周文杰, 呂 剛, 劉華芬

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院, 1. 心內(nèi)科導(dǎo)管室, 2. 麻醉科, 湖北 武漢, 430060)

膿毒癥是感染導(dǎo)致的宿主免疫反應(yīng)失衡引起的臨床綜合征[1], 在膿毒癥期間,許多重要器官均會受累,其中心血管系統(tǒng)是膿毒癥常見的損傷系統(tǒng)。膿毒癥引起的心肌功能障礙主要表現(xiàn)為左室舒張功能不全和射血分數(shù)降低[2]。存在膿毒癥心肌損傷的患者病病死率較高[3],因此尋找一種減輕膿毒癥期間心肌功能障礙的治療方法十分重要。大車前苷是傳統(tǒng)中藥車前草中的活性成分,大車前苷具有多種生物活性,如抗氧化、抗炎、抗凋亡以及抗腫瘤作用[4-6]。既往研究[7]表明,大車前苷可通過組蛋白脫乙?；?(HDAC2)與蛋白激酶B(AKT)途徑減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌肥厚。但關(guān)于大車前苷對于膿毒癥心肌損傷的作用尚未闡明,因此,本研究探討大車前苷在膿毒癥心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

大車前苷(貨號HY-N0031)購于美國MedChemExpress生物科技公司,高效液相色譜法檢測其純度>98%。脂多糖(貨號SMB00610)購于美國Sigma公司,該藥物用于膿毒癥模型的制作; 提取RNA的Trizol試劑(貨號 15596)購于美國Thermo Scientific公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號4896866001)以及SYBRGreen I Master(貨號 4913914001)購自瑞士羅氏公司; ApopTag熒光素原位凋亡檢測試劑盒(貨號 S7110, Millipore)購于Merck公司; 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)檢測試劑盒(貨號 A003-1-1)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(貨號 A020-2-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性檢測試劑盒(貨號 G015-1)均購于南京建成生物工程研究所。心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測試劑盒(貨號SEA478Mu)購于武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。4-羥基壬烯醛(4-HNE)檢測試劑盒(貨號 ab238538)購于美國Abcam公司。小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號BMS607-3TEN)、小鼠巨噬細胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA檢測試劑盒(貨號BMS6005)購于美國eBioscience公司。

1.2 模型建立與分組

選取8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠40只,體質(zhì)量為23.5～27.5 g, 購自北京華阜康生物科技股份有限公司,飼養(yǎng)于武漢大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級,恒溫、恒濕, 12 h晝夜節(jié)律,并可自由飲食。本研究涉及的所有動物實驗均通過武漢大學(xué)動物倫理委員會批準。小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按照隨機數(shù)字表法分為4組,每組10只,分別為生理鹽水+生理鹽水組、生理鹽水+大車前苷組、脂多糖+生理鹽水組、脂多糖+大車前苷組。脂多糖+生理鹽水組與脂多糖+大車前苷組小鼠接受單次腹腔注射脂多糖(10 mg/kg)構(gòu)建小鼠膿毒癥模型,生理鹽水+生理鹽水組與生理鹽水+大車前苷組小鼠接受同等體積生理鹽水腹腔注射。生理鹽水+大車前苷組與脂多糖+大車前苷組小鼠進行連續(xù)5 d的大車前苷50 mg/(kg·d)灌胃干預(yù),生理鹽水+生理鹽水組與脂多糖+生理鹽水組進行同等體積生理鹽水灌胃。實驗第1天,生理鹽水+大車前苷組小鼠給予連續(xù)5 d的大車前苷 50 mg/(kg·d)灌胃干預(yù),生理鹽水+生理鹽水組進行同等體積生理鹽水灌胃。實驗開始第1天,生理鹽水+大車前苷組小鼠連續(xù)5 d灌胃給予大車前苷(50 mg/kg), 生理鹽水+生理鹽水組小鼠給予同等體積生理鹽水灌胃; 灌胃第5天,脂多糖+生理鹽水組小鼠給予脂多糖(10 mg/kg)單次腹腔注射,生理鹽水+生理鹽水組小鼠腹腔注射同體積生理鹽水, 12 h后檢測心功能并取材。

為研究大車前苷對膿毒癥小鼠病死率的影響,另取40只8～10周齡的雄性C57/BL6小鼠,隨機分成同樣4組,連續(xù)進行大車前苷50 mg/(kg·d)或者等體積生理鹽水灌胃5 d, 灌胃第5天單次腹腔注射10 mg/kg脂多糖或者等體積生理鹽水后,繼續(xù)飼養(yǎng)7 d, 并記錄小鼠死亡情況。

