黃兆春，霍應(yīng)棟，趙喜棪，郝志云，沈繼源，羅玉柱，劉秀，李少斌，王繼卿

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動物生物技術(shù)重點實驗室，甘肅省牛羊基因改良工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省會寧縣郭城驛鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，甘肅 白銀 730726；3. 甘肅康牛育種有限責(zé)任公司，甘肅 白銀 730726）

母羊泌乳量顯著影響了羔羊的成活率和生長速度，是制約養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟效益的一個關(guān)鍵因素。乳腺是母畜生成和分泌乳汁的唯一場所，它的發(fā)育受到內(nèi)分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、受體、細胞內(nèi)外信號分子等多種因素的影響。在這些因素中，激素發(fā)揮了重要調(diào)控作用［1］。研究表明，激素對乳腺發(fā)育的調(diào)控作用具有物種差異性，即在不同物種中，它們對乳腺發(fā)育的調(diào)控作用有所差異。例如，雌激素誘導(dǎo)了小鼠乳腺間質(zhì)和導(dǎo)管上皮的增殖，但它對奶牛乳腺間質(zhì)細胞的增殖無顯著影響［2］。催乳素是小鼠合成乳汁所必需的激素，但在牛和山羊上研究發(fā)現(xiàn)，用溴隱亭阻斷催乳素分泌后并不影響乳汁的分泌［3］。這表明，在不同的物種中，應(yīng)專門研究激素在乳腺發(fā)育中的個性化作用。

在家畜上，人們主要研究了奶牛和奶山羊血液中一些重要激素含量的變化情況。例如，在奶牛上，雌二醇含量在分娩時達到峰值，而泌乳期和干奶期含量則較低［4］。前人也檢測了妊娠期和泌乳期奶山羊血液中雌激素和催乳素的濃度［3］。目前，人們也研究了一些綿羊品種在部分乳腺發(fā)育時期的激素含量變化。李愛華等［5］研究了灘羊空懷期、妊娠前期、妊娠后期和泌乳期血液中雌二醇、孕酮和催乳素的分泌規(guī)律，發(fā)現(xiàn)這些激素在4個乳腺發(fā)育時期呈現(xiàn)出差異化分泌。Bassett 等［6］在美利奴羊上發(fā)現(xiàn)，孕酮在妊娠期持續(xù)上升，妊娠后期達到最高值。有學(xué)者也研究了小尾寒羊產(chǎn)后催乳素［7］、孕酮、雌激素和催乳素的濃度變化情況［8］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后催乳素濃度呈顯著下降趨勢，雌激素和孕酮濃度在產(chǎn)后45天達到最高峰。但是，目前尚未全面研究在綿羊乳腺發(fā)育的整個過程中，雌激素、催乳素、孕酮、生長激素、糖皮質(zhì)激素、胰島素、胰島素樣生長因子I這些調(diào)控乳腺發(fā)育重要激素的變化規(guī)律。因此，本研究以成年小尾寒羊為研究對象，采集空懷期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期、泌乳早期以及泌乳中后期這6個乳腺發(fā)育關(guān)鍵時期的血液，用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），測定血液中上述7種激素的濃度，探討主要激素在不同乳腺發(fā)育階段的分泌規(guī)律和調(diào)控機理，進而為調(diào)控乳腺發(fā)育提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣品采集

在甘肅省白銀市會寧縣郭城驛鎮(zhèn)康園肉羊養(yǎng)殖場相同的飼養(yǎng)管理條件下，選擇3 歲、健康、膘情中等、體重接近的8只小尾寒羊母羊，用DW-370臺式獸用B超儀（大為，江蘇）檢測試驗羊只的發(fā)情、妊娠和分娩狀態(tài)，之后根據(jù)羔羊出生時間校正母羊乳腺發(fā)育時期。在試驗羊只的空懷期、妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期、泌乳早期和泌乳中后期，每只羊頸靜脈采血3 mL，之后迅速在3 000 r/min下離心15 min分離出血清，暫存于液氮中，帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 7種激素含量的測定

從泉州睿信生物科技有限公司購買雌激素和孕酮ELISA試劑盒，從上海泛柯實業(yè)有限公司購買催乳素、生長激素、糖皮質(zhì)激素、胰島素和胰島素樣生長因子I ELISA 試劑盒。根據(jù)試劑盒操作說明，將標準樣品稀釋為5 個濃度梯度（分別定義為標準品1、標準品2、標準品3、標準品4和標準品5，表1），用3020 型多功能微孔板讀數(shù)儀（賽默飛，芬蘭）測定每個標準品的D值。

