王麗，蔡景行，羅沐欣鍵，吳道明，范洪黎，秦松，范成五*

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，貴陽(yáng) 550006；2.貴陽(yáng)市鄉(xiāng)村振興服務(wù)中心，貴陽(yáng) 550081；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/耕地保護(hù)國(guó)家工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，大量工業(yè)活動(dòng)產(chǎn)生的鎘（Cd）被排放到環(huán)境中，加上人類不合理的施肥和灌溉等，導(dǎo)致土壤Cd 污染越來(lái)越嚴(yán)重。據(jù)2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，全國(guó)土壤總點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)16.1%，其中土壤Cd 點(diǎn)位超標(biāo)率為7.0%。土壤Cd 污染不僅會(huì)破壞生態(tài)平衡，而且還會(huì)危害人類生命健康。相關(guān)研究表明，農(nóng)田土壤中的Cd 通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，并與含有羥基、氨基和巰基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，從而抑制酶系統(tǒng)，最終損害肝臟、腎臟和脾臟等，引發(fā)多種疾病，包括骨質(zhì)疏松癥、貧血和肺炎等[1]。因此，減輕農(nóng)田土壤中的Cd 污染，保障農(nóng)作物的安全生產(chǎn)非常必要。

當(dāng)前，Cd 污染土壤治理和修復(fù)的方法可分為物理法、化學(xué)法、生物學(xué)法、農(nóng)藝調(diào)控等，或幾種方法聯(lián)合使用[2]。其中，化學(xué)法中的原位鈍化修復(fù)技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、起效快等優(yōu)點(diǎn)，常被用于修復(fù)中輕度污染農(nóng)田[3]。原位鈍化修復(fù)技術(shù)是通過(guò)溶解沉淀、離子交換吸附、氧化還原、有機(jī)絡(luò)合、螯合等反應(yīng)來(lái)改變Cd 在土壤中的賦存狀態(tài)，從而降低土壤中Cd的遷移性和生物有效性[4]。此外，相關(guān)研究表明，無(wú)機(jī)鈍化劑的施用還可以有效提高土壤pH[5]，而土壤pH 是影響土壤重金屬Cd 溶解度、形態(tài)變化、遷移和生物有效性的主要因子之一[6]。王展等[7]的研究指出，土壤pH 越高，土壤中Cd生物有效性越低，植物所受到的Cd 脅迫程度也會(huì)越低?？梢?，通過(guò)施加鈍化劑降低土壤Cd 含量是有效的。目前，用于Cd 污染土壤修復(fù)的無(wú)機(jī)鈍化材料主要有石灰、石灰石等，但這些材料具有用量過(guò)大、吸附效果差、不具備選擇性吸附等缺點(diǎn)，因此研究新型鈍化材料非常必要。

生物炭?jī)?nèi)部疏松多孔，比表面積大，吸附能力、氧化能力和陽(yáng)離子交換能力強(qiáng)，具有修復(fù)重金屬污染土壤的潛力，另外生物炭可通過(guò)生物廢棄物制備，在修復(fù)土壤的同時(shí)還可提高廢棄物資源合理利用率[8]，因此受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。相關(guān)研究表明，生物炭用于重金屬污染土壤的原位鈍化修復(fù)，可減少作物對(duì)重金屬的吸收和累積[9]。但由于生物炭吸附穩(wěn)定效果弱，被吸附的重金屬有再次析出的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要對(duì)生物炭進(jìn)行改性?，F(xiàn)有研究表明，通過(guò)巰丙基三甲氧基硅烷制備的巰基生物炭可有效地與Cd2+結(jié)合形成結(jié)合態(tài)，降低土壤Cd 含量[10]。但當(dāng)前對(duì)改性巰基生物炭與無(wú)機(jī)鈍化材料的治理效果的對(duì)比研究較少。

