黃 鍵王德新楊 松鄭超凡陸莊躍許玉蘭

（1. 云南省林木種苗工作總站，云南 昆明 650215；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650233；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650233）

光合作用是植株進(jìn)行的重要生理活動(dòng)，葉綠素是參與光合作用非常重要的一種光合色素[1]，葉綠素含量與葉片光合速率密切相關(guān)[2]，葉綠素含量可以反映植株的光合作用能力及營(yíng)養(yǎng)健康狀態(tài)[3]，成為衡量光合產(chǎn)物的重要指標(biāo)[4]。葉綠素是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，極易受外界環(huán)境，比如光、溫、水、肥等因素的影響[5-7]。研究表明，增施氮（N）對(duì)葉綠素合成和光系統(tǒng)功能有明顯的促進(jìn)作用[8-10]。但不同用量下的響應(yīng)不一致，外源性肥料添加促進(jìn)作用與用量、植物自身元素虧缺狀態(tài)有關(guān)[9-11]。N、磷（P）作為植物的基本營(yíng)養(yǎng)元素，在植物生長(zhǎng)和各種生理調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[12-15]，其中控制好N、P 配比尤為重要。尹意婷等[12]在N、P 配施對(duì)青岡（Quercus glauca）、苦櫧（Castanopsis sclerophylla）幼苗生物量分配及葉片養(yǎng)分含量的影響試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，少量的N 和P 對(duì)苗木生物量的積累影響不大，而合理的施N 和施P 能夠顯著的增加苗木生物量。因此合理施肥對(duì)促進(jìn)苗木正常生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)力、改善植物體內(nèi)元素含量具有十分重要的作用。施肥的方式也較多，其中葉面施肥相對(duì)于傳統(tǒng)施肥方式具有利用效率高、用量少、養(yǎng)分吸收快、便于噴施等優(yōu)勢(shì)，目前葉面施肥的研究越來(lái)越廣泛[16-17] 。

云南松（Pinus yunnanensis）為松科松屬的常綠高大針葉喬木，具有喜光、耐干旱，而且對(duì)土壤條件的要求較低，不僅能在酸性紅壤、紅黃壤和棕色森林土或微石灰性土壤上生長(zhǎng)，也能在其他樹(shù)種不能生長(zhǎng)的貧瘠地或水土流失嚴(yán)重的荒山生長(zhǎng)[18]。云南松苗期生長(zhǎng)緩慢，對(duì)其生長(zhǎng)促成培育非常有必要，其中施肥是較為常見(jiàn)簡(jiǎn)易的途徑，前期的研究表明，N、P 添加可促進(jìn)云南松苗木的生長(zhǎng)[17,19]，但不同的N、P 用量如何影響植株的葉綠素含量不清。本研究闡述了不同N、P 葉面噴施下葉綠素a、葉綠素b 指標(biāo)的變化特征，以探索N、P 添加對(duì)云南松苗木葉綠素含量、比值及其異速生長(zhǎng)關(guān)系的影響，進(jìn)而篩選云南松生長(zhǎng)的適宜N、P 噴施量，以期為云南松苗木的促成培育提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為云南松苗木合理施肥和高產(chǎn)高效栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

試驗(yàn)地設(shè)置在西南林業(yè)大學(xué)的苗圃內(nèi)，地處云南省昆明市，位于北緯25°04'00″、東經(jīng)102°45'41″，海拔約1 945 m，屬北亞熱帶半濕潤(rùn)高原季風(fēng)氣候。本研究以2 年生云南松幼苗為材料，施肥前選取株長(zhǎng)勢(shì)基本一致，健康無(wú)病蟲(chóng)害的幼苗組成不同的試驗(yàn)小組，插牌標(biāo)記并進(jìn)行N、P 葉面噴施試驗(yàn)。試驗(yàn)用土以西南林業(yè)大學(xué)校內(nèi)紅壤土與育苗基質(zhì)公司的腐殖土按體積比為1∶2 混合均勻作為育苗基質(zhì)。

