孫法林,肖慧慧,侯笑林,張玉豪
(青島工學(xué)院食品工程學(xué)院,山東青島 266300)
杏鮑菇富有蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素及鈣、銅、鎂等礦物質(zhì),可增強人體免疫力,對人體具有抗癌、降血脂及美容養(yǎng)顏作用[1]。天然多糖根據(jù)來源分為微生物多糖、動物多糖和植物多糖,廣泛存在動植物體內(nèi)和微生物細胞壁中[2],其作用幾乎涉及到機體免疫系統(tǒng)的各個方面,具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎癥等多種功效[3]。獲得多糖的方法常用的有熱水提取法、酸提取法、堿提取法和酶提取法等,其中酶技術(shù)是近年來廣泛應(yīng)用的一項生物技術(shù),加速多糖的釋放或提取[4]。
杏鮑菇多糖是杏鮑菇的主要活性成分之一,具有較高的藥用價值,并且對人體有保健功能。目前,食用菌多糖的酶法提取、超聲輔助提取等技術(shù)均已有報道,但酶法和超聲輔助聯(lián)合提取杏鮑菇多糖研究報道較少。在基于超聲處理作為基礎(chǔ),采用纖維素酶法提取杏鮑菇多糖,進一步改善了提取工藝,為杏鮑菇下一步利用提供了技術(shù)支持。
1.1.1 原材料
杏鮑菇,當?shù)爻胁少彛笮迈r、無腐爛。
1.1.2 試驗試劑
葡萄糖、苯酚、濃硫酸、纖維素酶、氫氧化鈉(GB/T 629—1997)、鹽酸(GB/T 622—2006),上海埃彼化學(xué)試劑有限公司提供。
1.1.3 儀器與設(shè)備
DHG-9240A 型BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(60 目篩),上??德穬x器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;80-2 型電動離心機、HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋,上海梅香儀器有限公司產(chǎn)品;JM-B5102 型分析天平,余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;多功能粉碎機,鉑歐五金廠產(chǎn)品;722 型分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品。
1.2.1 原料預(yù)處理
選用新鮮、無蟲害的杏鮑菇,用清水洗凈,切片,60 ℃下烘干,用粉碎機將其研磨成粉末狀,過60 目篩,放于瓶中,干燥保存。
1.2.2 杏鮑菇多糖的提取
將去核的杏鮑菇置于恒溫干燥箱中,經(jīng)烘干、粉碎,過60 目篩備用。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末于錐形瓶中,pH 值6.00 條件下,以料液比1∶30(g∶mL) 加入蒸餾水,超聲提取20 min,離心過濾后取上清液。向濾液中加入0.8%的纖維素酶,在酶解溫度60 ℃,酶解時間90 min 條件下進行酶解提取。將酶解液置于沸水浴中加熱10 min 滅酶,冷卻至室溫,離心過濾,得到杏鮑菇多糖提取液,用苯酚- 硫酸法測定提取液中多糖含量。
1.2.3 杏鮑菇多糖含量的測定及計算方法
采用苯酚- 硫酸分光光度法測定多糖含量。精確稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖100 mg 于500 mL容量瓶中,加蒸餾水定容。分別量取0,0.2,0.4,0.6, 0.8,1.0 mL 標準溶液于25 mL 試管中,加蒸餾水至2.0 mL并搖勻。分別加入新配制的苯酚試劑1.0 mL,濃硫酸5 mL,搖勻。置于沸水浴中加熱20 min后于波長490 nm 處測定吸光度,以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得到標準曲線公式。
取杏鮑菇多糖提取液,按上述方法測吸光度,代入方程,求多糖含量,從而求多糖提取率。
1.2.4 單因素試驗
(1) 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末,在pH 值6.0 條件下,分別以料液比為1∶20,1∶25,1∶30,1∶35,1∶40(g∶mL) 加入蒸餾水,超聲時間20 min,離心后取上清液,加入0.8%的纖維素酶,在60 ℃條件下酶解90 min,經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖含量。