1.3 心功能檢測及取材

小鼠脂多糖腹腔注射12 h后, 2.5%異氟烷吸入麻醉后,胸前區(qū)備皮下進行心臟超聲檢查,利用Vevo 2100小鼠超聲儀評估小鼠心功能情況。心功能指標包括左室射血分數(shù)和左室短軸縮短率。超聲期間,小鼠置于37 ℃的恒溫墊上,超聲期間避免用力壓迫小鼠胸腔,以免影響小鼠正常心率。完成檢測后處死小鼠并收集血液、心臟標本,用于生化和病理檢測。

1.4 組織TUNEL染色

將小鼠心臟組織石蠟切片脫蠟、水合后,按照ApopTag熒光素原位凋亡檢測試劑盒(貨號 S7110, Millipore)說明書進行檢測,最后用DAPI封片后即可在OlympusDX51熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的陽性信號。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

取左心室組織樣本,用TRIzol裂解液研磨裂解后提取總RNA, 再利用Nanodrop 2000測定所提RNA純度并計算含量,然后利用Transcriptor cDNA Synth Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 利用SYBRGreen I Master進行目的基因[過氧化物歧化酶2(SOD-2)、谷胱甘肽氧化酶1(GPX-1)、過氧化氫酶(CAT)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、TNF-α、MCP-1、白細胞介素-4(IL-4)]的表達檢測。GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 相關(guān)指標引物序列

1.6 生化檢測

獲得血液標本靜置30 min后,以12 000轉(zhuǎn)/min離心15 min后,取上清,然后利用cTnI、LDH試劑盒檢測上清中cTnI以及LDH水平。取50 mg新鮮左心室組織利用勻漿液充分勻漿后,以12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min后,取上清,利用MDA試劑盒、4-HNE試劑盒、TNF-α檢測試劑盒、MCP-1檢測試劑盒以及Caspase-3活性檢測試劑盒檢測相關(guān)因子的表達或者活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心功能和心肌損傷比較

脂多糖+生理鹽水組小鼠的左室射血分數(shù)、左室短軸縮短率以及心率低于生理鹽水+生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖1; 脂多糖腹腔注射后可以導(dǎo)致60%的小鼠死亡,大車前苷治療后(脂多糖+大車前苷組)可提高膿毒癥小鼠存活率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。脂多糖+生理鹽水組小鼠的cTnI和LDH水平高于生理鹽水+生理鹽水組小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)小鼠的cTnI、LDH表達水平低于脂多糖+生理鹽水組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。

A: 小鼠心率; B: 射血分數(shù); C: 左室短軸縮短率; D: 生存率。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖1 各組小鼠心功能比較

A: cTnI水平; B: LDH水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖2 各組小鼠心肌損傷標志物

2.2 各組小鼠心臟氧化應(yīng)激情況比較

脂多糖+生理鹽水組的小鼠MDA、4-HNE水平高于生理鹽水+生理鹽水組小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 與脂多糖+生理鹽水組小鼠相比,大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低心臟中由脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDA和4-HNE的水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖3。與生理鹽水+生理鹽水組小鼠相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠心臟中的SOD-2、GPX-1以及CATmRNA水平降低,經(jīng)過大車前苷處理后,脂多糖導(dǎo)致的SOD-2、GPX-1以及CATmRNA的低表達水平得到恢復(fù),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖4。

A: MDA水平; B: 4-HNE水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖3 各組小鼠心臟MDA、4-HNE相對水平

與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖4 各組小鼠心臟中SOD-2、GPX-1以及CAT的mRNA相對水平

2.3 各組小鼠心臟炎癥情況比較

與生理鹽水+生理鹽水組相比,脂多糖可以明顯誘導(dǎo)小鼠心臟中TNF-α和MCP-1的表達上調(diào)(P<0.05), 經(jīng)過大車前苷處理后, TNF-α和MCP-1的表達水平降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 圖5)。與生理鹽水+生理鹽水組小鼠相比,脂多糖導(dǎo)致小鼠心臟中IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA表達水平升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 與脂多糖+生理鹽水組小鼠相比,大車前苷可以降低脂多糖誘導(dǎo)上調(diào)的IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05, 圖6)。

A: TNF-α相對水平; B: MCP-1相對水平。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖5 各組小鼠心臟中TNF-α以及MCP-1相對水平

2.4 各組小鼠心肌細胞凋亡情況比較

與生理鹽水+生理鹽水組的小鼠相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠心臟中Caspase-3活性上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低脂多糖(脂多糖+生理鹽水組)誘導(dǎo)增加的Caspase-3活性,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TUNEL染色顯示,與生理鹽水+生理鹽水組相比,脂多糖+生理鹽水組小鼠的心肌細胞凋亡水平上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 大車前苷處理(脂多糖+大車前苷組)可以降低脂多糖(脂多糖+生理鹽水組)誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

