徐永艷李 昆焦 蓉汪 瓊王春濤郁步竹徐 榮

（1. 西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650233；2. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所，云南 昆明 650233；3. 玉溪師范學(xué)院，云南 玉溪 653100）

滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）是云南道地稀缺名貴藥材，通常以干燥根莖入藥，具有消腫止痛、清熱解毒、涼肝定驚、免疫調(diào)節(jié)等多種功效[1]，近年研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種類型的腫瘤具有非常好的治療效果，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片等中成藥的主要原料[2]。滇重樓作為重要的中成藥原料，目前已經(jīng)分離和鑒定了甾醇及苷類、氨基酸、脂肪酸、多糖、黃酮等50 多種成分，其主要有效成分為甾體皂苷[3]。2015 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定滇重樓的含量標(biāo)準(zhǔn)為薯蕷皂苷（重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ）和偏諾皂苷（重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ）總含量≥0.60%[4]。近年來(lái)隨著滇重樓藥用范圍不斷擴(kuò)大，每年消耗量遠(yuǎn)超出年再生能力，加之滇重樓根莖生長(zhǎng)周期漫長(zhǎng)、生長(zhǎng)速度緩慢的特點(diǎn)，仍制約著人工種植業(yè)的發(fā)展[5]。此外，滇重樓皂苷合成分子機(jī)制尚不清楚，其產(chǎn)量及有效成分甾體皂苷含量無(wú)法短時(shí)期內(nèi)提升，供不應(yīng)求的窘迫現(xiàn)狀仍未根本上得以改善[6]。

滇重樓傳統(tǒng)入藥部分為根莖，其地上部分的藥用價(jià)值鮮有利用，在原材料極度缺乏的形勢(shì)下，測(cè)定根莖以外其他組織器官如葉片、地上莖、新芽、花、須根、果皮、種子中總皂苷含量，可為充分利用滇重樓資源提供參考[7]。中藥材有效成分積累是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，主根等器官在不同生長(zhǎng)年限所含皂苷單體種類及含量不盡相同，不同生長(zhǎng)階段皂苷單體種類及其含量也有所差別[8]。由此可見，重樓皂苷積累具備明顯的時(shí)空特征，但是該特征迄今在國(guó)內(nèi)外未見系統(tǒng)報(bào)道。因此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定滇重樓同一生長(zhǎng)年限不同器官和同一器官在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期皂苷種類及其含量，總結(jié)重樓皂苷在植物生長(zhǎng)過(guò)程中的時(shí)空變異和積累規(guī)律，可為滇重樓器官采收期的科學(xué)確定和滇重樓器官的綜合、合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取前期篩選重樓皂苷含量較高、生長(zhǎng)較快、云南普洱景東地理種源的滇重樓作為研究對(duì)象，選取30 株健壯7 年生植株于2020 年3 月定植在西南林業(yè)大學(xué)樹木園苗圃（云南，昆明）；采用70%遮陰網(wǎng)遮陰，統(tǒng)一水肥管理。經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)曾覺民教授鑒定為滇重樓（Paris polyphyllavar.yunnanensis）。按不同組織、生長(zhǎng)季節(jié)分別取樣，進(jìn)行重樓皂苷含量測(cè)定。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀：G1322A脫氣機(jī)、G1311A 泵、G1313A 進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱、G1315B 檢測(cè)器；KQ-500E 型超聲波清洗儀；METRotavapor RⅡ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；精度為0.01 g的天平。

1.2.2 試劑

重樓皂苷Ⅰ（YJ-111591）、皂苷Ⅱ（YJ-111592）、皂苷Ⅵ（YJ-111593）和皂苷Ⅶ（YJ-111594）4 種對(duì)照品均從中國(guó)藥品生物制品檢定所購(gòu)買，供含量測(cè)定用。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.3.1 滇重樓根莖1～5 a 齡段中皂苷含量的差異性分析

2020 年7 月隨機(jī)選取滇重樓樣株根莖1 年生、2 年生、3 年生、4 年生和5 年生部分切下，根莖的1 年生、2 年生等各組織區(qū)分見圖1，本研究用根莖1～7 a 齡段表示。相同部位混樣60 ℃烘干，加熱回流法[9]提取總皂苷，采用高效液相法[10]測(cè)定各樣品皂苷含量，設(shè)3 次重復(fù)。線性關(guān)系考察表明各標(biāo)準(zhǔn)品范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系；精密度試驗(yàn)RSD 結(jié)果為0.39%，說(shuō)明所采用儀器精密度良好；RSD 的結(jié)果表明供試品的溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好、方法重復(fù)性良好。

圖 1 7 年生滇重樓根莖Fig. 1 A sketch of rhizome and stem of 7-year-oldP. polyphyllavar. yunnanensis

