趙欣，倪薇，宋帆帆，黃雅菲

纈沙坦（valsartan）屬于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡreceptor blockers，ARB）類抗高血壓類藥物［1］，氨氯地平（amlodipine）屬于鈣離子通道阻滯劑（calcium channel blocker，CCB）類抗高血壓類藥物［2］。復(fù)方纈沙坦氨氯地平片（商品名：倍博特）是諾華公司開發(fā)的全球第一個(gè)由血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑和鈣拮抗劑構(gòu)成的單片復(fù)方制劑，主要用于治療原發(fā)性高血壓［3］。研究表明，本品對(duì)近90%高血壓病人達(dá)到良好的治療效果［4］。目前，國(guó)內(nèi)已有多家藥品生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)了復(fù)方纈沙坦氨氯地平片，其質(zhì)量與原研制劑可能存在一定的差異性，進(jìn)而會(huì)影響到臨床治療效果。為此，2020 年10 月至2022年2月本研究選擇了南京市溧水區(qū)人民醫(yī)院現(xiàn)有的國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片，通過(guò)全面比較制劑的質(zhì)量，評(píng)價(jià)二者質(zhì)量的相似性程度。

1 材料與方法

1.1 儀器LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；MS204S 型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；S220 型pH 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；Vision G2 Elite 8 型溶出試驗(yàn)儀（美國(guó)漢森公司）；YD-35 型智能片劑硬度儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；KB-1型口崩片崩解儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

1.2 材料纈沙坦（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100651-202006，含量99.0%）；苯磺酸氨氯地平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100374-202106，含量99.9%）；復(fù)方纈沙坦氨氯地平片（原研制劑，批號(hào)BVW83，規(guī)格纈沙坦80 毫克/片、氨氯地平5 毫克/片）；復(fù)方纈沙坦氨氯地平片（國(guó)產(chǎn)制劑，批號(hào)210421JB，規(guī)格含纈沙坦80 毫克/片、氨氯地平5 毫克/片）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，純化水自制。

1.3 方法

1.3.1色譜條件優(yōu)化

1.3.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 依次取纈沙坦對(duì)照品溶液和苯磺酸氨氯地平對(duì)照品溶液，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，纈沙坦在273 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，氨氯地平在237 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為237 nm時(shí)，兩種藥物的檢測(cè)靈敏度良好。

1.3.1.2柱溫優(yōu)化 分別考察了30 ℃、35 ℃和40 ℃，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著柱溫升高，兩種藥物的保留時(shí)間均縮短，分離度也減小，綜合評(píng)估保留時(shí)間與分離度情況，確定柱溫為30 ℃。

1.3.1.3流速優(yōu)化 分別考察了0.8、1.0 和1.2 mL/min，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流速為1.2 mL/min時(shí)，兩種藥物的保留時(shí)間較短，分離度較小，而流速為1.0 mL/min 時(shí)，兩種藥物的分離度較好，確定流速為1.0 mL/min。

1.3.1.4色譜條件 色譜柱：Syncronis Hypersil BDS C8色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8）為20∶33∶47（v/v/v）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2方法學(xué)考察

1.3.2.1對(duì)照品溶液配制 稱取纈沙坦對(duì)照品約80.0 mg 和苯磺酸氨氯地平對(duì)照品約7.0 mg（相當(dāng)于氨氯地平5.0 mg），精密稱定，加入到同一個(gè)棕色量瓶（100 mL）中，再加入少量乙腈，超聲溶解，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（含纈沙坦800 mg/L、氨氯地平50 mg/L）。精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL 置于25 mL 棕色容量瓶中，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得纈沙坦與氨氯地平對(duì)照品溶液（每1 mL中含纈沙坦80 μg，氨氯地平5 μg）。

1.3.2.2供試品溶液配制 取復(fù)方纈沙坦氨氯地平片10片，精密稱定，用研缽研成粉末狀，精密稱定相當(dāng)于1 片重量的藥物粉末（約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg）加入到100 mL 棕色量瓶中，再加少量乙腈，水浴超聲10 min，放冷至室溫，用流動(dòng)相定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。精密移取續(xù)濾液2.5 mL置25 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

1.3.2.3輔料溶液配制 稱取除纈沙坦和氨氯地平以外的其他輔料壓制成只含有輔料的片劑。取上述片劑10片，用研缽研成粉末狀，精密稱取相當(dāng)于1片重量的輔料粉末置100 mL容量瓶中，再加少量乙腈，水浴超聲10 min，放冷至室溫，用流動(dòng)相定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾。精密移取續(xù)濾液2.5 mL 置25 mL 棕色量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得輔料溶液。

1.3.2.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“對(duì)照品溶液”“供試品溶液”以及“輔料溶液”按照“1.3.1.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，纈沙坦和氨氯地平之間分離度良好（分離度R大于1.5），拖尾因子均在0.95~1.05，理論塔板數(shù)均大于8 000，輔料不干擾藥物測(cè)定。

