沈西偉 湯志遠 申嫻娟 趙建美

（1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，江蘇南通 226001；4.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通 226001）

川崎?。↘awasaki disease，KD）常伴有血小板增多，好發(fā)于KD 第2～3 周。血小板升高增加冠狀動脈瘤血栓形成、心肌梗死和死亡的風(fēng)險［1-2］。反應(yīng)性血小板增多癥（reactive thrombocytosis，RT）指外周血中血小板計數(shù)＞450×109/L，最常見病因是感染和KD。RT 發(fā)病機制主要是血小板生成增加，主要與血小板生成素（thrombopoietin，TPO）升高有關(guān)［2-3］。但是，Ishiguro等［4］發(fā)現(xiàn)KD病程中血小板計數(shù)正常的患兒TPO水平高于健康對照組；在KD 第1 周血小板計數(shù)正常時，血清TPO 水平升高；當(dāng)KD 第2 周血小板計數(shù)明顯升高達峰值時，TPO 水平?jīng)]有下降；KD 第3 周時TPO 水平與健康對照組相當(dāng)。Miura 等［5］發(fā)現(xiàn)KD 患兒在起病第3周血小板計數(shù)明顯升高，TPO水平卻在第2周時下降。Alberio［6］發(fā)現(xiàn)RT 與TPO 之間沒有明顯相關(guān)性。這些研究［4-6］表明KD 患兒血小板增多的機制尚不清楚。

血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF） 成員包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD 等。其中，PDGF-BB 與血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）結(jié)合，促進造血干細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞等增殖，而酪氨酸酶抑制劑如伊馬替尼能夠抑制PDGFR 活性［7］。PDGF-BB/PDGFR-β信號通路與造血系統(tǒng)關(guān)系密切。Kaminski等［8］證明敲除小鼠PDGF-BB和PDGFR-β基因可誘發(fā)血小板減少癥。楊默等［9］證實PDGF-BB/PDGFR-β 能促進造血干細胞增殖及血小板生成。周麗霞等［10］發(fā)現(xiàn)PDGF-BB/PDGFR-β 在原發(fā)性血小板增多癥中高表達。然而，目前關(guān)于KD患兒血小板增多的機制尚不明確。因此，本研究首先在臨床層面探究PDGF-BB 在KD 患兒急性期是否升高；其次，在動物層面驗證PDGF-BB在KD小鼠中的表達情況及其在血小板生成中的作用；最后，在細胞層面探究PDGF-BB對Dami細胞生成血小板的機制，為KD診治尋找新的策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年9 月—2022 年10 月我院兒內(nèi)科住院的40 例KD 患兒為KD 組，其中男23 例（58%）、女17 例（42%）；年齡從3 個月至9 歲，平均年齡為（35±23）個月。納入標準：（1）符合KD 診斷標準［11］；（2）病程7 d以內(nèi)；（3）靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）2 g/kg 單次治療后體溫正常；（4）臨床資料完整。排除標準：（1）入院前接受IVIG、糖皮質(zhì)激素、阿司匹林治療者；（2）腫瘤及免疫性疾病者。

選取同期在體檢中心體檢且無感染史的健康兒童40例為健康對照組，其中男26例（65%）、女14 例（35%）；年齡從1 個月至9 歲，平均年齡為（37±24）個月。兩組在年齡（t=0.438，P=0.662）、性別（χ2=0.474，P=0.491）上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準（2018-K021）及家長簽署知情同意書。

1.2 細胞和試劑

Dami 細胞株（北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，中國）；胎牛血清（北京沃卡威生物技術(shù)有限公司）；CCK-8 試劑（蘭杰柯科技有限公司，中國）；重組人PDGF-BB（PeproTech，美國）；伊馬替尼（上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司，中國）；Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡試劑盒、FITC 標記的抗小鼠CD41抗體（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司， 中國）； FITC 標記的抗人CD61 抗體（eBioscience，美國）；人PDGF、小鼠PDGF-BB 及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒（上海源桔生物科技公司，中國）；HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR 、ChamQ SYBR qPCR Master PCR（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國）；乙酰膽堿酯酶染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國）；兔抗人Akt、p-Akt及鼠抗人β-actin 抗體（Proteintech，美國）；山羊抗兔、山羊抗小鼠熒光二抗（Cell Signaling Technology，美國）。