蔬菜是人類生活中必不可少的食物，能提供人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。我國(guó)蔬菜種植面積和產(chǎn)量均排在世界首位。但近十幾年來(lái)，我國(guó)蔬菜Cd 含量超標(biāo)問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，廣西、貴州等南方部分地區(qū)蔬菜Cd超標(biāo)率達(dá)到了21.10%[11]，嚴(yán)重威脅到農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)安全。目前，南方地區(qū)針對(duì)鈍化劑對(duì)Cd 污染土壤修復(fù)的研究較多，但大部分研究主要側(cè)重于土壤Cd 的鈍化效果，少有研究將土壤修復(fù)效果和植物生理效應(yīng)等結(jié)合起來(lái)，綜合分析原位鈍化修復(fù)對(duì)土壤環(huán)境和作物的影響。因此，綜合分析有機(jī)和無(wú)機(jī)原位鈍化修復(fù)對(duì)土壤環(huán)境和作物的影響意義較大。

基于此，本研究以我國(guó)南方地區(qū)典型蔬菜——菠菜為研究對(duì)象，通過(guò)設(shè)置有機(jī)、無(wú)機(jī)鈍化劑單施和配施溫室盆栽試驗(yàn)，測(cè)定土壤pH、有效態(tài)Cd 含量及菠菜抗氧化酶活性，闡明施用不同鈍化劑對(duì)Cd 脅迫下菠菜生理特征及Cd 累積的影響，為我國(guó)南方地區(qū)Cd污染土壤治理措施的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自貴州省安順市，利用多點(diǎn)采樣法采集0~20 cm 的污染農(nóng)田土樣，去除表層腐殖質(zhì)和雜物后，自然風(fēng)干、混勻、磨碎過(guò)篩備用。供試土壤重金屬Cd 含量及基本理化性質(zhì)見表1。供試菠菜（Spinacia oleraceaL.）品種為日本大葉菠菜。供試納米羥基磷灰石（Nano-hydroxyapatite）購(gòu)自南京埃普瑞納米材料有限公司，巰基生物炭通過(guò)鹽酸催化浸泡法制備：將玉米秸稈生物炭加入到100 mL 濃度為20%的鹽酸中，80 ℃條件下攪拌反應(yīng)4 h，過(guò)濾、烘干、研碎，制成氫型生物炭。取所制備的氫型生物炭和巰丙基三甲氧基硅烷按質(zhì)量比1∶1 混合，常溫下反應(yīng)6 h，過(guò)濾、漂洗、烘干，將產(chǎn)物研磨過(guò)100 目篩后得到粉末狀的巰基改性生物炭備用[12]。試劑盒購(gòu)自北京太陽(yáng)生物科技有限公司，測(cè)定步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical-chemical properties of tested soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用溫室土培盆栽試驗(yàn)，以菠菜為研究對(duì)象，設(shè)置不施鈍化劑（CK）和施加納米羥基磷灰石（nHAP）、巰基生物炭（TMB）、納米羥基磷灰石+巰基生物炭（HPTB）4個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

育苗方法：將大小均勻的完整種子經(jīng)5%（V/V）NaClO 表面消毒15 min，再用去離子水洗滌數(shù)次后放入25 ℃的去離子水中浸泡12 h，浸泡完成后，放入營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)至4片真葉時(shí)移栽。

培養(yǎng)條件：?jiǎn)问┾g化劑處理各鈍化劑按照2%（m∶m）的比例與土壤混合，配施鈍化劑處理各鈍化劑按照1%（m∶m）的比例與土壤混合，樣品混合均勻后稱取5 kg 裝入深色PVC 方盆（規(guī)格為長(zhǎng)44 cm、寬20 cm、高11 cm），同時(shí)施入底肥，分別為N 0.30 g·kg-1、P2O50.20 g·kg-1、K2O 0.30 g·kg-1，施入形態(tài)分別為（NH4）2SO4、KH2PO4、K2SO4。填裝好的方盆放于溫室中穩(wěn)定1 周后，將長(zhǎng)勢(shì)均勻的菠菜移栽到方盆中，每盆等距定植4 株。菠菜移栽完成后，在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室自然光條件下培養(yǎng)，溫度為25 ℃/20 ℃（晝/夜），相對(duì)濕度為65%~75%，植物培養(yǎng)期間每1~2 d澆水1次，土壤濕度保持在田間持水量的60%~70%。