1.3.2.5線性考察 稱取纈沙坦對(duì)照品約80.0 mg和苯磺酸氨氯地平對(duì)照品約7.0 mg（相當(dāng)于氨氯地平5.0 mg），精密稱定，加入到同一個(gè)棕色量瓶（100 mL）中，再加入少量乙腈，超聲溶解，用流動(dòng)相定容，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（含纈沙坦800 mg/L，氨氯地平50 mg/L）。精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別加入pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液三種介質(zhì)溶液并定容，配制成含有纈沙坦?jié)舛纫来螢?.0、8.0、20.0、40.0 和80.0 mg/L 對(duì)照品溶液，氨氯地平濃度依次為0.25、0.5、1.25、2.5 和5.0 mg/L 對(duì)照品溶液。按照“1.3.1.4”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以藥物濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)表1。

表1 纈沙坦和氨氯地平在不同pH溶出介質(zhì)中線性回歸方程

結(jié)果表明，在三種溶出介質(zhì)中，纈沙坦?jié)舛仍?.0~80.0 mg/L 范圍內(nèi)，氨氯地平濃度在0.25~5.0 mg/L 范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，符合測(cè)定要求。

1.3.2.6精密度試驗(yàn) 取“1.3.2.5”項(xiàng)下采用三種溶出介質(zhì)配制的纈沙坦和氨氯地平對(duì)照品溶液（纈沙坦?jié)舛染鶠?0.0 mg/L，氨氯地平濃度均為1.25 mg/L），按照“1.3.1.4”項(xiàng)下的色譜條件均重復(fù)進(jìn)樣6 針，分別記錄纈沙坦和氨氯地平的峰面積，計(jì)算各自的精密度（RSD）值。結(jié)果顯示，在pH 1.2鹽酸水溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液三種溶出介質(zhì)中，纈沙坦的峰面積值的RSD（n=6）分別為0.6%、1.0%和1.0%，氨氯地平的峰面積值的RSD（n=6）分別為0.5%、1.0%和0.7%，RSD值均小于2%，說(shuō)明精密度良好，符合測(cè)定要求［5］。

1.3.2.7濾膜吸附性考察 取復(fù)方纈沙坦氨氯地平片分別在3 種溶出介質(zhì)中進(jìn)行溶出度實(shí)驗(yàn)，在每種溶出介質(zhì)中分別在5、15和30 min取出溶出液，各兩份，一份經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，另一份經(jīng)4 000 r/min 離心10 min 處理，并用對(duì)應(yīng)的溶出介質(zhì)稀釋適當(dāng)倍數(shù)，按“1.3.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄纈沙坦和氨氯地平的峰面積，考察濾膜對(duì)藥物的吸附性［6］。結(jié)果表明，在3 種溶出介質(zhì)中，低、中、高3 種濃度的纈沙坦和氨氯地平溶液經(jīng)濾膜過(guò)濾和離心處理，其峰面積幾乎無(wú)差異，本研究采用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾溶出介質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 溶解度測(cè)定分別取過(guò)量的纈沙坦和苯磺酸氨氯地平原料藥混合物分別加入到pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液三種介質(zhì)溶液中，恒溫水浴（37 ℃）振蕩器中振蕩72 h，離心，取上清液5 mL經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用對(duì)應(yīng)介質(zhì)溶液稀釋一定倍數(shù)，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄纈沙坦和氨氯地平的峰面積，并計(jì)算纈沙坦和氨氯地平在三種介質(zhì)中的溶解度［7］，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，纈沙坦的溶解度呈pH依賴性［8］，在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中的溶解度較高，而在pH 1.2 鹽酸溶液中的溶解度較低；氨氯地平的溶解度不具有pH依賴性。

表2 纈沙坦和氨氯地平在不同pH介質(zhì)中37 ℃溶解度

2.2 質(zhì)量對(duì)比研究

2.2.1硬度及崩解時(shí)限對(duì)比研究 分別取原研和國(guó)產(chǎn)復(fù)方纈沙坦氨氯地平片各10 片，通過(guò)硬度儀測(cè)定片劑硬度；另取上述兩種制劑各10 片，通過(guò)崩解儀測(cè)定片劑的崩解時(shí)限［9］，結(jié)果見(jiàn)表3。測(cè)定結(jié)果顯示，兩種復(fù)方纈沙坦氨氯地平片的硬度存在一定的差異，國(guó)產(chǎn)制劑硬度偏低，而崩解時(shí)限基本一致。

表3 國(guó)產(chǎn)和原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片硬度及崩解時(shí)限檢測(cè)結(jié)果（n=10）

2.2.2溶出度對(duì)比研究 依據(jù)《美國(guó)藥典》40 版關(guān)于復(fù)方纈沙坦氨氯地平片溶出度方法，選擇槳法，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溶出介質(zhì)為pH 6.8 磷酸鹽緩沖液，體積為1 000 mL，溫度為（37.0±0.5）℃。分別取國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片各6片加入到溶出杯杯中，啟動(dòng)攪拌槳，在30 min 時(shí)間點(diǎn)取溶出介質(zhì)5 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液稀釋一定倍數(shù)，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄纈沙坦和氨氯地平的峰面積，并計(jì)算溶出度。要求纈沙坦和氨氯地平的溶出度均不低于標(biāo)示量的80%。結(jié)果見(jiàn)表4。在pH 6.8磷酸鹽緩沖液中，國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片在30 min 內(nèi)，纈沙坦和氨氯地平的溶出度均達(dá)到80%以上，且二者溶出度均值較為相似。