1.2 研究方法

試驗(yàn)采用N、P 各2 因素3 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，外源N、P 按高、中、低濃度設(shè)置3 個(gè)梯度[19]，N采用尿素（CH4N2O）、P 采用磷酸二氫鉀（KH2PO4），N水平N1、N2、N3分別為0%、0.25%、0.5%（以N 含量計(jì)算，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），P 肥水平P1、P2、P3分別為0%、0.2%、0.4%（以P 含量計(jì)算，質(zhì)量分?jǐn)?shù)），具體方案如表1 所示。試驗(yàn)共9 個(gè)處理，每個(gè)處理40 株，重復(fù)3 次，合計(jì)1 080 株云南松苗木。試驗(yàn)于2020 年6 月底至8 月底采用等量施肥法每隔7 d 噴施1 次，共噴施8 次，噴施周期為2 個(gè)月，噴施時(shí)盡可能使每個(gè)處理每個(gè)單株的施肥量相近。并對(duì)云南松苗木進(jìn)行定期澆水、除草，松土。

表 1 云南松苗木N、P 葉面噴施用量Table 1 Experimental design of foliar spraying of nitrogen and phosphorus on P. yunnanensisseedlings

1.3 數(shù)據(jù)測(cè)定

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)測(cè)量時(shí)間為2020 年8 月、10 月、12 月底各測(cè)量1 次，共測(cè)3 次，各處理各個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選8 株長(zhǎng)勢(shì)一致的苗木，用混合采樣法采摘當(dāng)年生成熟針葉，用丙酮提取法對(duì)葉綠素進(jìn)行提取，用分光光度法對(duì)葉綠素含量進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3 次。然后計(jì)算葉綠素a 含量、葉綠素b 含量、葉綠素（a + b）含量以及葉綠素a/b。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，使用Excel 2016、SPSS 等軟件對(duì)其N、P 以及交互作用對(duì)葉綠素影響進(jìn)行雙因素方差分析，利用Duncan 多重比較（α=0.05）檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性[20-21]，用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差進(jìn)行繪圖[22]。利用SPSS 構(gòu)建葉綠素指標(biāo)與N、P 用量間的二元二次回歸方程，進(jìn)一步采用降維法對(duì)N、P 配施效果進(jìn)行單因素效應(yīng)分析，確定最佳N、P 用量及其最高理論產(chǎn)量值和葉綠素含量的適宜N、P 濃度配比[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量的變異來(lái)源分析

在測(cè)定的8 月、10 月、12 月，N、P 交互作用對(duì)云南松苗木的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素（a + b）含量的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），而8 月和12 月N、P 交互作用對(duì)葉綠素a/b 無(wú)顯著相互作用。從N 葉面噴施單個(gè)因素來(lái)看，對(duì)8 月、10 月、12月葉綠素a 含量的影響達(dá)極顯著水平、對(duì)8 月葉綠素b 含量的影響達(dá)極顯著水平、對(duì)8 月和10 月葉綠素（a + b）含量的影響達(dá)極顯著水平、對(duì)10 月和12 月葉綠素a/b 的影響達(dá)極顯著水平（P＜0.01），而對(duì)8 月和12 月葉綠素b、12 月葉綠素（a + b）含量均無(wú)顯著影響。從P 葉面噴施單個(gè)因素來(lái)看，對(duì)各月的葉綠素b 含量均無(wú)顯著影響，對(duì)葉綠素a 含量影響在8 月和10 月達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），在12月達(dá)顯著水平（P＜0.05）?？傮w來(lái)看，N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量影響明顯，且隨著時(shí)間推移發(fā)生改變。

2.2 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量的影響

2.2.1 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a 含量的影響

由圖1 可知，N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a 含量有不同程度的影響。8 月，處理3、4、5 的葉綠素a 含量均高于處理1，處理3 最高，處理9 最低。10 月，所有施肥處理葉綠素a 含量均大于處理1，處理9 中最大為13.407 mg/g，處理1 中最小。12 月，處理4、7、8、9 的葉綠素a 含量均大于處理1，處理4 最大，處理6 最?。?.122 mg/g）。綜合來(lái)看，在測(cè)定時(shí)期內(nèi)，處理4 葉綠素a 含量均大于處理1，即處理4（中N低P）對(duì)云南松苗木葉綠素a 含量產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。

圖 1 各處理間葉綠素a 含量的動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 1 The dynamic change of chlorophyll a content among different treatments

