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        紫皮石斛花總黃酮提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

        2023-06-21 06:06:40董壽堂張旭強(qiáng)王懷斌
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2023年9期
        關(guān)鍵詞:黃酮

        董壽堂,任 遠(yuǎn),張旭強(qiáng),王懷斌,魯 靜,胡 燕

        (保山中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校,云南 保山 678000)

        紫皮石斛為蘭科石斛屬植物齒瓣石斛(Dendrobium devoninum Paxt.),又名紫草、香棍草、紫皮蘭、水打棒、中黃草、旱馬棒等,其性微寒、味甘,歸胃、腎經(jīng),具有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱之功效[1-2],主要分布在我國(guó)的云南、貴州、廣西及西藏等,其中在云南龍陵有大量的人工種植,且品質(zhì)好,故該縣于2011 年11 月被中國(guó)中藥協(xié)會(huì)授予“中國(guó)紫皮石斛之鄉(xiāng)”稱(chēng)號(hào),2012 年獲得了國(guó)家工商行政管理總局頒發(fā)的《地理標(biāo)志證明商標(biāo)注冊(cè)》證書(shū)。研究發(fā)現(xiàn),紫皮石斛莖中含有氨基酸、多糖、酰胺類(lèi)、苯丙素類(lèi)、聯(lián)芐類(lèi)、二氫菲類(lèi)、酚酸類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)、甾醇類(lèi)及木脂素類(lèi)等多種化學(xué)物質(zhì)[3-6],具有抗疲勞[7]、增強(qiáng)免疫[8]、抗氧化[9]及抗菌[10]等作用,且長(zhǎng)期食用無(wú)明顯副作用[11],未見(jiàn)胚胎毒性及致畸毒性[12]、遺傳毒性[13],屬于無(wú)毒級(jí)物質(zhì)[3,13]。由于對(duì)紫皮石斛花研究較少,而限制了其開(kāi)發(fā)利用。紫皮石斛花在民間人們常常用來(lái)泡水、泡酒、榨汁、煮粥及煲湯等食用,認(rèn)為其具有滋陰潤(rùn)肺、美容養(yǎng)顏、安神解郁及養(yǎng)胃生津的功效,受到越來(lái)越多人的喜愛(ài)?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),紫皮石斛花中含有多糖、多酚、多種氨基酸、粗蛋白質(zhì)、類(lèi)黃酮、多種礦物質(zhì)及揮發(fā)性成分等[14-15],并證實(shí)了紫皮石斛花乙醇提取物、多糖及氨基酸具有較好的體外抗氧化作用[16-17]。但紫皮石斛花總黃酮提取工藝及功效的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黃酮類(lèi)化合物普遍存在于各種植物中,具有抗氧化、抗炎、抗衰老、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[18],有著廣泛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。因此,通過(guò)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取工藝及作用的研究,可為保健品、藥品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ),從而提高紫皮石斛花開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

        以紫皮石斛花為原料,采用超聲波法提取總黃酮,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化紫皮石斛花總黃酮提取工藝條件,并探討紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子、DPPH 自由基及羥自由基的清除作用,為紫皮石斛花下一步的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

        1 試驗(yàn)部分

        1.1 主要儀器與試劑

        YF-150 型高速中藥粉碎機(jī),浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司產(chǎn)品;SQP 型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司產(chǎn)品;1524 型臺(tái)式普通離心機(jī),丹麥Labogene 公司產(chǎn)品;SHA-2 型冷凍水浴恒溫振蕩器,金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;SB-800DTD 型超聲清洗儀,寧波新藝超聲設(shè)備有限公司產(chǎn)品;UV-1800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品;Elx808 型酶標(biāo)儀,美國(guó)佰騰儀器有限公司產(chǎn)品。

        紫皮石斛花,云南省保山市龍陵天和土特產(chǎn)商貿(mào)發(fā)展有限公司提供;L- 抗壞血酸(分析純),上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司提供;總黃酮試劑盒、超氧陰離子清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、DPPH 自由基清除能力試劑盒,蘇州格銳思生物科技有限公司提供;無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇(分析純),天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司提供。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 總黃酮提取

        取干燥紫皮石斛花適量,于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量,粉碎、過(guò)60 目篩。稱(chēng)取紫皮石斛花粉末0.03 g,按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇,浸泡12 h,于一定溫度,800 W 超聲波下提取一定的時(shí)間,以轉(zhuǎn)速12 000 r/min 離心10 min,取上清液,用60%乙醇定容至1.5 mL,備用。

        1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

        按照“總黃酮試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法,采用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。根據(jù)說(shuō)明書(shū)中回歸方程Y=1.627 7X-0.004 9(R2=0.999 9),計(jì)算紫皮石斛花總黃酮質(zhì)量濃度,依據(jù)公式(1) 得出總黃酮提取率。

        式中:C——回歸方程中得出的紫皮石斛花總黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;

        V——提取液定容后體積,mL;

        W——樣品質(zhì)量,g。

        1.2.3 單因素試驗(yàn)

