董壽堂，任 遠(yuǎn)，張旭強(qiáng)，王懷斌，魯 靜，胡 燕

（保山中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，云南 保山 678000）

紫皮石斛為蘭科石斛屬植物齒瓣石斛（Dendrobium devoninum Paxt.），又名紫草、香棍草、紫皮蘭、水打棒、中黃草、旱馬棒等，其性微寒、味甘，歸胃、腎經(jīng)，具有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱之功效[1-2]，主要分布在我國(guó)的云南、貴州、廣西及西藏等，其中在云南龍陵有大量的人工種植，且品質(zhì)好，故該縣于2011 年11 月被中國(guó)中藥協(xié)會(huì)授予“中國(guó)紫皮石斛之鄉(xiāng)”稱(chēng)號(hào)，2012 年獲得了國(guó)家工商行政管理總局頒發(fā)的《地理標(biāo)志證明商標(biāo)注冊(cè)》證書(shū)。研究發(fā)現(xiàn)，紫皮石斛莖中含有氨基酸、多糖、酰胺類(lèi)、苯丙素類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、二氫菲類(lèi)、酚酸類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)及木脂素類(lèi)等多種化學(xué)物質(zhì)[3-6]，具有抗疲勞[7]、增強(qiáng)免疫[8]、抗氧化[9]及抗菌[10]等作用，且長(zhǎng)期食用無(wú)明顯副作用[11]，未見(jiàn)胚胎毒性及致畸毒性[12]、遺傳毒性[13]，屬于無(wú)毒級(jí)物質(zhì)[3，13]。由于對(duì)紫皮石斛花研究較少，而限制了其開(kāi)發(fā)利用。紫皮石斛花在民間人們常常用來(lái)泡水、泡酒、榨汁、煮粥及煲湯等食用，認(rèn)為其具有滋陰潤(rùn)肺、美容養(yǎng)顏、安神解郁及養(yǎng)胃生津的功效，受到越來(lái)越多人的喜愛(ài)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，紫皮石斛花中含有多糖、多酚、多種氨基酸、粗蛋白質(zhì)、類(lèi)黃酮、多種礦物質(zhì)及揮發(fā)性成分等[14-15]，并證實(shí)了紫皮石斛花乙醇提取物、多糖及氨基酸具有較好的體外抗氧化作用[16-17]。但紫皮石斛花總黃酮提取工藝及功效的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黃酮類(lèi)化合物普遍存在于各種植物中，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[18]，有著廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。因此，通過(guò)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取工藝及作用的研究，可為保健品、藥品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，從而提高紫皮石斛花開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

以紫皮石斛花為原料，采用超聲波法提取總黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化紫皮石斛花總黃酮提取工藝條件，并探討紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子、DPPH 自由基及羥自由基的清除作用，為紫皮石斛花下一步的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

YF-150 型高速中藥粉碎機(jī)，浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司產(chǎn)品；SQP 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司產(chǎn)品；1524 型臺(tái)式普通離心機(jī)，丹麥Labogene 公司產(chǎn)品；SHA-2 型冷凍水浴恒溫振蕩器，金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；SB-800DTD 型超聲清洗儀，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司產(chǎn)品；UV-1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；Elx808 型酶標(biāo)儀，美國(guó)佰騰儀器有限公司產(chǎn)品。

紫皮石斛花，云南省保山市龍陵天和土特產(chǎn)商貿(mào)發(fā)展有限公司提供；L- 抗壞血酸（分析純），上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司提供；總黃酮試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、DPPH 自由基清除能力試劑盒，蘇州格銳思生物科技有限公司提供；無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取

取干燥紫皮石斛花適量，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，粉碎、過(guò)60 目篩。稱(chēng)取紫皮石斛花粉末0.03 g，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，浸泡12 h，于一定溫度，800 W 超聲波下提取一定的時(shí)間，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min，取上清液，用60%乙醇定容至1.5 mL，備用。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