表1 標準品濃度Table 1 The concentration of standard sample

1.3 標準曲線和回歸方程的建立

根據(jù)葛聞博等的方法［9］，以標準樣品濃度為橫坐標，測定的相應(yīng)D值為縱坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程Y=ax2+bx+c，其中Y代表標準樣品濃度，a、b、c為常數(shù)，x代表D值。計算回歸方程的擬合度R2（0＜R2＜1），該值越接近于1，說明回歸方程的擬合度越好）來判斷方程的準確性。

對于在每個乳腺發(fā)育時期采集的8個試驗樣本，每個樣本設(shè)置2個技術(shù)重復(fù)，共16個重復(fù)，用ELISA法測定它們的D值。具體方法是設(shè)置空白孔、標準孔以及待測樣品孔，加入相應(yīng)樣品，在37 ℃下反應(yīng)30 min 棄液體，洗板5 次；加入酶標試劑（HRP 標記抗原和抗體混合物），在37 ℃下反應(yīng)30 min，洗板5次；加入顯色液A和B，在37 ℃下反應(yīng)10 min，加入終止液。最后在450 nm下，用3020型多功能微孔板讀數(shù)儀測定樣品D值。根據(jù)建立的回歸方程和樣本的D值，計算待測激素的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，分析結(jié)果用xˉ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種激素標準品的D值和標準曲線

對應(yīng)于5個標準品，7種激素的D值見表2。

表2 7種激素標準品的D值Table 2 D value of standard samples for seven hormones

根據(jù)5個標準品的濃度和D值，建立了7種激素的如下回歸方程：

雌激素：Y=55x2-143x+125（R2=0.99）

孕酮：Y=75x2-165x+120（R2=0.99）

生長激素：Y=0.5x2-1.1x+0.8（R2=0.99）

催乳素：

Y=44.196x2-165.8x+172.5（R2=0.99）

糖皮質(zhì)激素：

Y=75x2-165x+120（R2=0.99）

胰島素：Y=5x2-11x+8（R2=0.99）

胰島素樣生長因子I：Y=25x2-55x+40（R2=0.99）

2.2 7種激素濃度的測定結(jié)果

各激素濃度測定結(jié)果見表3。

表3 7種激素濃度的測定結(jié)果Table 3 The determined concentration of seven hormones

2.2.1 雌激素 從空懷期到泌乳中后期，雌激素含量呈現(xiàn)出先升后降的總體趨勢。該激素濃度在空懷期最低（35.70 pg/mL），之后急劇上升，在妊娠末期達最高峰（73.01 pg/mL），之后又逐漸下降。妊娠末期雌激素的濃度較泌乳早期、泌乳中后期和空懷期分別高22.53%、27.37%和104.50%（P＜0.05）。

2.2.2 孕酮 孕酮濃度也呈現(xiàn)出先升后降的總體趨勢。它在空懷期的濃度是485.46 pmol/L，進入妊娠期后逐步上升，在妊娠末期達最高峰（530.48 pmol/L），之后緩慢下降。妊娠末期孕酮濃度較妊娠中期、妊娠早期和空懷期分別高3.52%、10.70%和9.27%（P＜0.05）。

2.2.3 生長激素 生長激素的濃度范圍為2.36～2.62 μg/L。在乳腺發(fā)育的6 個時期之間，它的濃度無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.4 催乳素 從空懷期開始，催乳素濃度持續(xù)升高，在泌乳早期達到最大值，其在泌乳早期的濃度分別比妊娠中期、泌乳中后期、妊娠早期和空懷期高12.47%、16.17%、46.15%和59.66%（P＜0.05）。

2.2.5 糖皮質(zhì)激素 糖皮質(zhì)激素濃度由大到小依次為：妊娠末期（495.28 pg/mL）＞泌乳早期（488.75 pg/mL）＞泌乳中后期（482.75 pg/mL）＞妊娠中期（465.02 pg/mL）＞空懷期（440.53 pg/mL）＞妊娠早期（433.07 pg/mL）。妊娠末期的糖皮質(zhì)激素濃度較妊娠早期和空懷期分別高14.36%和12.42%（P＜0.05），空懷期、妊娠早期、妊娠中期、泌乳早期和泌乳中后期間的糖皮質(zhì)激素濃度無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.6 胰島素 胰島素濃度由大到小依次為：妊娠早期（36.22 mIU/L）＞妊娠末期（36.10 mIU/L）＞泌 乳 早 期（35.98 mIU/L） ＞ 妊 娠 中 期（35.49 mIU/L）＞空懷期（33.78 mIU/L）＞泌乳中后期（32.22 mIU/L）。空懷期、泌乳中后期與其它時期的胰島素濃度差異顯著（P＜0.05），妊娠早期、妊娠中期、妊娠末期和泌乳早期之間的胰島素濃度無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.7 胰島素樣生長因子I 胰島素樣生長因子I的濃度范圍為147.91～162.46 μg/L。在乳腺發(fā)育的6個時期之間，它的濃度無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

