楊培周，陸書花，楊雨翰，李叢旭，王澤民

（1. 合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，農產品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230601；2. 安徽紅花食品有限公司，安徽 蚌埠 233799）

0 引言

大豆的主要成分包含約40%蛋白質、20%脂肪、碳水化合物和灰分，是人體蛋白質攝入的重要來源[1]。大豆蛋白作為植物性蛋白質，其氨基酸組成與牛奶蛋白質相近，營養(yǎng)價值與動物蛋白等同，基因結構也最接近人體氨基酸，半胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸是大豆蛋白中的營養(yǎng)限制性氨基酸[2]。大豆胰蛋白酶抑制劑在大豆中的含量較高，不利于人們吸收消化大豆蛋白。為了改變大豆蛋白的功能、營養(yǎng)和感官特性，利用蛋白酶將蛋白質水解為多肽和氨基酸是最常用且綠色的一種方式[3]。酶法改性技術是利用蛋白酶內切作用及外切作用將蛋白分子切割成小分子，使其蛋白功能特性有所改變。酶法改性具有過程溫和、無副反應、易于控制等優(yōu)點[4]。不同酶水解大豆蛋白會得到不同的多肽且具有不同的特性，蛋白酶及條件選擇是酶解的關鍵。王艷[5]通過蛋白酶輕度水解大豆蛋白，破環(huán)大豆蛋白的部分致敏表位，使其致敏性降低或消除后深度水解，獲得低致敏性肽。有研究發(fā)現與木瓜蛋白酶消化的肽相比，堿性蛋白酶制備肽過程中，表現出高α - 葡萄糖苷酶抑制活性。從Kocuria kristinae F7 中分離得到57 kDa 堿性蛋白酶處理大豆蛋白后得到4 個新的親水肽。檸檬酸作用于蛋白質時，破壞蛋白質次級鍵，形成分子量較小的蛋白肽[6]。此外，大豆含有豐富的內源蛋白酶，在經過處理后，內源蛋白酶能夠催化大豆自身蛋白形成大豆多肽[7-8]。

考查大豆粉碎打漿、檸檬酸處理和蛋白酶處理等工藝對大豆多肽形成的影響，測定大豆多肽質量濃度變化，利用蛋白電泳表征大豆蛋白種類和特征，以期為制備大豆多肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材和儀器設備

黃豆，產自北京市密云區(qū)；風味蛋白酶，河南萬邦化工科技有限公司提供；堿性蛋白酶，河南仰韶生物酶制劑有限公司提供；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；低分子量蛋白質Marker（14.4～97.4 kDa）、超低分子量蛋白Marker（3.3～20.1 kDa）、Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（P1320-25T） 和4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑），Solarbio 生物科技公司提供；氫氧化鈉、檸檬酸、甲醇等為分析純，國藥集團提供。

L18-P132 高速破壁調理機，九陽股份有限公司產品；凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司產品；UV-1201 型紫外分光光度計，北京瑞利公司產品；EPS-300 DNA 型電泳設備，上海天能科技產品；pHS-25型pH 計，大普儀器有限公司產品；HH-4 型水浴鍋，國華電器公司產品；5430R 型低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司產品。

1.2 豆?jié){的制備

稱取50 g 黃豆，蒸餾水清洗3 次后，250 mL 蒸餾水室溫下浸泡16 h。將浸泡后黃豆，豆液比按照1∶9 的比例加水后，用高速破壁調理機粉碎打漿3 min，打漿完成后，用100 目雙層尼龍布過濾，倒掉豆渣，過濾后的豆?jié){即為生豆?jié){。

1.3 大豆多肽測定

于波長238 nm處蛋白質溶液吸光度的大小與肽鍵的數量呈正比[9]。分別配制質量濃度為50～300 μg/mL的標準溶液，以蒸餾水作為空白對照，于波長238 nm處測定不同濃度的吸光度，繪制標準曲線。所得多肽標準擬合方程為Y=0.001 48X-0.059 47，R2=0.998。樣品中多肽的測定：取均質樣品2 mL 添加2 mL 10%（W/V） 三氯乙酸溶液，充分混勻后靜置15 min沉淀蛋白，以轉速3 500 r/min 離心10 min，取上清于波長238 nm 處測定樣品的吸光度，確定樣品多肽質量濃度。

1.4 粉碎打漿工藝對大豆蛋白的影響

將浸泡后的黃豆分為2 組，一組利用粉碎機進行粉碎處理，破碎后打漿。另一組直接進行打漿，打漿完成后，2 組均于室溫下孵育3 h，離心，取上清液測定所需吸光度。利用SDS-PAGE 凝膠電泳分析蛋白條帶，根據計算結果和電泳條帶分析粉碎打漿工藝對大豆蛋白的影響。