1.3 樣品采集及測(cè)定

植物樣品采集與處理：在移栽后的第72 天采集方盆中的菠菜植株樣品，將菠菜按照地上部和地下部分開，根部浸入20 mmol·L-1Na2-EDTA 中15 min以除去附著在根表面的Cd2+，然后用自來(lái)水和去離子水沖洗。地下部和部分地上部植株樣品在105 ℃下殺青30 min 后，在70 ℃下干燥至質(zhì)量恒定，然后用球磨儀磨碎裝袋備用。準(zhǔn)備稱取處理后的樣品0.500 0 g 于凱氏定氮瓶中，并加入4 mL HNO3-HClO4混合酸（優(yōu)級(jí)純，體積比4∶1）10 mL 混勻，冷消化過(guò)夜。將消煮管置于消煮爐上，120 ℃加熱60 min，再在180 ℃下消化至溶液變?yōu)闊o(wú)色透明，稍冷卻后，用超純水轉(zhuǎn)移并定容至50 mL，同時(shí)做試劑空白。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS，7700x，Agilent，美國(guó)）測(cè)定植株的Cd含量，測(cè)定方法參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測(cè)定》（GB 5009.268—2016）。部分植株葉片在-20 ℃保存，用于測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量。測(cè)定步驟按照相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

土壤pH 測(cè)定采用玻璃電極法，水土比為2.5∶1。土樣經(jīng)王水+H2O2微波消解冷卻后用超純水定容至50 mL 用于測(cè)定全Cd 含量，土樣經(jīng)0.1 mol·L-1CaCl2浸提液浸提后用于測(cè)定有效態(tài)Cd含量。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行土壤Cd含量的測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)；利用SPSS 22軟件中的LSD 法進(jìn)行單向方差分析（ANO?VA），比較基于ANOVA 得出的最小顯著差異值的結(jié)果，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Pearson 相關(guān)性分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析；利用GraphPad Prism 6、Origin 2022軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鈍化劑處理對(duì)菠菜生物量的影響

由圖1 可知，不同處理下菠菜地上部生物量為5.91~19.81 g·盆-1，地下部生物量為0.66~1.59 g·盆-1，各處理菠菜不同部位生物量均為HPTB>nHAP>TMB>CK，HPTB、nHAP、TMB 處理地上部生物量分別較CK增加了143.75%、90.27%、7.28%，地下部生物量分別增加了91.71%、72.50%、4.81%。HPTB 和nHAP 處理下菠菜生物量顯著高于CK。結(jié)果表明，施用nHAP、TMB、HPTB均能增加菠菜地上部和地下部生物量，其中，HPTB的菠菜生物量最大，nHAP次之。

圖1 不同處理對(duì)菠菜生物量的影響Figure 1 Effects of different treatments on the biomass of Spinacia oleracea L.

2.2 不同鈍化劑處理對(duì)菠菜Cd含量的影響

由圖2 可知，不同處理下菠菜地上部Cd 含量為0.29~1.46 mg·kg-1，地下部Cd 含量為0.44~1.52 mg·kg-1，各處理菠菜不同部位Cd 含量均為CK>TMB>HPTB>nHAP，與CK 相比，TMB、HPTB、nHAP 處理下地上部Cd 含量分別降低了6.94%、65.49%、78.19%，地下部Cd 含量分別降低了39.34%、52.31%、65.98%，nHAP、HPTB 處理下菠菜地上部Cd 含量顯著低于CK和TMB，nHAP、TMB、HPTB 處理下菠菜地下部Cd 含量均顯著低于CK。結(jié)果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能降低菠菜地上部和地下部Cd 含量，其中nHAP 的菠菜Cd含量最低。

圖2 不同處理對(duì)菠菜Cd含量的影響Figure 2 Effects of different treatments on the Cd content of Spinacia oleracea L.