(2) pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g杏鮑菇粉末,在最佳料液比條件下,分別調(diào)節(jié)pH 值至5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,超聲時間20 min,離心后取上清液,加入0.8%的纖維素酶,在60 ℃條件下酶解90 min,經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖含量。
(3) 超聲提取時間對杏鮑菇多糖提取率的影響。準確稱取1.00 g 杏鮑菇粉末,在最佳料液比及pH 值條件下,分別以超聲時間10,15,20,25,30 min進行提取,離心后取上清液,加入0.8%的纖維素酶,于60 ℃條件下酶解90 min,經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖含量。
(4) 酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響。將超聲提取所得濾液中分別加入添加量為0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%的纖維素酶,在60 ℃條件下酶解90 min,經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖提取率。
(5) 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶,分別采用酶解溫度為50,55,60,65,70 ℃,酶解90 min。經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖含量。
(6) 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響。向超聲提取后獲得的濾液中加入最佳添加量的纖維素酶,在最佳酶解溫度條件下,分別設(shè)置酶解時間為70,80,90,100,110 min 進行酶解提取。經(jīng)滅酶、冷卻,測定多糖提取率。
1.2.5 酶解過程的正交試驗設(shè)計
正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。
表1 正交試驗因素與水平設(shè)計
根據(jù)單因素試驗結(jié)果,選擇酶添加量、酶解溫度和酶解時間三因素進行正交試驗,分別對3 個因素設(shè)計3 個水平,以多糖提取率為評價指標,設(shè)計L9(33)正交試驗,優(yōu)化杏鮑菇多糖提取工藝條件。
1.2.6 驗證試驗與傳統(tǒng)水提法的比較
準確稱取1.00 g 杏鮑菇,按照試驗得出的最佳提取工藝條件提取杏鮑菇多糖,重復(fù)3 次取平均值,并與傳統(tǒng)水提法提取杏鮑菇多糖比較提取效果。
料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖1。
圖1 料液比對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖1 可知,提取率隨著料液比的增大而慢慢增大,當料液比為1∶30 時達到最高,隨著溶劑的繼續(xù)增加,多糖的提取率變化不大。溶劑量的增加,使得超聲波介質(zhì)的液體增加,細胞內(nèi)外部濃度差距變大,多糖提取率的上升是根據(jù)多糖類物質(zhì)向外擴大的速度。當料液比達到1∶30 時,其提取量達到了極限,提取率不再提高。為了不讓隨后的工藝負荷壓力太大,提取劑的添加量不應(yīng)過多,因此多糖提取效果最好的料液比為1∶30。
pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖2。
圖2 pH 值對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖2 可知,隨著pH 值的增大,多糖提取率逐漸升高。當pH 值為6.0 時,多糖提取率最高;繼續(xù)增大pH 值,溶液酸堿性影響了酶和底物的空間結(jié)構(gòu),使得兩者的結(jié)合受到一定影響,同時加劇了杏鮑菇多糖的分解,導(dǎo)致多糖提取率的降低,因此多糖提取的最佳pH 值為6.0。
超聲時間對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖3。