2.2.2 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素b 含量的影響

由圖2 可知，N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素b 的含量也有一定的影響。其中，8 月各處理的葉綠素b 波動(dòng)于3.220～4.600 mg/g，以處理5 最高、處理6 最低，處理2、6、8、9 的葉綠素b 含量均小于處理1。10 月，所有施肥處理中葉綠素b 含量均大于處理1，且在處理2 中觀測(cè)到最大值5.237 mg/g，處理1 中觀測(cè)到最小值3.559 mg/g。12 月，處理2、6 的葉綠素b 含量小于處理1，以處理4 最高、處理6 最低。綜合來(lái)看，在整個(gè)試驗(yàn)周期中，處理3、4、5、7 的葉綠素b 含量均大于處理1，以處理4 最大，即處理4（中N低P）對(duì)云南松苗木葉綠素b 含量促進(jìn)作用明顯。

圖 2 各處理間葉綠素b 含量的動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 2 The dynamic change of chlorophyll b content among different treatments

2.2.3 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a/b 含量的影響

由圖3 可知，8 月，處理2、6、7、8、9 的葉綠素（a + b）含量均小于處理1，以處理3 最大，處理9 最小。10 月，所有試驗(yàn)處理中葉綠素（a + b）含量均大于處理1，處理9 中觀測(cè)到最大值18.605 mg/g，處理1 中觀測(cè)到最小值11.684 mg/g。12 月，處理4、7、8、9 均大于處理1，以處理4 最高、處理6 最小。綜上來(lái)看，處理4（中N 低P）最佳，對(duì)云南松苗木葉綠素（a + b）含量產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。

圖 3 各處理間葉綠素（a + b）含量動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 3 The dynamic change of chlorophyll (a + b) content among different treatments

2.2.4 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a/b 的影響

由圖4 可知，不同N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a/b 有影響。其中在8 月，除處理2 中葉綠素a/b 含量大于處理1，其他處理均小于處理1，處理2 中觀測(cè)到最大值3.146，處理7 中觀測(cè)到最小值2.338。10 月，所有試驗(yàn)處理中葉綠素a/b 均大于處理1，以處理5 最大，處理1 最小。12 月，除了處理9 中葉綠素a/b 大于處理1，其他處理均小于處理1，且以處理9 最大，處理5 最小。綜上所述，8 月和10 月的處理2 以及10 月和12 月的處理9 中葉綠素a/b 大于處理1，其中，6—8 月處理2 中的葉綠素a/b 含量存在最大值，處理2、3、4、5、6、7、8 的葉綠素a/b 除了在10 月大于處理1 之外，其余均小于處理1。

圖 4 各處理間葉綠素a/b 的動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 4 The dynamic change of chlorophyll a/b content among different treatments

2.3 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a/b 含量間的相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系分析

由表2 可知，云南松苗木葉綠素a 含量與葉綠素b 含量間的相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系隨觀測(cè)時(shí)間發(fā)生變化，其中處理4 在8 月、10 月、12 月均表現(xiàn)為異速生長(zhǎng)關(guān)系，處理7 則表現(xiàn)為等速生長(zhǎng)關(guān)系。處理2 和處理3 在8 月、10 月均為等速生長(zhǎng)關(guān)系，12 月為異速生長(zhǎng)關(guān)系。處理5 和處理9 在8 月、10 月均為異速生長(zhǎng)關(guān)系，在12 月為等速生長(zhǎng)關(guān)系。處理1 在8 月為等速生長(zhǎng)關(guān)系，在10 月和12 月為異速生長(zhǎng)關(guān)系。

各處理在不同測(cè)定時(shí)間的斜率也發(fā)生變化，除處理7、8、9 外，其他處理的相對(duì)積累速率隨測(cè)定時(shí)間發(fā)生變化，其中處理8 在8 月、10 月、12 月均表現(xiàn)為大于1，即葉綠素a 含量的積累速率大于葉綠素b 含量；處理7、9 在8 月、10 月、12 月均表現(xiàn)為小于1，即葉綠素a 含量的積累速率小于葉綠素b 含量。其余的處理均隨苗木生長(zhǎng)發(fā)生變化。處理1、2、3 隨測(cè)定時(shí)間表現(xiàn)為：8 月斜率小于1、10 月斜率大于1、12 月斜率小于1。處理4、6 在8 月的斜率大于1 而在10 月和12 月均小于1，處理5 在8 月和10 月的斜率小于1 而在12 月大于1。綜合來(lái)看，施肥改變?nèi)~綠素a 含量和葉綠素b 含量的積累速率，且這種相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系隨時(shí)間會(huì)發(fā)生改變，在單施P 的情況下（處理1、2、3）葉綠素a 含量的積累速率相對(duì)于葉綠素b 含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而在單施N 或N、P 配施情況下變化較為復(fù)雜。