雌激素是雌性動物性器官發(fā)育和維持正常性機能的主要激素。在本研究中，空懷期時的雌激素濃度最低，妊娠末期達到最高值，分娩后逐步下降，這與前人在魯西黃牛［10］和建昌黑山羊［11］中的研究結(jié)果一致，說明雌激素對反芻動物乳腺發(fā)育有相似的調(diào)控作用。但是江青東等［12］在大鼠中發(fā)現(xiàn)，空懷期時雌二醇濃度最高，妊娠后急劇下降，泌乳期又逐漸升高，說明反芻動物與嚙齒動物的雌激素分泌規(guī)律有較大差異。在綿羊乳腺不同發(fā)育時期，差異化的雌激素含量與其發(fā)揮的生理作用有關(guān)。在空懷期，雌激素能夠誘導(dǎo)乳腺退化，為乳腺上皮細胞的分化和增殖做好準備［13-14］。妊娠期增加的雌激素濃度能進一步促進綿羊乳腺的腺泡發(fā)育［15］。妊娠末期綿羊的雌激素濃度達到最大值，這是因為：（1）除了胎盤以外，妊娠期的乳腺組織自身也能夠分泌17-β 雌二醇［13］；（2）妊娠末期是乳腺上皮細胞增殖速度最快的時期［16］，而乳腺上皮細胞的增殖需要雌激素的刺激，因此該時期的雌激素濃度較高。另外，Erb等［17］發(fā)現(xiàn)奶牛分娩前的17-β 雌二醇濃度與產(chǎn)后60 天的產(chǎn)奶量呈正相關(guān)。因此為了維持較高的泌乳量，綿羊在妊娠末期可能需要較高的雌激素濃度。

孕酮是一種黃體激素，也是維持妊娠的重要激素。本試驗發(fā)現(xiàn)，妊娠末期小尾寒羊血清中的孕酮含量最高，之后逐漸降低。人們在大鼠［12］和奶山羊［3］上均發(fā)現(xiàn)，妊娠末期的孕酮濃度最大，這與本研究結(jié)果相一致。研究發(fā)現(xiàn)，孕酮在乳腺分化、增殖和退化過程中均發(fā)揮作用，因此在6個時期的血清中均檢測到孕酮。孕酮是乳腺小葉和腺泡發(fā)育必需的一種激素，它能誘導(dǎo)妊娠期腺泡和腺泡腔的形成［3］，因此，在妊娠中后期的綿羊中有較高的孕酮濃度。妊娠末期逐漸增大的孕酮含量加速了乳腺上皮細胞的增殖，進一步增大了腺泡腔，最終導(dǎo)致乳腺完全發(fā)育。由于孕酮對α-乳清蛋白和乳形成有一定的抑制作用［18］，因此為了促進乳汁分泌，分娩后孕酮含量逐漸降低。

催乳素是垂體前葉合成和分泌的一種多肽類激素。在本研究中，泌乳早期小尾寒羊血清中的催乳素濃度最大，這與王康［6］在綿羊上的研究結(jié)果一致，也與前人在魯西黃牛［10］、灘羊［5］、奶山羊［3］和大鼠［12］上的結(jié)果相一致。研究表明，催乳素對乳腺生長發(fā)育和退化具有多重作用［19］，它還具有間接維持妊娠的作用［20］，因此它在綿羊空懷期、妊娠期和泌乳期均分泌。妊娠期分泌的催乳素促進了乳腺小葉腺泡發(fā)育以及小葉上皮細胞的增殖［3］。催乳素的另一作用是刺激并維持泌乳，它與乳汁和乳蛋白合成也密切相關(guān)［21］。因此它在綿羊妊娠末期和泌乳初期有較高的含量。但是妊娠末期較高的雌激素和孕酮含量抑制了催乳素的泌乳作用，分娩后隨著這兩種激素特別是雌激素含量的下降，解除了對催乳素的抑制作用，導(dǎo)致泌乳發(fā)生。此外，泌乳早期較高的催乳素含量可能與羔羊頻繁的吮乳有關(guān)［3］。泌乳高峰過后，隨著泌乳量的降低，催乳素的含量也隨之降低。