1.3.2 滇重樓不同組織器官中皂苷含量比較分析

測(cè)定比較根莖、葉片、地上莖、新芽、花、須根、果皮、種子等不同組織器官的重樓皂苷含量，2020 年7 月隨機(jī)采樣混樣干燥后進(jìn)行皂苷含量測(cè)定，3 次重復(fù)。

1.3.3 不同生長(zhǎng)期滇重樓根莖皂苷含量的比較分析

分別于2020 年7 月、9 月、11 月底和2021年1 月、3 月、5 月底取樣，隨機(jī)取滇重樓樣株根莖1 a 齡段混勻干燥后測(cè)定皂苷含量，3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇重樓不同年限根莖及其他組織累積皂苷含量的比較分析

滇重樓總皂苷成分以重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ?yàn)橹鳎貥窃碥闸?、重樓皂苷Ⅶ為輔（表1、圖2）。滇重樓中總皂苷集中于根莖部位，含量在7.1～15.7 mg/g 之間，2 a 齡段根莖含量最高，須根、莖、葉、花、芽、果皮、種子等器官中也檢測(cè)到重樓皂苷，其含量在0.7～5.7 mg/g 之間，皂苷最高含量是最低含量的22.4 倍。滇重樓根部總皂苷含量高于其他組織器官，達(dá)到了顯著差異水平（P＜0.05），不同生長(zhǎng)年齡的滇重樓根部總皂苷含量差異顯著（P＜0.05），根莖1 a 齡段的皂苷含量最低，根莖2 a 齡段含量最高。通過(guò)方差分析和多重比較可知，普洱景東種源滇重樓根莖4 a 齡段和根莖5 a 齡段兩者之間差異不顯著，其他不同組織器官兩兩之間的總皂苷含量均顯著差異（P＜0.05）。

表 1 不同年限根莖及其他組織重樓皂苷的含量Table 1 Contents of saponins in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue

圖 2 不同生長(zhǎng)年限根莖及其他組織重樓皂苷含量HPLC 圖譜Fig. 2 HPLC chromatograms in the samples collected in different growth years of rhizome and other tissue

2.2 不同生長(zhǎng)發(fā)育期根莖皂苷累積的比較分析

通過(guò)觀察景東種源滇重樓，總結(jié)其年生長(zhǎng)規(guī)律如下：1 月（休眠期）、3 月（地上部分即將萌動(dòng)）、5 月（花期）、7 月（結(jié)實(shí)期）、9 月（果實(shí)膨大期）、11 月（倒桿期）、1 月（休眠期）。通常植物在花期、果期會(huì)消耗大量養(yǎng)分，滇重樓的地上、地下生長(zhǎng)高峰期交替進(jìn)行，9 月前后，新芽（下1 年的莖葉）形成，滇重樓開始進(jìn)入地下根莖快速生長(zhǎng)期，12 月前后倒桿進(jìn)入休眠期。該種源生長(zhǎng)期長(zhǎng)，倒桿時(shí)間比其他種源晚。

滇重樓1 年生根莖在不同生長(zhǎng)發(fā)育期總皂苷成分以薯蕷類重樓皂苷Ⅰ和重樓皂苷Ⅱ?yàn)橹鳎ū?、圖3）?？傇碥蘸吭? 月最高達(dá)8.655 mg/g，在5—11 月花果期總皂苷含量最低為6.117 mg/g。3 月底滇重樓已經(jīng)完成了花芽分化，皂苷含量開始降低為7.922 mg/g，4 月其莖葉和花蕾同時(shí)出土，5 月開花皂苷含量持續(xù)降低至最低點(diǎn)6.117 mg/g，之后7 月結(jié)實(shí)期提高為7.155 mg/g，9 月果實(shí)膨大期又降低為6.285 mg/g，11 月倒桿期皂苷含量有所升高為6.961 mg/g。其中，景東種源滇重樓5 月和9 月、7 月和11 月的總皂苷含量差異不顯著，1 月、3 月皂苷含量與其他時(shí)期均差異顯著（P＜0.05）。

表 2 植株不同生長(zhǎng)期重樓皂苷的含量Table 2 Contents of saponins in the samples collected in different growth stages

圖 3 不同生長(zhǎng)時(shí)期重樓皂苷含量的HPLC 圖譜Fig. 3 HPLC chromatograms of saponins contents in the samples collected in different growth stages

