楊培周，陸書花，楊雨翰，李叢旭，王澤民

（1. 合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點實驗室，安徽合肥 230601；2. 安徽紅花食品有限公司，安徽 蚌埠 233799）

0 引言

大豆的主要成分包含約40%蛋白質(zhì)、20%脂肪、碳水化合物和灰分，是人體蛋白質(zhì)攝入的重要來源[1]。大豆蛋白作為植物性蛋白質(zhì)，其氨基酸組成與牛奶蛋白質(zhì)相近，營養(yǎng)價值與動物蛋白等同，基因結(jié)構也最接近人體氨基酸，半胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸是大豆蛋白中的營養(yǎng)限制性氨基酸[2]。大豆胰蛋白酶抑制劑在大豆中的含量較高，不利于人們吸收消化大豆蛋白。為了改變大豆蛋白的功能、營養(yǎng)和感官特性，利用蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為多肽和氨基酸是最常用且綠色的一種方式[3]。酶法改性技術是利用蛋白酶內(nèi)切作用及外切作用將蛋白分子切割成小分子，使其蛋白功能特性有所改變。酶法改性具有過程溫和、無副反應、易于控制等優(yōu)點[4]。不同酶水解大豆蛋白會得到不同的多肽且具有不同的特性，蛋白酶及條件選擇是酶解的關鍵。王艷[5]通過蛋白酶輕度水解大豆蛋白，破環(huán)大豆蛋白的部分致敏表位，使其致敏性降低或消除后深度水解，獲得低致敏性肽。有研究發(fā)現(xiàn)與木瓜蛋白酶消化的肽相比，堿性蛋白酶制備肽過程中，表現(xiàn)出高α - 葡萄糖苷酶抑制活性。從Kocuria kristinae F7 中分離得到57 kDa 堿性蛋白酶處理大豆蛋白后得到4 個新的親水肽。檸檬酸作用于蛋白質(zhì)時，破壞蛋白質(zhì)次級鍵，形成分子量較小的蛋白肽[6]。此外，大豆含有豐富的內(nèi)源蛋白酶，在經(jīng)過處理后，內(nèi)源蛋白酶能夠催化大豆自身蛋白形成大豆多肽[7-8]。

考查大豆粉碎打漿、檸檬酸處理和蛋白酶處理等工藝對大豆多肽形成的影響，測定大豆多肽質(zhì)量濃度變化，利用蛋白電泳表征大豆蛋白種類和特征，以期為制備大豆多肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑耗材和儀器設備

黃豆，產(chǎn)自北京市密云區(qū)；風味蛋白酶，河南萬邦化工科技有限公司提供；堿性蛋白酶，河南仰韶生物酶制劑有限公司提供；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kDa）、超低分子量蛋白Marker（3.3～20.1 kDa）、Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（P1320-25T） 和4×蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑），Solarbio 生物科技公司提供；氫氧化鈉、檸檬酸、甲醇等為分析純，國藥集團提供。

L18-P132 高速破壁調(diào)理機，九陽股份有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；UV-1201 型紫外分光光度計，北京瑞利公司產(chǎn)品；EPS-300 DNA 型電泳設備，上海天能科技產(chǎn)品；pHS-25型pH 計，大普儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型水浴鍋，國華電器公司產(chǎn)品；5430R 型低溫高速離心機，德國Eppendorf 公司產(chǎn)品。

1.2 豆?jié){的制備

稱取50 g 黃豆，蒸餾水清洗3 次后，250 mL 蒸餾水室溫下浸泡16 h。將浸泡后黃豆，豆液比按照1∶9 的比例加水后，用高速破壁調(diào)理機粉碎打漿3 min，打漿完成后，用100 目雙層尼龍布過濾，倒掉豆渣，過濾后的豆?jié){即為生豆?jié){。