本研究中，小尾寒羊血清中的糖皮質(zhì)激素濃度在妊娠中期開始急劇上升，并在妊娠末期達到最高值。人們在奶牛［4］和美利奴羊［22］上均發(fā)現(xiàn)，分娩前糖皮質(zhì)激素顯著增加，分娩后下降。Ota等［23］在大鼠上也發(fā)現(xiàn)，隨著泌乳的進行，糖皮質(zhì)激素濃度逐漸減小，這些研究均與本研究結(jié)果一致。研究表明，糖皮質(zhì)激素對乳腺發(fā)育和泌乳具有多重調(diào)控作用［24］，因此它在乳腺發(fā)育的各個階段均分泌。在妊娠期，給奶牛注射糖皮質(zhì)激素后發(fā)現(xiàn)，奶牛開始分泌大量乳汁［4］，說明糖皮質(zhì)激素具有催乳作用，因此妊娠末期較高的糖皮質(zhì)激素是為了給泌乳做好準備。糖皮質(zhì)激素也是啟動分娩和泌乳的重要激素［25］，這些因素造成它在妊娠末期的含量最高。另外，糖皮質(zhì)激素還與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體發(fā)育密切相關(guān)［26］，說明它參與了乳蛋白合成，本研究中該激素在泌乳期具有較高的濃度也證實了這一點。

胰島素是胰島β細胞合成和分泌的一種可溶性蛋白激素，它通過調(diào)節(jié)全身能量分布來滿足家畜乳腺發(fā)育的能量需求［3］。本研究中，妊娠早期小尾寒羊血清中的胰島素濃度最高，泌乳中后期濃度最低。但是，李真［3］在奶山羊上研究發(fā)現(xiàn)，該激素濃度在妊娠早期最高，分娩時最低，這與本研究結(jié)果有一定差異，這種差異可能與物種有關(guān)，但還需要進一步研究。妊娠早期，母羊腸道吸收脂肪能力較強，導(dǎo)致血脂增高，脂肪積存較多，隨之出現(xiàn)胰島素分泌高峰［3］。隨著妊娠的持續(xù)，母羊基礎(chǔ)代謝率會逐漸升高，有些可能還會出現(xiàn)攝食障礙，此時需要動用大量體脂來滿足機體需求，因此胰島素分泌量也隨之緩慢減少［3］。另外，胰島素還可以刺激乳腺上皮細胞增殖［27］，它也是誘導(dǎo)乳蛋白分泌所必需的激素，能促進乳蛋白的合成［28］，因此這也是胰島素在妊娠期和泌乳早期保持較高濃度的另一重要原因。

本研究中，在6個乳腺發(fā)育時期之間，血清中的生長激素和胰島素樣生長因子I 濃度無顯著差異（P＞0.05），這與前人研究結(jié)果一致，李真［3］發(fā)現(xiàn)奶山羊生長激素濃度在乳腺發(fā)育過程中變化不顯著，Handwerger等［29］發(fā)現(xiàn)陶塞特羊中的胰島素樣生長因子I濃度在妊娠期幾乎沒有變化。妊娠末期的生長激素濃度最大，這是因為乳腺合成乳汁需要大量的乳脂和乳糖，而生長激素有調(diào)節(jié)糖和脂肪代謝的功能［3］。胰島素樣生長因子I 屬于類胰島素生長因子的一種，它是乳腺導(dǎo)管生長和終末乳芽增殖所必須的介質(zhì)，能促進乳腺上皮細胞生長、分化和存活［30］，它在乳腺退化的重塑過程中也發(fā)揮了重要作用［31］，因此在小尾寒羊6個乳腺發(fā)育時期的血清中均檢測到胰島素樣生長因子I。

4 結(jié)論

在綿羊6 個乳腺發(fā)育時期，雌激素、孕酮、催乳素、糖皮質(zhì)激素和胰島素這5種激素的濃度有顯著差異（P＜0.05），但生長激素和胰島素樣生長因子I 的濃度無差異（P＞0.05），這種濃度差異影響了綿羊乳腺在不同發(fā)育時期的結(jié)構(gòu)和功能。