1.3 ELISA檢測PDGF表達

收集KD組入院次日清晨和健康對照組兒童空腹全血3 mL，分離上清凍存于-80℃。ELISA 試劑盒常溫冷卻，按說明書操作，計算PDGF濃度。

1.4 實驗動物及分組

SPF 級3～4 周齡雄性C57BL/6 小鼠90 只［生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2020-0009，使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0046］，平均體重13～15 g，購于江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技公司，飼養(yǎng)溫度20～23℃，濕度50%～60%，12 h 明暗光交替，自由飲水與進食。獲南通大學(xué)倫理委員會批準（IACUC 20220829-1001）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后將小鼠隨機分為3 組：正常組、KD 組和伊馬替尼組，每組各30只。

1.5 構(gòu)建KD小鼠模型

參考Duong等［12］KD造模方法。KD組于第1天以干酪乳桿菌細胞壁提取物0.25 mL（0.5 mg）腹腔注射1次。伊馬替尼組于第1天以干酪乳桿菌細胞壁提取物 0.25 mL（0.5 mg）腹腔注射1 次，第2天起以伊馬替尼溶液（50 mg/kg）灌胃，1 次/d，持續(xù)27 d。正常組第1天腹腔注射等量磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS），然后與KD組于第2 天起分別用等量PBS 灌胃，1 次/d，持續(xù)27 d。

1.6 心臟組織蘇木精-伊紅染色

第14 天每組隨機取5 只小鼠的心臟組織，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色后，鏡下觀察心臟組織，使用Image J 軟件分析炎性細胞數(shù)量［13］。

1.7 小鼠血常規(guī)和細胞因子檢測

每組隨機取5 只小鼠分別于第0 天行眼眶取血，第3、7、14、21、28天摘眼球取血，將50 μL血樣置于抗凝管中，行血常規(guī)檢測；其余血樣離心收集血清，保存-80℃冰箱中，ELISA 檢測PDGF-BB及TNF-α。

1.8 小鼠骨髓巨核細胞集落形成單位培養(yǎng)及巨核細胞標記物CD41檢測

第21 天每組隨機取5 只小鼠頸椎脫臼法處死后，取雙側(cè)股骨，消毒后用5 mL 注射器吸取4 mL IMDM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，離心收集細胞。取骨髓細胞2×105/mL接種于6孔板中培養(yǎng)7 d（1 mL培養(yǎng)體系為IMDM 培養(yǎng)基0.6 mL、1%牛血清白蛋白0.1 mL、0.34 mg 氯化鈣、10% 牛血漿0.1 mL、50 ng/mL TPO 10 μL）。培養(yǎng)結(jié)束后干燥。每孔2 mL 1%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗后干燥。乙酰膽堿酯酶染色液室溫染色4 h 后以50%甲醇、PBS洗滌1次，鏡下計數(shù)骨髓巨核細胞集落形成單位（megakaryocyte colony forming unit，CFU-MK）。

CD41 是巨核細胞分化成熟標記物。取適量骨髓細胞，100 μL PBS 重懸，加入CD41 單抗5 μL，避光孵育20 min后上機檢測。

1.9 細胞培養(yǎng)

Dami 細胞種植于T25 培養(yǎng)瓶中，用含13%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.10 CCK-8細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期的Dami 細胞接種于96 孔板。PDGF-BB 按0、6.25、12.5、25、50、100 ng/mL 與細胞共培養(yǎng)，在24、48、72 h 時加入10 μL CCK-8試劑，孵育3 h 后酶標儀檢測450 nm 處吸光度值。實驗獨立重復(fù)至少3次。

1.11 血小板生成實驗及其標記物CD61檢測

將PDGF-BB按0、12.5、25、50、100 ng/mL與細胞共培養(yǎng)24 h，PDGF-BB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L 與細胞共培養(yǎng)24 h。800 r/min 離心10 min 收集上清，2 500 r/min 離心10 min 收集沉淀即血小板。100 μL PBS 重懸血小板后，用自動血液細胞分析儀檢測血小板數(shù)量。CD61 是血小板表面標記物。將PDGF-BB 按6.25、25、100 ng/mL 與細胞共培養(yǎng)24 h，用上述同樣方法收集血小板，加入CD61 單抗及同型抗體各0.25 μg，避光孵育20 min后上機檢測。實驗獨立重復(fù)至少3次。