1.3 大豆多肽測定

于波長238 nm處蛋白質(zhì)溶液吸光度的大小與肽鍵的數(shù)量呈正比[9]。分別配制質(zhì)量濃度為50～300 μg/mL的標準溶液，以蒸餾水作為空白對照，于波長238 nm處測定不同濃度的吸光度，繪制標準曲線。所得多肽標準擬合方程為Y=0.001 48X-0.059 47，R2=0.998。樣品中多肽的測定：取均質(zhì)樣品2 mL 添加2 mL 10%（W/V） 三氯乙酸溶液，充分混勻后靜置15 min沉淀蛋白，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min 離心10 min，取上清于波長238 nm 處測定樣品的吸光度，確定樣品多肽質(zhì)量濃度。

1.4 粉碎打漿工藝對大豆蛋白的影響

將浸泡后的黃豆分為2 組，一組利用粉碎機進行粉碎處理，破碎后打漿。另一組直接進行打漿，打漿完成后，2 組均于室溫下孵育3 h，離心，取上清液測定所需吸光度。利用SDS-PAGE 凝膠電泳分析蛋白條帶，根據(jù)計算結(jié)果和電泳條帶分析粉碎打漿工藝對大豆蛋白的影響。

1.5 浸泡工藝對大豆多肽的影響

為了探究打漿前檸檬酸浸泡大豆對豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度的影響，每組稱取大豆各50 g，用去離子水浸泡清洗2 次，瀝干水分后以豆液質(zhì)量比為1∶5，使用0%，5%，10%，15%（W/W） 的檸檬酸溶液常溫條件下浸泡15 h。浸泡后使用去離子水清洗3 次后，豆液比1∶9，打漿3 min，使用100 目尼龍濾布進行過濾，去除濾渣，得到生豆?jié){。以轉(zhuǎn)速13 000 r/min離心5 min，取上層清液，用于多肽質(zhì)量濃度測定和SDS-PAGE 表征蛋白水解的情況。

1.6 不同蛋白酶對大豆多肽的影響

用酪蛋白作為底物與蛋白酶反應后用三氯乙酸沉淀酶與蛋白，于波長280 nm 處利用紫外分光光度計測定，根據(jù)吸光度對木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶（食品級） 的酶活力進行計算。

1.6.1 木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響

將1.2 所制備的豆?jié){分為4 等份，按照酶和底物之比為1 200，1 600，2 000，2 400 U/g 進行酶解，分別酶解4，5，6，7，8 h 后離心，取上清測定吸光度，按照標準曲線計算出結(jié)果。所得樣品用于SDS-PAGE 凝膠電泳，根據(jù)計算結(jié)果和電泳條帶分析木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響。

1.6.2 堿性蛋白酶對大豆多肽的影響

操作步驟同1.6.2。

1.6.3 風味蛋白酶對大豆多肽的影響

操作步驟同1.6.2。

1.7 超低分子量蛋白質(zhì)（3.3～20.1 kDa） 電泳

按表1 配置15.5%的分離膠及4%的濃縮膠，將30 μL 樣品和10 μL 上樣緩沖液混合后，于100 ℃下水浴加熱3 min，冷卻后以轉(zhuǎn)速13 000 r/min 離心3 min 后上樣電泳。電泳時，電泳槽放入4 ℃或冰水浴中，外槽加入陽極緩沖液，內(nèi)槽加入陰極緩沖液，30 V 預電泳10 min，將樣品加入點樣孔后30 V 電泳1 h，100 V 電泳至溴酚藍到達膠底部后停止電泳，考馬斯亮藍染色。由于超低分子量多肽（3 000 Da及以下） 極易從凝膠上浸出，因此染色及脫色時間不宜太長。

表1 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備

Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝膠制備見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 粉碎打漿對大豆多肽的影響