A: Caspase-3活性相對水平; B: TUNEL陽性率; C: 細胞凋亡情況。與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖7 各組小鼠心臟中Caspase-3活性以及細胞凋亡情況

3 討 論

心肌損傷導(dǎo)致的心肌功能障礙是膿毒癥所致多器官功能衰竭的嚴重并發(fā)癥之一。研究[8-9]報道, 20%～60%的膿毒癥患者有膿毒癥相關(guān)心肌損傷和心功能不全,并且病死率顯著高于未合并心肌損傷的患者[10]。膿毒癥休克是導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)多器官功能障礙的始發(fā)因素,心血管功能障礙與膿毒癥休克的發(fā)生密切相關(guān)。目前,膿毒癥休克的治療方式以抗生素治療和支持治療為主。因此,尋找減輕膿毒癥心肌損傷、減少膿毒癥休克發(fā)生的新療法具有重要意義。

大車前苷是從車前草中分離的活性成分,屬于苯丙苷類糖苷。大車前苷具有明顯抗炎作用,大車前苷可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT); 大車前苷還能抑制誘導(dǎo)的人氣道上皮細

與生理鹽水+生理鹽水組比較, ?P<0.05; 與脂多糖+生理鹽水組比較, #P<0.05。圖6 各組小鼠心臟中IL-1、IL-6、TNF-α、MCP-1以及IL-4的mRNA相對水平

胞的炎癥反應(yīng)和急性肺損傷[11-12]。此外,大車前苷具有顯著的抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用[13-14]。本研究結(jié)果與上述研究一致,大車前苷可以顯著減少炎癥因子的產(chǎn)生,顯著降低心臟氧化應(yīng)激水平、心肌損傷標志物水平和減少心肌細胞凋亡,顯著改善小鼠的心功能。

膿毒癥相關(guān)的心肌損傷與心肌功能障礙的發(fā)生涉及多種機制,包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙以及凋亡等[15-17]。在膿毒癥的病理過程中,機體免疫系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的炎癥因子,這些炎性細胞因子導(dǎo)致心肌周圍中性粒細胞的浸潤,損害 β-腎上腺素能信號傳導(dǎo),擾亂能量代謝,使鈣穩(wěn)態(tài)失衡并刺激一氧化氮(NO)過量產(chǎn)生,最終會導(dǎo)致心肌損傷和心肌收縮力受損[18-19]。除免疫細胞外,心肌細胞本身也會在脂多糖刺激下產(chǎn)生IL-1β和 TNF-α 等炎癥因子[19]。這些細胞因子相互作用形成正反饋回路,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和心功能不全持續(xù)惡化。研究[20-21]表明,抑制炎癥反應(yīng)可以改善膿毒癥引起的心肌損傷。既往研究[11, 13, 22]發(fā)現(xiàn),大車前苷可減輕炎癥反應(yīng),發(fā)揮對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷、氣道上皮細胞損傷以及高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞損傷保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),大車前苷可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的心肌損傷模型中TNF-α、MCP-1、IL-1、IL-4以及IL-6相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平,從而發(fā)揮抗炎作用,減輕脂多糖對心肌的損傷。

氧化應(yīng)激是多種病理狀態(tài)包括感染性疾病中的關(guān)鍵過程。研究[23-24]證明,氧化應(yīng)激可能也是膿毒癥發(fā)病的核心過程。膿毒癥中活性氧(ROS)產(chǎn)生的關(guān)鍵部位是活化的中性粒細胞以及巨噬細胞。在整個炎癥過程中,這些細胞浸潤并釋放出大量的反應(yīng)性物質(zhì)[25]。多器官功能障礙綜合征是患有嚴重膿毒癥患者最嚴重的結(jié)果,其中細胞凋亡和壞死是介導(dǎo)器官衰竭的主要參與者,氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體通透性過渡孔(MPTP)的開放是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),可導(dǎo)致細胞凋亡和壞死的下游途徑激活,細胞發(fā)生死亡,進而導(dǎo)致器官衰竭[26]。本研究發(fā)現(xiàn),大車前苷可以在mRNA水平上恢復(fù)脂多糖導(dǎo)致降低的SOD-2、GPX-1以及CAT的表達,并且在心臟組織中檢測到MDA和4-HNE水平的降低。此外,大車前苷減輕了心肌細胞的凋亡,表現(xiàn)為Caspase-3的活性顯著降低, TUNEL染色細胞陽性率顯著降低。

綜上所述,大車前苷可以減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞損傷,改善心功能。這可能與大車前苷抑制脂多糖所致的炎癥、氧化應(yīng)激以及凋亡相關(guān),但具體的作用機制仍需進一步驗證。