表 2 云南松苗木葉綠素a/b 含量間的異速生長(zhǎng)關(guān)系Table 2 The allometric relationship between chlorophyll a and chlorophyll b content of P. yunnanensis seedlings

2.4 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量的主導(dǎo)因子分析

由表3 可知，N、P 都對(duì)云南松苗木葉綠素a 含量起到了不同程度影響，其中，8 月、10 月、12 月的主導(dǎo)因子均為N，促進(jìn)云南松葉綠素a 含量增加的理論最佳水平組合分別為N3P1、N3P3和N1P3。從葉綠素b 含量來(lái)看，8 月、10 月的主導(dǎo)因子均為N，12 月的主導(dǎo)因子為P，促進(jìn)云南松葉綠素b 含量增加的最優(yōu)水平組合分別為N3P2、N1P3和N3P3。從葉綠素（a + b）含量來(lái)看，8 月、10 月、12 月的主導(dǎo)因子均為N，理論最優(yōu)水平組合分別為N3P1、N1P3、N3P3。從葉綠素a/b 來(lái)看，8 月和10 月主導(dǎo)因子為P、12 月的主導(dǎo)因子為N，總體各水平間差異較少。綜合來(lái)看，對(duì)葉綠素影響的主導(dǎo)因素以N 為主。

表 3 N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素的極差分析Table 3 Range analysis of chlorophyll of P. yunnanensisseedlings by foliar spraying of nitrogen and phosphorus

2.5 云南松苗木N、P 葉面噴施肥料效應(yīng)與最佳施肥量的確定

由表4 可知，所構(gòu)建的苗木葉綠素含量與肥料用量的二元二次回歸方程，葉綠素a 含量的方程為Y=11.68 + 4.837N-4.154P-12.657N2+ 11.785P2-13.399N × P，葉綠素b 含量的方程為Y=3.781 +3.579N-0.875P-4.191N2+ 4.525P2-9.13N × P。進(jìn)一步對(duì)方程進(jìn)行降維可知，2 年生云南松適宜的N、P 濃度施用范圍分別為N：0.20%～0.43%，P：0.10～0.17%，單施下的理論產(chǎn)值，對(duì)于葉綠素a 而言，適宜的N、P 配比（質(zhì)量比）為0.20∶0.17；對(duì)于葉綠素b 而言，適宜的N、P 質(zhì)量比為0.43∶0.10。

表 4 N、P 用量與葉綠素含量間的回歸方程Table 4 Regression equation between nitrogen, phosphorus consumption and chlorophyll content

3 結(jié)論與討論

N、P 是植物的基本營(yíng)養(yǎng)元素，其中N 元素是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)和蛋白質(zhì)構(gòu)成的重要成分，P 是遺傳物質(zhì)、生物膜、核糖體和能量載體等的組成成分[23]，與植物的光合作用密切相關(guān)，而光合作用與葉綠素含量有著密切的聯(lián)系。本研究表明，不同N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量具有明顯的影響，其中處理4 可提高葉綠素a 含量、葉綠素b 含量和葉綠素（a + b）含量，這在其他植物的葉面噴施中也有類似的報(bào)道[6]，N、P 添加對(duì)葉綠素含量有一定的促進(jìn)作用。但N、P 噴施用量不同，其表現(xiàn)的作用有所差異，前期云南松及相關(guān)研究中也有報(bào)道[8-11,17,19]，一定N、P 用量可提高葉綠素含量，而高濃度下作用不明顯[10-11,19]，適宜外源N 可以提高葉綠素含量，進(jìn)而增強(qiáng)植物的光合能力，但高N 水平光合速率反而下降，可能是N 導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)失衡或自遮蔽產(chǎn)生了負(fù)面效應(yīng)[10,24]。但隨著苗木的生長(zhǎng)，不同N、P 添加處理對(duì)葉綠素含量的影響也發(fā)生一定的變化，這可能是因?yàn)橹参餇I(yíng)養(yǎng)需求具有明顯的階段性[16]。當(dāng)然，葉綠素受環(huán)境影響較大，是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀[5-7]，有必要繼續(xù)跟蹤調(diào)查，并針對(duì)苗木的光合特性，進(jìn)一步開(kāi)展苗木生長(zhǎng)、葉綠素含量等之間的遺傳剖析。