粉碎打漿與未粉碎打漿組SDS-PAGE 電泳圖見圖1。

圖1 粉碎打漿與未粉碎打漿組SDS-PAGE 電泳圖

由圖1 可知，43 kDa 以上的電泳條帶幾乎一樣，說明粉碎工藝對此分子量及之上蛋白質(zhì)的分解效果很小。31～43 kDa 分子量之間的電泳條帶看，粉碎后再打漿的豆?jié){電泳條帶明顯變淡，說明粉碎后此分子量間的蛋白部分分解。22 kDa 分子量附近經(jīng)粉碎后的豆?jié){的電泳條帶也明顯變淡。粉碎打漿工藝對分子量在22～43 kDa 之間的蛋白有較強的分解效果。另外，根據(jù)對粉碎黃豆與未粉碎黃豆的蛋白質(zhì)含量，粉碎后所得的豆?jié){蛋白質(zhì)含量明顯低于未粉碎豆?jié){所得黃豆，故粉碎工藝有助于大豆中蛋白的分解，導致大豆中多肽的增加。粉碎打漿后大豆多肽質(zhì)量濃度為950 μg/mL，含量較低。

2.2 檸檬酸浸泡對大豆多肽的影響

檸檬酸浸泡對大豆多肽質(zhì)量濃度的影響見圖2。

圖2 檸檬酸浸泡對大豆多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖2 可知，當檸檬酸添加量為5%時，豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度最高，達到1 519.56 μg/mL。當添加量大于5%，隨著檸檬酸添加量的提高，多肽質(zhì)量濃度逐漸降低?？赡苡捎谶^低的pH 值使大豆蛋白變性或促使大豆中的內(nèi)源性肽酶失活無法分解大豆蛋白。

檸檬酸浸泡處理組SDS-PAGE 電泳圖見圖3。

圖3 檸檬酸浸泡處理組SDS-PAGE 電泳圖

由圖3 可知，未添加檸檬酸處理的樣品組含有較復雜的蛋白條帶，濃度最高的蛋白分子量主要集中在66，43，31，22 kDa 附近。當檸檬酸添加量為5%時，豆?jié){體系中蛋白質(zhì)幾乎完全被分解，僅在50 kDa 和小于22 kDa 處有較淺的蛋白條帶。這與多肽含量變化保持一致。當檸檬酸添加量達到10%時，分子量為97 kDa 和60 kDa 左右的大分子蛋白水解效果較差，但其他大于22 kDa 的蛋白均被水解。與5%相比，97.4 kDa 附近的條帶出現(xiàn)；當檸檬酸添加量達到15%時，43～90 kDa 的范圍中，出現(xiàn)較多的蛋白條帶，與10%處理組相比條帶更清晰，說明檸檬酸濃度過高導致的大豆內(nèi)源性蛋白酶失活無法水解大豆蛋白。因此，選擇5%的檸檬酸浸泡大豆，使后續(xù)豆?jié){體系中大分子蛋白充分水解為多肽和氨基酸。

2.3 不同蛋白酶對大豆多肽的影響

2.3.1 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響見圖4。

圖4 木瓜蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖4 可知，隨著酶解時間增加，豆?jié){中多肽質(zhì)量濃度均增加。酶解4 h，用量為2 400 U/g 組的多肽質(zhì)量濃度高于其他組，隨著酶解時間的延長，多肽增長速率降低。酶解8 h 后，經(jīng)過2 000 U/g 木瓜蛋白酶處理組的多肽質(zhì)量濃度為1 538.36 μg/mL。

2.3.2 堿性蛋白酶

堿性蛋白酶對大豆多肽的影響見圖5。

圖5 堿性蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖5 可知，隨著蛋白酶用量的增加，多肽質(zhì)量濃度逐漸增多。同時，隨著酶解時間延長，多肽質(zhì)量濃度增加。酶解8 h，1 200，1 600，2 000，2 400 U/g堿性蛋白酶處理組的多肽質(zhì)量濃度分別為1 309.79，1 319.79，1 384.08，1 455.5 μg/mL。

