與空白組大鼠比較，模型組IL-6、TNF-α表達明顯升高，IL-10表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。與模型組比較，薏苡附子敗醬散低、中、高劑量組，IL-6、TNF-α表達明顯降低，IL-10表達明顯升高，且呈劑量依賴性關(guān)系，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖6。

4 討論

4.1 藥物活性成分與靶標分析 薏苡附子敗醬散藥物靶標度值排名前五成分分別是槲皮素、山柰酚、木犀草素、谷固醇、豆甾醇;谷甾醇是三者共有成分，豆甾醇是敗醬草和薏苡仁共有成分，且谷甾醇和豆甾醇OB及DL值均高于平均水平，故推測二者可能是薏苡附子敗醬散治療PID核心成分。研究表明，谷甾醇可通過上調(diào)P53表達、下調(diào)B淋巴細胞瘤-2（B Lymphoma-2，Bcl-2）表達誘導細胞凋亡［21］。KURANO等［22］發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)血漿谷甾醇水平與IL-6、TNF-α水平呈負相關(guān)，說明谷甾醇具有抗炎作用。LIANG等［23］證明，豆甾醇可減輕一氧化碳、丙二醛、環(huán)氧合酶-2水平，增加血紅素加氧酶-1、抗氧化酶水平，進而減輕炎癥和提高抗氧化能力以減輕大鼠腦缺血/再灌注損傷;馮思敏等［24］發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇和豆甾醇可降低小鼠急性結(jié)腸炎的IL-1β、IL-6、環(huán)氧合酶-2等炎癥介質(zhì)水平。

4.2 PPI網(wǎng)絡分析 薏苡附子敗醬散與PID基因配對顯示，IL-6、VEGFA、TP53、AKT1、TNF蛋白相互作用度值較大，可能是薏苡附子敗醬散治療PID關(guān)鍵靶點。AKT蛋白可通過磷酸化作用影響炎癥介質(zhì)釋放參與抗炎調(diào)節(jié)、細胞凋亡［25］，本研究猜測薏苡附子敗醬散治療PID與AKT1蛋白表達有關(guān)，但是AKT1與PID相關(guān)研究不多，以后可以探索相關(guān)實驗或研究。研究發(fā)現(xiàn)，PID患者宮頸黏液中IL-6水平明顯高于未患PID的婦女，本研究認為IL-6水平測定，有助于急性盆腔炎臨床診斷［26］。一項大鼠盆腔炎模型發(fā)現(xiàn)，針藥結(jié)合可以明顯降低模型組TGF-β和VEGF表達水平，緩解盆腔組織纖維化和粘連［27］;桂枝茯苓丸可能通過降低大鼠子宮組織TNF-α和TGF1、VEGF表達，緩解和消除。局部炎癥過程［28］。

4.3 富集結(jié)果分析 薏苡附子敗醬散治療PID靶基因GO富集主要涉及：主要涉及氧化應激反應、上皮細胞增殖等，提示薏苡附子敗醬散治療PID的靶基因可能通過影響這些生物過程促進PID好轉(zhuǎn);薏苡附子敗醬散治療PID靶基因KEGG通路主要涉及：糖基化終產(chǎn)物受體配體通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化、乙型肝炎、癌癥蛋白聚糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化MAPK Signaling Pathway。這些信號通路與炎癥反應相關(guān)。故由此推測薏苡附子敗醬散可能通過抗炎及調(diào)節(jié)免疫治療PID。

4.4 實驗結(jié)果分析 本研究通過混合菌加機械損傷造成PID大鼠模型，并用薏苡附子敗醬散高、中、低劑量進行干預，結(jié)果顯示，模型組大鼠血清及子宮組織中IL-6、TNF-α水平及表達均升高，IL-10降低;藥物高、中、低劑量組IL-6、TNF-α水平及表達均下降，IL-10升高，且呈劑量依賴性關(guān)系，提示薏苡附子敗醬散可改善PID炎癥介質(zhì)水平，這與網(wǎng)絡藥理學結(jié)果相對應。IL-10可通過抑制炎癥介質(zhì)合成與釋放而發(fā)揮負反饋調(diào)節(jié)作用［29］，IL-6與TNF-α可通過介導炎癥介質(zhì)分泌及炎癥反應，加劇PID患者盆腔組織損傷［30］。研究證明JAK/STAT信號通路參與PID疾病發(fā)展［31］，其是IL-6下游信號通路，當其被激活后，可抑制IL-6信號通路介導的生物活性而減少機體炎癥狀態(tài)［32］;IL-10亦可通過JAK/STAT3信號通路抑制IL-8、TNF-α等炎癥介質(zhì)表達［33］，因此本研究推測薏苡附子敗醬散可通過JAK/STAT信號通路而調(diào)節(jié)IL-6、IL-10、TNF-α水平發(fā)揮抗炎作用，但由于條件有限，尚未來得及進行相關(guān)驗證，以后可進行相關(guān)實驗，探討及驗證薏苡附子敗醬散治療PID的具體機制。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法初步揭示了薏苡附子敗醬散治療PID的相關(guān)機制，并通過動物實驗驗證了薏苡附子敗醬散可調(diào)節(jié)PID大鼠血清及子宮組織中IL-6、IL-10、TNF-α水平及表達而發(fā)揮抗炎作用，為后續(xù)的深入研究提供重要依據(jù)。

利益沖突聲明：無。

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（2021-04-15收稿 本文編輯：王明）

基金項目：貴州省科技計劃項目——基礎研究計劃項目（黔科號LH字【2017】7124號）作者簡介：歐祥琴（1993.09—），女，碩士研究生在讀，住院醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對女性生殖內(nèi)分泌調(diào)控，E-mail：1731742636@qq.com通信作者：鄭學菊（1979.01—），女，碩士，副主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥對女性生殖內(nèi)分泌調(diào)控，E-mail：540976866@qq.com