2.3 不同鈍化劑處理對(duì)土壤pH 和有效態(tài)Cd 含量的影響

如圖3 所示，nHAP、TMB、HPTB 處理下土壤pH較CK 分別提高了1.36、0.08、0.76 個(gè)單位，nHAP 和HPTB 與CK 存在顯著差異，TMB 與CK 無(wú)顯著差異。相較于CK，nHAP、TMB、HPTB 的土壤有效態(tài)Cd 含量分別顯著降低了83.22%、22.57%、73.70%。結(jié)果表明，不同鈍化劑處理均能提高土壤pH、降低土壤有效態(tài)Cd含量，其中nHAP效果最為明顯。

圖3 不同處理對(duì)土壤pH和有效態(tài)Cd的影響Figure 3 Effects of different treatments on the pH and available Cd content of soil

2.4 不同鈍化劑處理對(duì)菠菜抗氧化系統(tǒng)的影響

由圖4 可知，nHAP、TMB、HPTB 處理下菠菜CAT活性與CK 無(wú)顯著差異。CK、nHAP、HPTB 處理下菠菜POD 活性無(wú)顯著差異，但均顯著高于TMB，分別增加了21.56%、33.51%和16.00%。nHAP 處理下SOD活性顯著高于其他處理，MDA 含量顯著低于其他處理。結(jié)果表明，施用nHAP 可以提高菠菜葉片抗氧化酶的活性，緩解Cd脅迫下脂膜過(guò)氧化傷害。

圖4 不同處理對(duì)菠菜抗氧化系統(tǒng)的影響Figure 4 Effects of different treatments on the antioxidant system of Spinacia oleracea L.

2.5 相關(guān)性分析

由圖5 可知，CAT、POD、SOD 活性均與MDA 含量呈負(fù)相關(guān)，其中POD活性與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.66，SOD 活性與MDA 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.79。CAT、POD、SOD 活性均與pH 呈正相關(guān)，其中，POD 活性與pH 呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.64，SOD 活性與pH 呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.73。有效態(tài)Cd 含量與pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)，與地上部Cd含量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.97。

圖5 相關(guān)性分析Figure 5 Correlation analysis

3 討論

鈍化劑可通過(guò)降低土壤中重金屬的活性來(lái)減輕其對(duì)作物的毒害[13]。本研究結(jié)果表明，nHAP、TMB、HPTB 均能增加菠菜地上部和地下部生物量。土壤pH 是影響Cd 活性最重要的因素之一[14]，本研究結(jié)果表明，鈍化劑的施加可有效提高土壤pH，降低土壤Cd 含量，這與徐萬(wàn)強(qiáng)等[15]的研究結(jié)果一致，這是由于經(jīng)鈍化劑處理后，土壤pH 上升增加了土壤表面負(fù)電荷，提高了對(duì)Cd2+的吸附，同時(shí)產(chǎn)生的碳酸鹽沉淀[16]有效降低了土壤中CaCl2提取態(tài)的Cd 含量，進(jìn)而降低了菠菜對(duì)Cd 的吸收。此外，Cao 等[17]的研究也指出，在Cd 污染酸性農(nóng)田中施入海泡石可有效提高土壤pH，降低土壤中CaCl2提取態(tài)的Cd 含量，從而減少了小白菜對(duì)Cd的吸收。本研究發(fā)現(xiàn)，nHAP處理的菠菜Cd含量最低，這一方面是由于nHAP的添加提高了土壤pH，從而改變了Cd 的存在形態(tài)，降低了土壤中Cd的可遷移性，進(jìn)而達(dá)到降低菠菜Cd 含量的效果[18]。另一方面是由于納米級(jí)的羥基磷灰石具有高比表面積、組織相容性、多孔性、吸附性等理化性質(zhì)，本身晶格中的Ca2+可以更好地與土壤中的Cd2+進(jìn)行離子交換或表面吸附反應(yīng)等，形成更穩(wěn)定的Cd 磷灰石[19-20]，進(jìn)而降低菠菜對(duì)Cd 累積。而TMB 鈍化效果不如nHAP的原因可能是巰基改性處理為生物炭嫁接了巰基，使得生物炭在酸性條件下仍能有效地吸附重金屬Cd，但是巰基改性處理會(huì)減少生物炭孔隙[21]。