1.5 浸泡工藝對大豆多肽的影響

為了探究打漿前檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){中多肽質量濃度的影響，每組稱取大豆各50 g，用去離子水浸泡清洗2 次，瀝干水分后以豆液質量比為1∶5，使用0%，5%，10%，15%（W/W） 的檸檬酸溶液常溫條件下浸泡15 h。浸泡后使用去離子水清洗3 次后，豆液比1∶9，打漿3 min，使用100 目尼龍濾布進行過濾，去除濾渣，得到生豆?jié){。以轉速13 000 r/min離心5 min，取上層清液，用于多肽質量濃度測定和SDS-PAGE 表征蛋白水解的情況。

1.6 不同蛋白酶對大豆多肽的影響

用酪蛋白作為底物與蛋白酶反應后用三氯乙酸沉淀酶與蛋白，于波長280 nm 處利用紫外分光光度計測定，根據吸光度對木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶（食品級） 的酶活力進行計算。

1.6.1 木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響

將1.2 所制備的豆?jié){分為4 等份，按照酶和底物之比為1 200，1 600，2 000，2 400 U/g 進行酶解，分別酶解4，5，6，7，8 h 后離心，取上清測定吸光度，按照標準曲線計算出結果。所得樣品用于SDS-PAGE 凝膠電泳，根據計算結果和電泳條帶分析木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響。

1.6.2 堿性蛋白酶對大豆多肽的影響

操作步驟同1.6.2。

1.6.3 風味蛋白酶對大豆多肽的影響

操作步驟同1.6.2。

1.7 超低分子量蛋白質（3.3～20.1 kDa） 電泳

按表1 配置15.5%的分離膠及4%的濃縮膠，將30 μL 樣品和10 μL 上樣緩沖液混合后，于100 ℃下水浴加熱3 min，冷卻后以轉速13 000 r/min 離心3 min 后上樣電泳。電泳時，電泳槽放入4 ℃或冰水浴中，外槽加入陽極緩沖液，內槽加入陰極緩沖液，30 V 預電泳10 min，將樣品加入點樣孔后30 V 電泳1 h，100 V 電泳至溴酚藍到達膠底部后停止電泳，考馬斯亮藍染色。由于超低分子量多肽（3 000 Da及以下） 極易從凝膠上浸出，因此染色及脫色時間不宜太長。

表1 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備

Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備見表1。

2 結果與分析

2.1 粉碎打漿對大豆多肽的影響

粉碎打漿與未粉碎打漿組SDS-PAGE 電泳圖見圖1。

圖1 粉碎打漿與未粉碎打漿組SDS-PAGE 電泳圖

由圖1 可知，43 kDa 以上的電泳條帶幾乎一樣，說明粉碎工藝對此分子量及之上蛋白質的分解效果很小。31～43 kDa 分子量之間的電泳條帶看，粉碎后再打漿的豆?jié){電泳條帶明顯變淡，說明粉碎后此分子量間的蛋白部分分解。22 kDa 分子量附近經粉碎后的豆?jié){的電泳條帶也明顯變淡。粉碎打漿工藝對分子量在22～43 kDa 之間的蛋白有較強的分解效果。另外，根據對粉碎黃豆與未粉碎黃豆的蛋白質含量，粉碎后所得的豆?jié){蛋白質含量明顯低于未粉碎豆?jié){所得黃豆，故粉碎工藝有助于大豆中蛋白的分解，導致大豆中多肽的增加。粉碎打漿后大豆多肽質量濃度為950 μg/mL，含量較低。

2.2 檸檬酸浸泡對大豆多肽的影響

檸檬酸浸泡對大豆多肽質量濃度的影響見圖2。

圖2 檸檬酸浸泡對大豆多肽質量濃度的影響

由圖2 可知，當檸檬酸添加量為5%時，豆?jié){中多肽質量濃度最高，達到1 519.56 μg/mL。當添加量大于5%，隨著檸檬酸添加量的提高，多肽質量濃度逐漸降低?？赡苡捎谶^低的pH 值使大豆蛋白變性或促使大豆中的內源性肽酶失活無法分解大豆蛋白。

檸檬酸浸泡處理組SDS-PAGE 電泳圖見圖3。

圖3 檸檬酸浸泡處理組SDS-PAGE 電泳圖

由圖3 可知，未添加檸檬酸處理的樣品組含有較復雜的蛋白條帶，濃度最高的蛋白分子量主要集中在66，43，31，22 kDa 附近。當檸檬酸添加量為5%時，豆?jié){體系中蛋白質幾乎完全被分解，僅在50 kDa 和小于22 kDa 處有較淺的蛋白條帶。這與多肽含量變化保持一致。當檸檬酸添加量達到10%時，分子量為97 kDa 和60 kDa 左右的大分子蛋白水解效果較差，但其他大于22 kDa 的蛋白均被水解。與5%相比，97.4 kDa 附近的條帶出現；當檸檬酸添加量達到15%時，43～90 kDa 的范圍中，出現較多的蛋白條帶，與10%處理組相比條帶更清晰，說明檸檬酸濃度過高導致的大豆內源性蛋白酶失活無法水解大豆蛋白。因此，選擇5%的檸檬酸浸泡大豆，使后續(xù)豆?jié){體系中大分子蛋白充分水解為多肽和氨基酸。