環(huán)境中有限的N、P 往往會(huì)成為限制生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的因素[25]，其中N 含量的高低決定著植物生長(zhǎng)速率的快慢[26]。本研究分析表明，對(duì)云南松苗木葉綠素影響的主導(dǎo)因子為N，這可能與N 素添加提高葉綠素、保留葉綠體結(jié)構(gòu)等有關(guān)[24,27-28]。N 是植物光合作用及生長(zhǎng)的限制因子，梁文斌等[24]研究表明，N 添加可以增加植物的可利用N，在一定范圍內(nèi)，植物的光合速率隨葉片N 含量的增加呈線性增加，進(jìn)而有利于植物碳的積累和生產(chǎn)力的增加[9]。胡玉玲等[16]利用N、P、鉀（K）等多種元素的肥料對(duì)油茶（Camelliaoleifera）進(jìn)行葉面噴施結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)階段施肥對(duì)油茶葉片葉綠素含量的影響最大，各試驗(yàn)因素對(duì)油茶葉片葉綠素含量都存在顯著影響，其中N 肥的作用較為明顯，施N 肥可以明顯提高植物葉片葉綠素含量[29-30]。在云南松的研究中也表明，N 受限比較明顯[31-32]，土壤中N 素營(yíng)養(yǎng)較缺乏，這也體現(xiàn)了N 素是植物重要的營(yíng)養(yǎng)元素[16,33]，同時(shí)也是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素等的重要組成部分[33]，N 參與影響葉綠素的生物合成，一定量的N 條件下，葉綠素合成途徑暢通，葉綠體結(jié)構(gòu)完整，葉綠素含量增加[27,34-35]。

葉綠素含量間的相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系分析表明，N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素a 含量與葉綠素b 含量間相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系的影響隨時(shí)間發(fā)生變化，各處理在不同測(cè)定時(shí)間的斜率也發(fā)生變化，這種異速生長(zhǎng)關(guān)系反映了各屬性之間的表型可塑性[36]，從前期的變異來(lái)源分析可以看出，葉綠素a 含量在各測(cè)定階段N、P、N × P 下均表現(xiàn)為各處理間差異顯著或極顯著，而葉綠素b 含量在N × P 下表現(xiàn)為各處理間差異極顯著，而在P 下無(wú)顯著差異，在N 下僅10 月為差異極顯著。由此表明，葉綠素a 含量與葉綠素b 含量對(duì)N、P 葉面噴施的響應(yīng)不一樣，葉綠素a 的變化較為敏感，這種可塑性體現(xiàn)在葉綠素a 與葉綠素b 間的相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系發(fā)生改變，且這種變化隨苗木生長(zhǎng)也有所不同[37]。因此，苗木各階段的葉綠素a/b 也發(fā)生改變，造成這種差異性的原因有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，N、P 葉面噴施對(duì)云南松苗木葉綠素含量有影響，且不同N、P 施用量對(duì)葉綠素含量的影響不同，適宜的N、P 用量可提高云南松苗木葉綠素含量。從N、P 兩因素影響效應(yīng)上來(lái)看，N 對(duì)綠素a 含量、葉綠素b 含量及其葉綠素（a + b）含量的影響大于P，N 起是影響葉綠素含量的主導(dǎo)因子。不同N、P 葉面噴施也影響了葉綠素a 含量與葉綠素b 含量間的相對(duì)生長(zhǎng)關(guān)系，且隨苗木的生長(zhǎng)發(fā)生變化。構(gòu)建了N、P 用量與葉綠素含量間的回歸方程，2 年生云南松適宜的N、P 質(zhì)量濃度施用范圍分別為N：0.20%～0.43%，P：0.10%～0.17%。