按照“總黃酮試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法，采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。根據(jù)說(shuō)明書(shū)中回歸方程Y=1.627 7X-0.004 9（R2=0.999 9），計(jì)算紫皮石斛花總黃酮質(zhì)量濃度，依據(jù)公式（1） 得出總黃酮提取率。

式中：C——回歸方程中得出的紫皮石斛花總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——提取液定容后體積，mL；

W——樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1） 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL），分別加40%，50%，60%，70%，80%乙醇，在溫度60 ℃下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（2） 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末，分別以料液比為1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，于60 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（3） 提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加60%乙醇，并分別于40，50，60，70，80 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min，考查不同提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

（4） 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末，以料液比1∶50（g∶mL） 加入60%乙醇，并在溫度60 ℃下以800 W功率超聲分別提取20，25，30，35，40 min，考查不同提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別確定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C） 及提取時(shí)間（D）四因素的3 個(gè)水平。利用Design Expert 8.0.6 軟件中Box-behnken 方法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案，以紫皮石斛花總黃酮提取率（Y） 為響應(yīng)值，確定紫皮石斛花總黃酮提取的最佳工藝。

Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 體外抗氧化試驗(yàn)

1.4.1 溶液制備

（1） 紫皮石斛花總黃酮溶液的配制。稱(chēng)取1.20 g紫皮石斛花粉末，按照最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，并根據(jù)2.3.2 中方法測(cè)定其含量，然后用蒸餾水將其配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（2） L- 抗壞血酸溶液的配制。稱(chēng)取L- 抗壞血酸100 mg，用適量的蒸餾水溶解，并定容至100 mL，再用蒸餾水配制成0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mg/mL 溶液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 清除超氧陰離子能力的測(cè)定

按照“超氧陰離子清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法，分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式（2） 計(jì)算超氧陰離子清除率。

式中：A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度；

A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.3 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

按照“1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法，分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式（3） 計(jì)算DPPH 自由基清除率。

式中：A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度；

A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.4.4 清除羥自由基能力的測(cè)定

按照“羥自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法，分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L- 抗壞血酸溶液的吸光度，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式

（4） 計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度；

A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度；

A空白——空白管的吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行測(cè)定3 次所得，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用Excel、Design Expert 8.0.6、Sigma Plot 10.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，紫皮石斛花總黃酮提取率先增加后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，總黃酮提取率最大。而乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%后，總黃酮提取率反而下降，其可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，降低了總黃酮類(lèi)溶解性，并增加了其他醇溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致總黃酮提取率降低[19]。因此，選擇50%～70%乙醇優(yōu)化提取工藝。

2.1.2 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖2 可知，隨著料液比增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶35（g∶mL）時(shí)，總黃酮提取率為最高，而料液比超過(guò)1∶35（g∶mL） 后，總黃酮提取率逐漸降低，可能是料液比的提高，增加了其他雜質(zhì)溶出，從而降低了總黃酮提取率[19]。因此，選擇1∶35～1∶45（g∶mL） 料液比優(yōu)化提取工藝。

2.1.3 提取溫度對(duì)紫皮石斛花黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖3 可知，隨溫度增加，總黃酮提取率先增后降，當(dāng)溫度為70 ℃時(shí)，提取率最高，而溫度超過(guò)70 ℃，提取率有所下降，其可能是由于溫度的提高，破壞了部分黃酮，導(dǎo)致總黃酮提取率降低[19]。因此，選擇60～80 ℃提取溫度優(yōu)化提取工藝。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

由圖4 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率先增加后降低，當(dāng)提取時(shí)間為25 min 時(shí)，提取率達(dá)到最大值，而提取時(shí)間超過(guò)25 min，總黃酮提取率不斷降低，其可能是提取時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致部分黃酮被破壞[19]。因此，選擇20～30 min 提取時(shí)間優(yōu)化提取工藝。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以A、B、C、D 4 個(gè)因素為自變量，響應(yīng)值為Y，利用Box-behnken 試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型方差分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到紫皮石斛花總黃酮提取率對(duì)自變量的二元多項(xiàng)回歸方程為：