本部分實驗分為對照組、KD 組和伊馬替尼組。對照組用含10%正常兒童血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；KD 組和伊馬替尼組用含10% KD 急性期患兒血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，后者同時添加伊馬替尼（20 μmol/L）。培養(yǎng)24 h后用上述同樣方法收集檢測血小板數(shù)量。實驗獨立重復(fù)至少3次。

1.12 實時定量PCR檢測PDGFR mRNA表達

本部分實驗分為對照組、PDGF-BB（25 ng/mL）組、伊馬替尼（20 μmol/L）組和聯(lián)合組（PDGFBB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L），培養(yǎng)細胞24 h后提取RNA。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，按PCR 試劑盒進行PCR 反應(yīng)。 引物序列如下， PDGFR- α： 上游5'-GCTTGAAGGCA-GGCACATTTACATC-3'， 下游5'-AAGGTTACA-GGAGTCTCGGGATCAG-3'； PDGFRβ：上游5'-CCAGAAGCCATCAGCAGCAAGG-3'，下游5'-CGAGCAGGTCAGAACGAAGGTG-3'；β-actin：上游 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'， 下游 5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。采用2-ΔΔCt計算結(jié)果。實驗獨立重復(fù)至少3次。

1.13 Western blot檢測蛋白表達

本部分實驗分為對照組、PDGF-BB（25 ng/mL）組、伊馬替尼（20 μmol/L）組和聯(lián)合組（PDGFBB 25 ng/mL+伊馬替尼20 μmol/L）。培養(yǎng)細胞24 h后RIPA 裂解液提取蛋白，通過SDS-PAGE 電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，快速封閉液室溫封閉10 min， 加入一抗Akt、 p-Akt （濃度均為1∶5 000）、β-actin（1∶10 000），4℃過夜。洗膜后室溫孵育熒光二抗（1∶10 000）1 h，洗膜后顯影。實驗獨立重復(fù)至少3次。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，兩組間比較采用Student'st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清PDGF與血常規(guī)指標比較

與健康對照組相比，KD 組血清PDGF-BB、白細胞計數(shù)、中性粒細胞絕對值及血小板計數(shù)增高（P＜0.001），紅細胞計數(shù)及血紅蛋白水平降低（P＜0.05）。兩組PDGF-AA、PDGF-CC、PDGF-DD水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組兒童血清PDGF與血常規(guī)指標比較 （± s）

表1 兩組兒童血清PDGF與血常規(guī)指標比較 （± s）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子；［KD］川崎病。

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2.2 KD 組患兒血清PDGF-BB 與血常規(guī)指標的相關(guān)性分析

KD組患兒急性期血清PDGF-BB與血小板計數(shù)呈正相關(guān)（r=0.397，P＜0.05），見表2。

表2 KD組患兒血清PDGF-BB與血常規(guī)指標的相關(guān)性分析（n=40）

2.3 小鼠冠狀動脈病理學(xué)變化

與正常組相比，KD 組冠狀動脈炎癥細胞數(shù)量增多（P＜0.001）；與KD 組相比，伊馬替尼組冠狀動脈炎癥細胞數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠冠狀動脈炎癥細胞數(shù)量比較 （± s，n=5）

表3 各組小鼠冠狀動脈炎癥細胞數(shù)量比較 （± s，n=5）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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2.4 小鼠血常規(guī)及血清細胞因子比較

與正常組相比，KD組白細胞計數(shù)第3、7、14天時升高（P＜0.05），血小板計數(shù)第7、14、21 天時升高（P＜0.001），紅細胞計數(shù)、血紅蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與KD組相比，伊馬替尼組白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），血小板計數(shù)第14、21天時降低（P＜0.001）。見表4～7。

表4 各組小鼠外周血白細胞計數(shù)比較 （± s，n=5，×109/L）

表4 各組小鼠外周血白細胞計數(shù)比較 （± s，n=5，×109/L）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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表5 各組小鼠外周血紅細胞計數(shù)比較 （± s，n=5，×1012/L）