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，滇重樓根莖、須根、莖、葉、花、芽、果皮、種子等器官均檢測(cè)到重樓皂苷，根莖作為傳統(tǒng)藥用部位皂苷含量最高，基本均超過(guò)0.6%，葉片、須根、莖、花、芽、果皮和種子等部位均檢測(cè)到重樓皂苷，含量從高到低排列為：根莖＞葉＞種子＞芽＞莖＞須根＞果皮＞花。除根莖外的其他部位的皂苷含量均未超過(guò)0.6%，但整個(gè)植株仍然具有開發(fā)利用價(jià)值，尤其是葉中總皂苷含量達(dá)0.16%～0.52%，建議提取利用。滇重樓根莖中2 a 齡段含量最高，隨年份增加而降低，該結(jié)果與其他文獻(xiàn)3 年生最高不同[11]，可能因?yàn)楸驹囼?yàn)中是取7 年生植株的兩年生部位導(dǎo)致。推測(cè)皂苷從前體到合成需要較長(zhǎng)時(shí)間，葉片是重樓皂苷的重要合成部位，合成后輸送到根莖部?jī)?chǔ)存，重樓根莖為重樓皂苷的“庫(kù)”。與馮麗麗等[12]提出的重樓皂苷主要在植物葉綠體中合成，從地上部位向下運(yùn)輸主要在根莖和葉中儲(chǔ)存的觀點(diǎn)一致，也解釋了葉中總皂苷含量相對(duì)較高的原因。本研究顯示在不同生長(zhǎng)年限根莖中，皂苷含量從高到低依次為2 a 齡段、3 a 齡段、4～5 a 齡段、1 a 齡段，與傳統(tǒng)認(rèn)知的7 a 左右為最佳采收期差距甚遠(yuǎn)，同一植株根莖皂苷含量在2 年生部位達(dá)到最高值，隨年限增加呈遞減趨勢(shì)，推測(cè)重樓皂苷代謝為邊合成、邊分解的動(dòng)態(tài)過(guò)程，達(dá)到某個(gè)閾值時(shí)，開始分解，有待于后期通過(guò)分子生物學(xué)手段進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究測(cè)定不同生長(zhǎng)季節(jié)總皂苷含量高低變化規(guī)律為1 月＞3 月＞5 月、9 月＞7 月、11 月，花期和果期皂苷含量較低，與夏從龍等[13]測(cè)定的滇重樓在5 月、6 月份花期的皂甙含量最高，9 月、10 月份果期最低的結(jié)果不一致，可能因植物材料、栽培地的地域性及生態(tài)環(huán)境條件不同導(dǎo)致。但與西洋參測(cè)定的休眠期高于花果期皂苷含量的結(jié)果一致[14]，推測(cè)滇重樓花果期生殖生長(zhǎng)消耗大量養(yǎng)分導(dǎo)致皂苷含量低。植物休眠期通常要完成花芽分化、生理后熟等重要生理活動(dòng)[15-16]，1 月前后的休眠季節(jié)皂苷含量最高，可能是皂苷合成的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為重樓皂苷。宜對(duì)不同生長(zhǎng)期重樓皂苷合成主要基因同時(shí)進(jìn)行qPCR 測(cè)定，與皂苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析，可以更加深入地從分子層面解析重樓皂苷的累積規(guī)律。前人研究認(rèn)為甾體皂苷合成有甲羥戊酸通路（MVA）和非甲羥戊酸通路（MEP），MVA 為主要通路[17]。甾體皂苷骨架生物合成最后由β-糖苷酶與甾體糖基轉(zhuǎn)移酶催化形成多種甾體皂苷[18]。尼二磷酸合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、鯊烯合成酶等多種酶參與甾體皂苷合成[19]，環(huán)阿屯醇合酶（CAS）和鯊烯合酶（SQS）是滇重樓的主要有效成分甾體皂苷（三萜類物質(zhì)）合成通路中的關(guān)鍵酶[20]。為進(jìn)一步明確滇重樓皂苷合成通路，后期將利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)滇重樓不同季節(jié)、不同組織器官進(jìn)行分析。以期挖掘滇重樓皂苷合成通路中的關(guān)鍵基因并揭示其調(diào)控機(jī)制，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)的基因調(diào)控手段提高滇重樓皂苷含量提供基礎(chǔ)。

采收期是影響中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)之一，生產(chǎn)中滇重樓的最佳采收年限應(yīng)綜合根莖增長(zhǎng)速率和皂苷增加速率來(lái)決定，選取經(jīng)濟(jì)效益最高時(shí)采收為宜，明確滇重樓器官皂苷積累時(shí)空特征具有重要意義。由于滇重樓資源日漸枯竭，葉中總皂苷含量達(dá)0.16%～0.52%，可部分替代根莖入藥緩解供需矛盾。因此，本研究探討了滇重樓根莖在不同生長(zhǎng)年限、不同生長(zhǎng)發(fā)育期及不同器官的總皂苷含量規(guī)律，可為生產(chǎn)中最佳采收期的確定和滇重樓器官的綜合、合理利用提供科學(xué)依據(jù)。