圖3 超聲時間對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖3 可知,多糖提取率隨著超聲時間的延長不斷提高,20 min 時達到最大。超聲處理提高了顆粒內(nèi)部的溫度和壓力,擴散速率加快;同時,由于超聲處理使細胞壁受到破碎而孔徑增大,利于細胞內(nèi)多糖溶出;時間繼續(xù)延長,提取率呈下降趨勢,可能是由于超聲時間過長,降低了某些反應(yīng)的活化能,從而導(dǎo)致糖結(jié)構(gòu)的變化和破壞,也可能是由于蛋白質(zhì)變性沉積在顆粒表面,導(dǎo)致多糖提取率下降。因此,超聲時間控制在20 min 為宜。
酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖4。
圖4 酶添加量對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖4 可知,杏鮑菇多糖提取率會根據(jù)纖維素酶添加量的提高而上升,主要是底物與酶接觸面增大,使得酶對多糖提取效率大大提高。當纖維素酶添加量提高到0.8%時,纖維素酶與底物的接觸面積達到飽和狀態(tài),接觸面積不再擴大,杏鮑菇多糖提取率會隨著酶添加量的增加不再上升,逐漸趨于于穩(wěn)定。此時,杏鮑菇中多糖到提取率到達最高水平。因此,確定纖維素酶添加量為0.8%比較合理。
酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖5。
圖5 酶解溫度對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖5 可知,杏鮑菇多糖提取率根據(jù)酶解溫度的提高而上升,當溫度升高到60 ℃時多糖提取率最高。繼續(xù)提高酶解溫度,則會使得多糖提取率逐漸下降,因為在酶促反應(yīng)中,反應(yīng)物能量提高是根據(jù)溫度上升,加速酶的反應(yīng),若試驗溫度超過酶可接受最高溫度范圍,將會造成酶蛋白質(zhì)變性或者失去活性,直接使得多糖提取率快速下降。因此,選擇60 ℃為最適宜的酶解溫度。
酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響見圖6。
圖6 酶解時間對杏鮑菇多糖提取率的影響
由圖6 可知,杏鮑菇多糖提取率會隨著酶解時間的不斷增加而上升,當酶解時間為90 min 時,杏鮑菇多糖提取率上升且趨于穩(wěn)定;當時間到100 min時,多糖提取率達到最高水平;而在90~100 min 時多糖提取率增加并不顯著,主要是因為酶解持續(xù)時間過長,多糖在底物中含量過低,細胞內(nèi)外的濃度差逐步減小,同時也加大了雜質(zhì)在提取液中的溶解量,多糖提取率上升不明顯。隨著酶解時間的延長,多糖提取率變化不大。因此,選擇90 min 為最佳酶解時間。
正交試驗結(jié)果見表2。
表2 正交試驗結(jié)果
由表2 極差分析,試驗中3 個因素的影響力大小順序為A>C>B,對應(yīng)影響酶解杏鮑菇多糖提取率效果因素的強弱順序為酶添加量>酶解時間>酶解溫度,且杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝為A2B3C3,即酶添加量0.8%,酶解溫度65 ℃,酶解時間100 min。
由于計算出的最優(yōu)組合不包含在正交表中,因而按最優(yōu)組合配方進行試驗驗證,得出杏鮑菇多糖提取率為28.06%,因此確定A2B3C3為杏鮑菇多糖的最佳酶解工藝條件。
在不加纖維素酶及超聲的條件下,按照傳統(tǒng)水提法,即料液比1∶30,pH 值6.0,提取時間20 min,提取溫度60 ℃進行杏鮑菇多糖的提取,可得杏鮑菇多糖提取率為18.32%。由此可知,超聲輔助酶解法可以明顯提高杏鮑菇多糖的提取率,原因可能是超聲配合纖維素酶能夠破壞植物細胞壁中的纖維素結(jié)構(gòu),促進多糖從杏鮑菇細胞中溶解出來。
(1) 超聲輔助酶解法提取杏鮑菇多糖的最佳提取條件為料液比1∶30,pH 值6.0,超聲時間20 min,酶添加量0.8%,酶解時間100 min,酶解溫度66 ℃。在此工藝條件下杏鮑菇多糖提取率最高,為28.06%。
(2) 纖維素是由葡萄糖組成的大分子多糖,性質(zhì)穩(wěn)定,在傳統(tǒng)水提法的條件下不易水解。試驗采用超聲輔助纖維素酶法提取杏鮑菇多糖,能有效提高杏鮑菇多糖提取率,其多糖提取率遠高于傳統(tǒng)水提法,同時提取溫度較低,反應(yīng)條件溫和、快速、高效。