表4 國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片的溶出度比較（n=6）

2.2.3溶出相似性比較 依據(jù)《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，通過(guò)比較國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片在三種（pH 1.2 鹽酸水溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液和pH 6.8磷酸鹽緩沖液）溶出介質(zhì)中的溶出曲線相似性，以評(píng)估國(guó)產(chǎn)與原研制劑的質(zhì)量差異性［10-12］。選擇“2.2.2”項(xiàng)下所描述的測(cè)定復(fù)方纈沙坦氨氯地平片溶出度方法，介質(zhì)體積均為1 000 mL，轉(zhuǎn)速為75 r/min，溫度為（37.0±0.5）℃。分別取國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片各6 片加入到溶出杯杯中，啟動(dòng)攪拌槳，分別在5、10、15、20 和30 min 時(shí)間點(diǎn)取溶出介質(zhì)5 mL，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液稀釋一定倍數(shù)，按照“1.3.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，分別記錄纈沙坦和氨氯地平的峰面積，并計(jì)算兩種藥物的溶出度。將溶出度數(shù)據(jù)帶入到公式2］-0.5×100｝中計(jì)算相似因子（f2），比較國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片在三種溶出介中的溶出曲線相似性［13］，其f2值在50~100 之間表明兩種制劑的溶出相似性較好，該值越大相似性越高；而f2值小于50 時(shí)，表明兩種制劑的溶出相似性較差，該值越小相似性越差，國(guó)產(chǎn)與原研制劑的溶出度相似性結(jié)果比較見(jiàn)表5，6。

表5 國(guó)產(chǎn)與原研制劑在不同溶出介質(zhì)中纈沙坦的溶出曲線相似性比較

表6 國(guó)產(chǎn)與原研制劑在不同溶出介質(zhì)中氨氯地平的溶出曲線相似性比較

由溶出曲線對(duì)比研究可知，國(guó)產(chǎn)與原研制劑中的纈沙坦在pH 1.2鹽酸溶液和pH 4.5醋酸鹽緩沖液中30 min 內(nèi)不能完全溶出，而在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中可以完全溶出，這是由于纈沙坦在較低的pH條件下溶解度較低，達(dá)不到漏槽條件［14］；氨氯地平在三種溶出介質(zhì)中30 min 內(nèi)均可以達(dá)到90%以上。相似性比較結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片在不同溶出介質(zhì)中的f2值均大于80，說(shuō)明兩種制劑的體外溶出相似性極高［15］。

3 討論

由于氨氯地平屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（bio?pharmaceutics classification system，BCS）Ⅰ類藥物，具有高溶解性和高滲透性，主要吸收部位在小腸，其口服生物利用度可達(dá)到近90%，吸收較好，不同廠家生產(chǎn)的制劑很容易達(dá)到生物等效［16］；而纈沙坦屬于BCSⅡ類弱酸性藥物［17］，其在酸性條件下藥物以分子形式存在，而在弱酸性或中性條件下以離子形式存在，由于纈沙坦的主要吸收部位在十二指腸和小腸上端［18］，在該體內(nèi)環(huán)境中藥物部分是以離子形式存在，其口服生物利用度僅為25%左右，吸收較差［19］，不同廠家生產(chǎn)的制劑很難達(dá)到生物等效［20］。因此需要一種有效手段來(lái)評(píng)價(jià)不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方纈沙坦氨氯地平片質(zhì)量一致性。

為了同時(shí)測(cè)定溶出介質(zhì)中纈沙坦和氨氯地平的含量，本研究首先采用文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC 法進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)［21］，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用該分析方法不能使氨氯地平和纈沙坦達(dá)到良好的分離，并且氨氯地平的峰型較差，影響其色譜峰的準(zhǔn)確積分，因此本研究重新開發(fā)了能夠同時(shí)測(cè)定纈沙坦和氨氯地平含量的HPLC 法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該色譜條件能夠有效的分離纈沙坦和氨氯地平，專屬性強(qiáng)，且輔料不干擾測(cè)定，適用于復(fù)方纈沙坦氨氯地平片的藥物溶出度含量檢測(cè)。

本研究通過(guò)比較國(guó)產(chǎn)與原研復(fù)方纈沙坦氨氯地平片的在多介質(zhì)條件中的藥物溶出曲線，結(jié)果顯示，國(guó)產(chǎn)與原研制劑在不同溶出介質(zhì)中的f2值均大于80，說(shuō)明兩種制劑的體外溶出相似性極高，很可能會(huì)達(dá)到生物等效。本研究也可以為其他廠家生產(chǎn)的復(fù)方纈沙坦氨氯地平片質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)提供參考。