Y=2.56-0.24A-0.047B+0.100C+0.033D-0.023AB+0.045AC-0.020AD-0.025BC-0.068BD+0.030CD-0.028A2+0.24B2+0.13D2+0.11D2。

回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析

由表3 可知，回歸模型具有顯著性（p＜0.05），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），模型回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.723 5，說(shuō)明該模型回歸方程擬合度好，具有較好的準(zhǔn)確性及可信度。A、B2具有極顯著性（p＜0.01），提示乙醇體積分?jǐn)?shù)及二次項(xiàng)料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率影響極顯著。由表中F 值可知，影響紫皮石斛花總黃酮提取率的因素順序?yàn)锳＞C＞B＞D。

2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖5，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖6，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖7，料液比與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖8，料液比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖9，提取溫度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖10。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

圖8 料液比與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

圖9 料液比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

圖10 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

響應(yīng)面分析圖中響應(yīng)面坡度、等高線(xiàn)密集度及形狀可反映兩因素交互作用是否顯著。響應(yīng)面坡度越大，等高線(xiàn)越密集并呈橢圓形，說(shuō)明兩因素交互作用顯著；反之，響應(yīng)面坡度越小，等高線(xiàn)越稀疏并呈圓形，說(shuō)明兩因素交互作用不顯著[27-30]。因此，由圖5 ～圖10 可知，各圖的響應(yīng)面坡度小，等高線(xiàn)不密集并呈橢圓形，提示AB、AC、AD、BC、BD及CD 因素交互作用不顯著。

2.2.4 最佳提取工藝預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過(guò)二元多項(xiàng)回歸方程可預(yù)測(cè)得到紫皮石斛花總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.17%，料液比1∶35.14（g∶mL），提取溫度69.97 ℃，提取時(shí)間29.00 min，在此條件下總黃酮提取率可達(dá)3.41%，為了試驗(yàn)的可操作性，將以上的最佳工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶35（g∶mL），提取溫度70 ℃，提取時(shí)間29 min，在該條件下平行重復(fù)3 次試驗(yàn)，得到總黃酮提取率為3.54%±0.013%，接近于預(yù)測(cè)值，說(shuō)明二元多項(xiàng)回歸方程模型擬合度較好，可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。

2.3 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用見(jiàn)圖11。

圖11 紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

由圖11 可知，在質(zhì)量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)超氧陰離子清除率存在量效關(guān)系，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最大，分別為61.41%，86.80%，對(duì)超氧陰離子的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（Half inhibitory concentration，IC50） 分別為0.32，0.08 mg/mL，說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較好的清除超氧陰離子能力，但要比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

2.3.2 紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用見(jiàn)圖12。

圖12 紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用

由圖12 可知，在質(zhì)量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基清除率存在量效關(guān)系，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最大，分別為86.70%，89.28%，對(duì)DPPH 自由基的IC50分別為0.17，0.003 mg/mL，說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力，但不及L - 抗壞血酸。

2.3.3 紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用見(jiàn)圖13。

圖13 紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

由圖13 可知，在質(zhì)量濃度0～0.8 mg/mL 范圍內(nèi)，紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)羥自由基清除率存在量效關(guān)系，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到最大，分別為31.50%，86.39%，對(duì)羥自由基清除率的IC50分別為0.42，0.18 mg/mL，說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有一定的清除羥自由基能力，但比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶35（g∶mL），提取溫度70 ℃，提取時(shí)間29 min，在此條件下，紫皮石斛花總黃酮平均提取率為3.54%，與預(yù)測(cè)值3.41%接近，提示該提取工藝可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0～0.8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，紫皮石斛花總黃酮的抗氧化作用存在量效關(guān)系，其對(duì)超氧陰離子、DPPH 自由基、羥自由基最大清除率分別為61.41%，86.70%，31.50%，IC50分別為0.32，0.17，0.42 mg/mL，說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較好的抗氧化作用。該研究可為紫皮石斛花總黃酮的提取及其相關(guān)保健品、藥品等方面的研究開(kāi)發(fā)提供參考。