2.3 不同蛋白酶對大豆多肽的影響

2.3.1 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響見圖4。

圖4 木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖4 可知，隨著酶解時間增加，豆?jié){中多肽質量濃度均增加。酶解4 h，用量為2 400 U/g 組的多肽質量濃度高于其他組，隨著酶解時間的延長，多肽增長速率降低。酶解8 h 后，經過2 000 U/g 木瓜蛋白酶處理組的多肽質量濃度為1 538.36 μg/mL。

2.3.2 堿性蛋白酶

堿性蛋白酶對大豆多肽的影響見圖5。

圖5 堿性蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖5 可知，隨著蛋白酶用量的增加，多肽質量濃度逐漸增多。同時，隨著酶解時間延長，多肽質量濃度增加。酶解8 h，1 200，1 600，2 000，2 400 U/g堿性蛋白酶處理組的多肽質量濃度分別為1 309.79，1 319.79，1 384.08，1 455.5 μg/mL。

2.3.3 風味蛋白酶

風味蛋白酶對大豆多肽的影響見圖6。

圖6 風味蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖6 可知，多肽質量濃度隨著酶解時間增加而增加，不同用量處理組的多肽質量濃度具有明顯差異，當用量為2 400 U/g 時，豆?jié){中的多肽質量濃度為1 468.36 μg/mL，此數據稍低于2 000 U/g組（1 483.36 μg/mL），2 000 U/g 為風味蛋白酶較為合適的添加量。

2.4 不同蛋白酶的SDS-PAGE 圖譜分析

不同蛋白酶處理組的SDS-PAGE 電泳圖見圖7。

圖7 不同蛋白酶處理組的SDS-PAGE 電泳圖

從電泳條帶1，2，3 和4 可以看出，隨著木瓜蛋白酶的用量增加，分子量31～66.2 kDa 的電泳條帶顏色逐漸加深，木瓜蛋白酶可以將部分降解大分子蛋白；而分子量在22 kDa 之間的條帶顏色變深，可能是木瓜蛋白酶本身分子量在23 kDa 之間，由于加酶量的增加，導致電泳條帶22 kDa 左右的顏色加深。

電泳條帶5，6，7 和8 表明隨著堿性蛋白酶添加量的增加，電泳條帶顏色逐漸明顯變淺，在加酶量為1 200 U/g 時，可檢測到66.2～97.4 kDa 的電泳條帶，而酶用量達到1 600 U/g 時，這部分條帶明顯變淡，繼續(xù)增加酶量，條帶消失。分子量在43～66.2 kDa的條帶同樣隨著加酶量的增加而逐漸減少，加酶量為2 400 U/g 時，條帶消失。分子量為14.4～43 kDa的條帶無明顯變化。堿性蛋白酶對大豆分子量較大的蛋白水解情況較好。

從電泳條帶9，10，11 和12 可以看出，隨著風味蛋白酶用量的增加，大于43 kDa 的蛋白條帶逐漸變淡，當風味蛋白酶添加量達到2 000 U/g 時，大于66.2 kDa 的蛋白條帶消失被完全水解。同時，加酶量的變化對低于43 kDa 的蛋白條帶無影響。說明風味蛋白酶作用于分子量較大的部分大豆蛋白。

2.5 不同蛋白酶的Tricine-SDS-PAGE 圖譜分析

不同蛋白酶處理組的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖見圖8。

圖8 不同蛋白酶處理組的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖

木瓜蛋白酶處理組小分子蛋白種類較多，集中于14.4～20.1 kDa，此外隨著木瓜蛋白酶用量的增加，大于20.1 kDa 的蛋白條帶逐漸變淺。與木瓜蛋白酶相比，堿性蛋白酶對小分子蛋白的水解程度更深，條帶較少且顏色較淡，僅在20.1 kDa 附近電泳條帶較為清楚，而其他條帶多集中在分子量為7.8 kDa 以下，可確定其多為多肽。此外，不同風味蛋白酶添加量的樣品之間的電泳條帶無明顯差別。綜上所述，堿性蛋白酶可以較高效率將大豆蛋白水解為多肽和氨基酸。

3 結論

比較不同處理工藝對大豆多肽形成的影響，結果表明，檸檬酸具有一定的水解大豆蛋白的能力，堿性蛋白酶水解大豆蛋白大小分布于43.0～66.2 kDa；粉碎打漿工藝對大豆蛋白分子量22～43 kDa 有較強分解效果，但對大豆多肽生成作用較小。2 000 U/g 堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶酶解大豆蛋白8 h 后，豆?jié){中大豆多肽質量濃度分別為1 384.08，1 538.36，1 483.36 μg/mL。制備大豆多肽工藝效率大小依次為木瓜蛋白酶、檸檬酸添加量、風味蛋白酶、堿性蛋白酶和粉碎打漿處理。