當(dāng)植物受到重金屬脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基（ROS），CAT、POD 和SOD 等可以通過(guò)清除ROS 來(lái)抵御ROS 對(duì)細(xì)胞膜造成的傷害[22]。當(dāng)ROS含量增加時(shí)會(huì)引起脂質(zhì)過(guò)氧化，MDA 是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低反映了脂質(zhì)過(guò)氧化的強(qiáng)弱程度[23]。植物體在Cd 污染下會(huì)加強(qiáng)葉片的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA，提高植物細(xì)胞膜通透性[24]。本試驗(yàn)中，不同鈍化劑處理對(duì)抗氧化酶活性和MDA 含量的影響不同，nHAP 處理下菠菜CAT、POD 和SOD 活性均提高，MDA 含量降低，這與張偉等[25]的研究結(jié)果一致，可能是因?yàn)閚HAP 的應(yīng)用誘導(dǎo)了H2O2的升高，從而激活了抗氧化酶合成的代謝途徑[26]，加入nHAP后能夠有效地緩解Cd 污染對(duì)菠菜的傷害，降低MDA的含量。

分析發(fā)現(xiàn)，CAT、POD、SOD 均與pH 呈正相關(guān)，其中POD 與pH 呈顯著正相關(guān)，SOD 與pH 呈極顯著正相關(guān)，這與杜志敏等[27]的研究結(jié)果相似。首先，這可能是因?yàn)殡S著土壤pH 的增加，重金屬活性降低，減少了重金屬對(duì)土壤酶活性中心的占據(jù)及與酶分子基團(tuán)的結(jié)合，進(jìn)而降低了重金屬對(duì)酶活性基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)的破壞以及對(duì)酶催化能力及其對(duì)酶合成的抑制作用；其次，重金屬活性的降低使得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且微生物生長(zhǎng)繁殖增強(qiáng)，間接提高了土壤酶活性[28]；由于菠菜的不斷生長(zhǎng)，菠菜的根系分泌物、凋落物、腐爛根系等增多，這也間接促進(jìn)了土壤酶活性的提高。相關(guān)性分析表明，土壤有效態(tài)Cd 和土壤pH 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與武琳等[29]的研究結(jié)果一致。這可能是由于施用鈍化劑后土壤pH 升高，一方面使土壤中黏土礦物、水合氧化物和有機(jī)質(zhì)表面的負(fù)電荷增加，從而對(duì)Cd2+的吸附力增強(qiáng)，促進(jìn)了CdCO3和Cd（OH）2沉淀的生成[30]，生成的Cd沉淀也是施入生物炭使土壤碳酸鹽結(jié)合態(tài)Cd 含量升高的原因。另一方面，土壤pH 升高時(shí)H+濃度減小，從而降低了H+和Cd2+在吸附位點(diǎn)上的競(jìng)爭(zhēng)，使得土壤中的有機(jī)質(zhì)、鐵錳氧化物等與重金屬的結(jié)合更緊密[31]。

4 結(jié)論

（1）施用納米羥基磷灰石、巰基生物炭、納米羥基磷灰石+巰基生物炭均可緩解Cd脅迫對(duì)菠菜的影響，促進(jìn)菠菜生長(zhǎng)，納米羥基磷灰石+巰基生物炭的促生效果最好，納米羥基磷灰石次之。

（2）不同鈍化劑均能提高土壤pH，降低土壤有效態(tài)Cd 含量，減少菠菜地上部和地下部對(duì)Cd 的吸收；施用納米羥基磷灰石能夠增加抗氧化酶活性，降低MDA含量，修復(fù)損傷細(xì)胞膜，緩解脂膜過(guò)氧化傷害。

（3）綜上，納米羥基磷灰石在一定程度上緩解了Cd 污染對(duì)菠菜葉片細(xì)胞的傷害，增強(qiáng)了菠菜對(duì)Cd 脅迫的抵抗能力，可作為緩解Cd 污染對(duì)菠菜產(chǎn)生生理影響的鈍化劑。