2.3.3 風味蛋白酶

風味蛋白酶對大豆多肽的影響見圖6。

圖6 風味蛋白酶對大豆多肽的影響

由圖6 可知，多肽質(zhì)量濃度隨著酶解時間增加而增加，不同用量處理組的多肽質(zhì)量濃度具有明顯差異，當用量為2 400 U/g 時，豆?jié){中的多肽質(zhì)量濃度為1 468.36 μg/mL，此數(shù)據(jù)稍低于2 000 U/g組（1 483.36 μg/mL），2 000 U/g 為風味蛋白酶較為合適的添加量。

2.4 不同蛋白酶的SDS-PAGE 圖譜分析

不同蛋白酶處理組的SDS-PAGE 電泳圖見圖7。

圖7 不同蛋白酶處理組的SDS-PAGE 電泳圖

從電泳條帶1，2，3 和4 可以看出，隨著木瓜蛋白酶的用量增加，分子量31～66.2 kDa 的電泳條帶顏色逐漸加深，木瓜蛋白酶可以將部分降解大分子蛋白；而分子量在22 kDa 之間的條帶顏色變深，可能是木瓜蛋白酶本身分子量在23 kDa 之間，由于加酶量的增加，導致電泳條帶22 kDa 左右的顏色加深。

電泳條帶5，6，7 和8 表明隨著堿性蛋白酶添加量的增加，電泳條帶顏色逐漸明顯變淺，在加酶量為1 200 U/g 時，可檢測到66.2～97.4 kDa 的電泳條帶，而酶用量達到1 600 U/g 時，這部分條帶明顯變淡，繼續(xù)增加酶量，條帶消失。分子量在43～66.2 kDa的條帶同樣隨著加酶量的增加而逐漸減少，加酶量為2 400 U/g 時，條帶消失。分子量為14.4～43 kDa的條帶無明顯變化。堿性蛋白酶對大豆分子量較大的蛋白水解情況較好。

從電泳條帶9，10，11 和12 可以看出，隨著風味蛋白酶用量的增加，大于43 kDa 的蛋白條帶逐漸變淡，當風味蛋白酶添加量達到2 000 U/g 時，大于66.2 kDa 的蛋白條帶消失被完全水解。同時，加酶量的變化對低于43 kDa 的蛋白條帶無影響。說明風味蛋白酶作用于分子量較大的部分大豆蛋白。

2.5 不同蛋白酶的Tricine-SDS-PAGE 圖譜分析

不同蛋白酶處理組的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖見圖8。

圖8 不同蛋白酶處理組的Tricine-SDS-PAGE 電泳圖

木瓜蛋白酶處理組小分子蛋白種類較多，集中于14.4～20.1 kDa，此外隨著木瓜蛋白酶用量的增加，大于20.1 kDa 的蛋白條帶逐漸變淺。與木瓜蛋白酶相比，堿性蛋白酶對小分子蛋白的水解程度更深，條帶較少且顏色較淡，僅在20.1 kDa 附近電泳條帶較為清楚，而其他條帶多集中在分子量為7.8 kDa 以下，可確定其多為多肽。此外，不同風味蛋白酶添加量的樣品之間的電泳條帶無明顯差別。綜上所述，堿性蛋白酶可以較高效率將大豆蛋白水解為多肽和氨基酸。

3 結(jié)論

比較不同處理工藝對大豆多肽形成的影響，結(jié)果表明，檸檬酸具有一定的水解大豆蛋白的能力，堿性蛋白酶水解大豆蛋白大小分布于43.0～66.2 kDa；粉碎打漿工藝對大豆蛋白分子量22～43 kDa 有較強分解效果，但對大豆多肽生成作用較小。2 000 U/g 堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶酶解大豆蛋白8 h 后，豆?jié){中大豆多肽質(zhì)量濃度分別為1 384.08，1 538.36，1 483.36 μg/mL。制備大豆多肽工藝效率大小依次為木瓜蛋白酶、檸檬酸添加量、風味蛋白酶、堿性蛋白酶和粉碎打漿處理。