        (1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末,以料液比1∶50(g∶mL),分別加40%,50%,60%,70%,80%乙醇,在溫度60 ℃下以800 W 功率超聲提取30 min,考查不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

        (2) 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末,分別以料液比為1∶30,1∶35,1∶40,1∶45,1∶50(g∶mL) 加入60%乙醇,于60 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min,考查不同料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

        (3) 提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末,以料液比1∶50(g∶mL) 加60%乙醇,并分別于40,50,60,70,80 ℃的溫度下以800 W 功率超聲提取30 min,考查不同提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

        (4) 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。稱(chēng)取0.03 g 紫皮石斛花粉末,以料液比1∶50(g∶mL) 加入60%乙醇,并在溫度60 ℃下以800 W功率超聲分別提取20,25,30,35,40 min,考查不同提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響。

        1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,分別確定乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、提取溫度(C) 及提取時(shí)間(D)四因素的3 個(gè)水平。利用Design Expert 8.0.6 軟件中Box-behnken 方法設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)方案,以紫皮石斛花總黃酮提取率(Y) 為響應(yīng)值,確定紫皮石斛花總黃酮提取的最佳工藝。

        Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

        表1 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

        1.4 體外抗氧化試驗(yàn)

        1.4.1 溶液制備

        (1) 紫皮石斛花總黃酮溶液的配制。稱(chēng)取1.20 g紫皮石斛花粉末,按照最佳提取工藝條件進(jìn)行提取,并根據(jù)2.3.2 中方法測(cè)定其含量,然后用蒸餾水將其配制成0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mg/mL溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        (2) L- 抗壞血酸溶液的配制。稱(chēng)取L- 抗壞血酸100 mg,用適量的蒸餾水溶解,并定容至100 mL,再用蒸餾水配制成0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8 mg/mL 溶液,4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4.2 清除超氧陰離子能力的測(cè)定

        按照“超氧陰離子清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法,分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度,并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式(2) 計(jì)算超氧陰離子清除率。

        式中:A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度;

        A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度;

        A空白——空白管的吸光度。

        1.4.3 清除DPPH 自由基能力的測(cè)定

        按照“1,1 - 二苯基- 2 - 三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法,分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L - 抗壞血酸溶液的吸光度,并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式(3) 計(jì)算DPPH 自由基清除率。

        式中:A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度;

        A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度;

        A空白——空白管的吸光度。

        1.4.4 清除羥自由基能力的測(cè)定

        按照“羥自由基清除能力試劑盒說(shuō)明書(shū)”操作方法,分別測(cè)定不同濃度紫皮石斛花總黃酮溶液及L- 抗壞血酸溶液的吸光度,并根據(jù)說(shuō)明書(shū)中的公式

        (4) 計(jì)算羥自由基清除率。

        式中:A測(cè)定——測(cè)定管的吸光度;

        A對(duì)照——對(duì)照管的吸光度;

        A空白——空白管的吸光度。

        1.5 統(tǒng)計(jì)方法

        所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行測(cè)定3 次所得,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Excel、Design Expert 8.0.6、Sigma Plot 10.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

        圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        由圖1 可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,紫皮石斛花總黃酮提取率先增加后降低,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí),總黃酮提取率最大。而乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%后,總黃酮提取率反而下降,其可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,降低了總黃酮類(lèi)溶解性,并增加了其他醇溶性雜質(zhì)溶出,導(dǎo)致總黃酮提取率降低[19]。因此,選擇50%~70%乙醇優(yōu)化提取工藝。

        2.1.2 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

        圖2 料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        由圖2 可知,隨著料液比增加,總黃酮提取率呈現(xiàn)先增后降趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶35(g∶mL)時(shí),總黃酮提取率為最高,而料液比超過(guò)1∶35(g∶mL) 后,總黃酮提取率逐漸降低,可能是料液比的提高,增加了其他雜質(zhì)溶出,從而降低了總黃酮提取率[19]。因此,選擇1∶35~1∶45(g∶mL) 料液比優(yōu)化提取工藝。

        2.1.3 提取溫度對(duì)紫皮石斛花黃酮提取率的影響

        提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

        圖3 提取溫度對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        由圖3 可知,隨溫度增加,總黃酮提取率先增后降,當(dāng)溫度為70 ℃時(shí),提取率最高,而溫度超過(guò)70 ℃,提取率有所下降,其可能是由于溫度的提高,破壞了部分黃酮,導(dǎo)致總黃酮提取率降低[19]。因此,選擇60~80 ℃提取溫度優(yōu)化提取工藝。

        2.1.4 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

        圖4 提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率的影響

        由圖4 可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),總黃酮提取率先增加后降低,當(dāng)提取時(shí)間為25 min 時(shí),提取率達(dá)到最大值,而提取時(shí)間超過(guò)25 min,總黃酮提取率不斷降低,其可能是提取時(shí)間延長(zhǎng),導(dǎo)致部分黃酮被破壞[19]。因此,選擇20~30 min 提取時(shí)間優(yōu)化提取工藝。

        2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

        2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

        以A、B、C、D 4 個(gè)因素為自變量,響應(yīng)值為Y,利用Box-behnken 試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

        Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 Box-behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果

        2.2.2 回歸模型方差分析

        采用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表2 中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得到紫皮石斛花總黃酮提取率對(duì)自變量的二元多項(xiàng)回歸方程為:

        Y=2.56-0.24A-0.047B+0.100C+0.033D-0.023AB+0.045AC-0.020AD-0.025BC-0.068BD+0.030CD-0.028A2+0.24B2+0.13D2+0.11D2。

        回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

        表3 回歸模型的方差分析

        由表3 可知,回歸模型具有顯著性(p<0.05),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),模型回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.723 5,說(shuō)明該模型回歸方程擬合度好,具有較好的準(zhǔn)確性及可信度。A、B2具有極顯著性(p<0.01),提示乙醇體積分?jǐn)?shù)及二次項(xiàng)料液比對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率影響極顯著。由表中F 值可知,影響紫皮石斛花總黃酮提取率的因素順序?yàn)锳>C>B>D。

        2.2.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

        乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖5,乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖6,乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖7,料液比與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖8,料液比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖9,提取溫度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖見(jiàn)圖10。

        圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        圖8 料液比與提取溫度對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        圖9 料液比與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        圖10 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線(xiàn)圖

        響應(yīng)面分析圖中響應(yīng)面坡度、等高線(xiàn)密集度及形狀可反映兩因素交互作用是否顯著。響應(yīng)面坡度越大,等高線(xiàn)越密集并呈橢圓形,說(shuō)明兩因素交互作用顯著;反之,響應(yīng)面坡度越小,等高線(xiàn)越稀疏并呈圓形,說(shuō)明兩因素交互作用不顯著[27-30]。因此,由圖5 ~圖10 可知,各圖的響應(yīng)面坡度小,等高線(xiàn)不密集并呈橢圓形,提示AB、AC、AD、BC、BD及CD 因素交互作用不顯著。

        2.2.4 最佳提取工藝預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

        通過(guò)二元多項(xiàng)回歸方程可預(yù)測(cè)得到紫皮石斛花總黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60.17%,料液比1∶35.14(g∶mL),提取溫度69.97 ℃,提取時(shí)間29.00 min,在此條件下總黃酮提取率可達(dá)3.41%,為了試驗(yàn)的可操作性,將以上的最佳工藝修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶35(g∶mL),提取溫度70 ℃,提取時(shí)間29 min,在該條件下平行重復(fù)3 次試驗(yàn),得到總黃酮提取率為3.54%±0.013%,接近于預(yù)測(cè)值,說(shuō)明二元多項(xiàng)回歸方程模型擬合度較好,可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。

        2.3 體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

        2.3.1 紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

        紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用見(jiàn)圖11。

        圖11 紫皮石斛花總黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用

        由圖11 可知,在質(zhì)量濃度0~0.8 mg/mL 范圍內(nèi),紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)超氧陰離子清除率存在量效關(guān)系,清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí),清除率達(dá)到最大,分別為61.41%,86.80%,對(duì)超氧陰離子的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(Half inhibitory concentration,IC50) 分別為0.32,0.08 mg/mL,說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較好的清除超氧陰離子能力,但要比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

        2.3.2 紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用

        紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用見(jiàn)圖12。

        圖12 紫皮石斛花總黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除作用

        由圖12 可知,在質(zhì)量濃度0~0.8 mg/mL 范圍內(nèi),紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基清除率存在量效關(guān)系,清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí),清除率達(dá)到最大,分別為86.70%,89.28%,對(duì)DPPH 自由基的IC50分別為0.17,0.003 mg/mL,說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力,但不及L - 抗壞血酸。

        2.3.3 紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

        紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用見(jiàn)圖13。

        圖13 紫皮石斛花總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

        由圖13 可知,在質(zhì)量濃度0~0.8 mg/mL 范圍內(nèi),紫皮石斛花總黃酮、L- 抗壞血酸對(duì)羥自由基清除率存在量效關(guān)系,清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL 時(shí),清除率達(dá)到最大,分別為31.50%,86.39%,對(duì)羥自由基清除率的IC50分別為0.42,0.18 mg/mL,說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有一定的清除羥自由基能力,但比L - 抗壞血酸的清除能力弱。

        3 結(jié)論

        在單因素試驗(yàn)分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度及提取時(shí)間對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)紫皮石斛花總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶35(g∶mL),提取溫度70 ℃,提取時(shí)間29 min,在此條件下,紫皮石斛花總黃酮平均提取率為3.54%,與預(yù)測(cè)值3.41%接近,提示該提取工藝可用于紫皮石斛花總黃酮的提取。通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,在0~0.8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),紫皮石斛花總黃酮的抗氧化作用存在量效關(guān)系,其對(duì)超氧陰離子、DPPH 自由基、羥自由基最大清除率分別為61.41%,86.70%,31.50%,IC50分別為0.32,0.17,0.42 mg/mL,說(shuō)明紫皮石斛花總黃酮具有較好的抗氧化作用。該研究可為紫皮石斛花總黃酮的提取及其相關(guān)保健品、藥品等方面的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

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