表5 各組小鼠外周血紅細胞計數(shù)比較 （± s，n=5，×1012/L）

注：［KD］川崎病。

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表6 各組小鼠外周血血紅蛋白水平比較 （± s，n=5，g/L）

表6 各組小鼠外周血血紅蛋白水平比較 （± s，n=5，g/L）

注：［KD］川崎病。

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表7 各組小鼠外周血血小板計數(shù)比較 （± s，n=5，×109/L）

表7 各組小鼠外周血血小板計數(shù)比較 （± s，n=5，×109/L）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05；b示與KD組比較，P＜0.05。

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與正常組相比，KD 組第3、7、14、21 天時PDGF-BB、TNF-α濃度升高（P＜0.05）；與KD組相比，伊馬替尼組PDGF-BB、TNF-α 變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表8～9。

表8 各組小鼠血清PDGF-BB濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

表8 各組小鼠血清PDGF-BB濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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表9 各組小鼠血清TNF-α濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

表9 各組小鼠血清TNF-α濃度比較 （± s，n=5，pg/mL）

注：［KD］川崎病。a示與正常組比較，P＜0.05。

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2.5 各組小鼠CFU-MK 及巨核細胞標記物CD41的比較

KD 組CFU-MK 數(shù)量高于正常組（P＜0.001），伊馬替尼組CFU-MK 數(shù)量低于KD 組（P＜0.001）。KD組CD41表達高于正常組（P＜0.001），伊馬替尼組CD41表達低于KD組（P＜0.001）。見表10。

表10 各組小鼠CFU-MK數(shù)量、CD41表達的比較（± s）

表10 各組小鼠CFU-MK數(shù)量、CD41表達的比較（± s）

注：［KD］川崎??；［CFU-MK］巨核細胞集落形成單位。a示與正常組比較，P＜0.001；b示與KD組比較，P＜0.001。

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2.6 PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響

PDGF-BB與Dami細胞共培養(yǎng)24、48、72 h后，PDGF-BB 對Dami 細胞的增殖作用與其濃度有關(guān)。24 h、72 h時PDGF-BB 25 ng/mL促進細胞增殖的作用最顯著（P＜0.05）；48 h 時PDGF-BB 25 ng/mL 促進細胞增殖的作用與PDGF-BB 12.5 ng/mL 相當(dāng)，優(yōu)于其他濃度組（P＜0.05）。見表11。

表11 不同濃度PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響（± s，n=5）

表11 不同濃度PDGF-BB對Dami細胞增殖的影響（± s，n=5）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a示與0 ng/mL組比較，P＜0.05；b 示與6.25 ng/mL 組比較，P＜0.05；c 示與12.5 ng/mL 組比較，P＜0.05；d示與25 ng/mL組比較，P＜0.05。

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2.7 KD 急性期患兒血清與PDGF-BB 對血小板生成的影響

Dami 細胞單獨培養(yǎng)時，未檢測到血小板。與對照組相比，KD組血小板生成增加，加入伊馬替尼后血小板生成減少（P＜0.05）。不同濃度的PDGF-BB 可誘導(dǎo)Dami 細胞生成血小板，PDGF-BB 25 ng/mL 加入伊馬替尼后血小板生成減少（P＜0.001）。見表12～13。

表12 KD急性期患兒血清對血小板生成的影響（± s，n=5）

表12 KD急性期患兒血清對血小板生成的影響（± s，n=5）

注：［KD］川崎病。a 示與對照組比較，P＜0.001；b 示與KD組比較，P＜0.05。

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表13 PDGF-BB對血小板生成的影響 （± s，n=5）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a示與0 ng/mL組比較，P＜0.001；b示與25 ng/mL組比較，P＜0.001。

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2.8 PDGF-BB對血小板標記物CD61的影響

PDGF-BB 6.25、25、100 ng/mL 作用于Dami 細胞24 h后，CD61表達比例分別為（14.4±1.2）%、（25.3±4.4）%、（18.4±1.6）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.850，P=0.008）。經(jīng)組間兩兩比較，25 ng/mL 組CD61 表達比例高于6.25 ng/mL 組（P＜0.05）。

2.9 PDGF-BB 對Dami 細胞PDGFR mRNA 的影響

與對照組相比，PDGF-BB 組PDGFR-α mRNA表達無顯著變化（P＞0.05），PDGFR-β mRNA 表達增加，加入伊馬替尼后PDGFR-β mRNA 表達下調(diào)（P＜0.05），見表14。

表14 各組Dami細胞PDGFR mRNA相對表達量的比較（± s，n=3）

表14 各組Dami細胞PDGFR mRNA相對表達量的比較（± s，n=3）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子；［PDGFR］血小板衍生生長因子受體。a示與對照組比較，P＜0.05；b示與PDGF-BB組比較，P＜0.05。

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2.10 PDGF-BB 對Dami 細胞PI3K/Akt 通路的影響

與對照組相比，PDGF-BB組Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），p-Akt 蛋白表達增加（P＜0.05）；與PDGF-BB組相比，聯(lián)合組Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），p-Akt蛋白表達下調(diào)（P＜0.05）。見圖1、表15。

圖1 Western blot 檢測各組Dami 細胞中Akt、p-Akt蛋白表達電泳圖 1：對照組；2：PDGF-BB 組；3：伊馬替尼組；4：聯(lián)合組。

表15 各組Dami細胞Akt、p-Akt蛋白相對表達量的比較（± s，n=3）

表15 各組Dami細胞Akt、p-Akt蛋白相對表達量的比較（± s，n=3）

注：［PDGF］血小板衍生生長因子。a 示與對照組比較，P＜0.05；b示與PDGF-BB組比較，P＜0.05。

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3 討論

本研究通過病例研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB在KD患兒急性期血清中高表達，與血小板計數(shù)呈正相關(guān)，提示PDGF-BB可能參與血小板生成。通過KD小鼠模型，證實PDGF-BB在KD小鼠中高表達，并促進CFU-MK形成、巨核細胞分化及血小板生成。通過細胞實驗證實Dami細胞在PDGF-BB誘導(dǎo)下高表達PDGFR-β mRNA 及p-Akt 蛋白，伊馬替尼抑制PDGFR-β 后，下調(diào)巨核細胞CD41、PDGFR-β mRNA 及p-Akt 蛋白表達，影響血小板生成。這與羅毅等［14］證實PDGF-BB在骨髓抑制小鼠模型中促進巨核細胞增殖和血小板生成的結(jié)論相符合。

PDGFR 屬于受體酪氨酸酶，受到刺激時表達增加［15］。Yang 等［16］證實Dami 細胞表達PDGFR-α和PDGFR-β。當(dāng)PDGFR-α 和PDGFR-β 同時存在時，PDGF-BB優(yōu)先與PDGFR-β結(jié)合［17］。研究發(fā)現(xiàn)PDGFR 抑制劑伊馬替尼可導(dǎo)致血小板減少［18］。機制可能是伊馬替尼抑制PDGFR-β，阻滯PI3K/Akt信號通路，影響巨核細胞增殖及血小板生成［19-20］。

盡管血小板計數(shù)升高反映KD炎癥與疾病的嚴重程度，但本研究發(fā)現(xiàn)抑制PDGFR 導(dǎo)致血小板計數(shù)減少并未減輕KD 炎癥，原因可能是KD 主要由異常的免疫激活、細胞因子風(fēng)暴、內(nèi)皮細胞損傷等多種因素引起［1］，而PDGF-BB/PDGFR 只是眾多細胞因子網(wǎng)絡(luò)通路中的一員，單獨抑制PDGFR 可能不會直接減輕KD冠狀動脈炎癥。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實驗，初步探究了PDGF-BB在KD血小板增多中的作用。PDGFBB 可能通過與PDGFR-β 結(jié)合，激活PI3K/Akt 通路，促進巨核細胞的增殖、分化，調(diào)節(jié)血小板的生成，而伊馬替尼能對抗PDGF-BB的促增殖作用、減少血小板的生成，這為KD的治療提供了一個新的靶點。本研究仍有不足之處，由于骨髓中的巨核細胞數(shù)量非常少，無法為實驗提供穩(wěn)定的原代細胞來源，研究的借鑒意義相對受限；同時細胞之間的信號通路復(fù)雜有待進一步的研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。