任少華, 張馳強(qiáng), 周鑫偉, 王 陳

(貴州省植物園, 貴陽(yáng) 550004)

香榧(TorreyagrandisFort. ex Lindl. cv. Merrillii)系紅豆杉科榧樹(shù)屬,雌雄異株,是經(jīng)人工培育的我國(guó)特有珍稀干果,集果用、藥用、油用、材用、綠化等一體的綜合性經(jīng)濟(jì)樹(shù)種,浙江、安徽、江西、湖北等地為主要種植區(qū)。目前,香榧的相關(guān)研究主要集中在食用、品種選育、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、病蟲(chóng)害防治[1-5]等領(lǐng)域。余象煜等[6]、湯仲塤等[7]雖然在生殖生物學(xué)方面做了相關(guān)研究,但貴州省作為香榧引種地,對(duì)于引種后的雄球花發(fā)育規(guī)律等未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

有性繁殖是香榧人工造林、雜交育種等的主要方法之一,由于香榧雌雄異株,種子有深度休眠現(xiàn)象,并且樹(shù)體童期較長(zhǎng)[8-9],現(xiàn)香榧多以人工嫁接繁殖為主,但是嫁接所用接穗常從少數(shù)具有優(yōu)良性狀的植株采集,繁育苗木易出現(xiàn)共祖現(xiàn)象,削弱種群間遺傳多樣性。

因此,本研究以香榧基地的優(yōu)良植株為試驗(yàn)材料,采用石蠟切片技術(shù),以引種后的香榧小孢子葉球發(fā)育和小孢子的發(fā)生為研究區(qū)域,擬探討香榧雄株在引種地的開(kāi)花特征,為其生殖生物學(xué)、生殖期管理以及今后的雜交育種研究奠定基礎(chǔ)[10-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)材料為貴州省植物園香榧良種采穗圃?xún)?nèi)的優(yōu)質(zhì)雄株。貴州省植物園位于貴陽(yáng)市北郊7 km處鹿沖關(guān),地處中亞熱帶,地理位置為北緯26°34′,東經(jīng)106°42′,海拔1 210～1 411 m。年平均氣溫為14 ℃,最冷月1月份平均氣溫4.6 ℃,極端最低氣溫-6.4 ℃,最熱月7月份平均氣溫23.8 ℃,極端最高氣溫32.1 ℃,年平均降水量1 200 mm,年平均相對(duì)濕度80%,無(wú)霜期289 d,全年日照時(shí)數(shù)1 174 h。園區(qū)土壤有成土母巖為白云質(zhì)石灰?guī)r、砂巖發(fā)育的黃壤,pH值為5～7。

1.2 試驗(yàn)方法

香榧小孢子葉球外觀形態(tài)觀測(cè),對(duì)試驗(yàn)所選樣株進(jìn)行觀察,記錄其生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程。

樣本采集。小孢子葉球首次出現(xiàn)后,每月采集觀測(cè)株不同方位,生長(zhǎng)良好的10～15個(gè)小孢子葉球?；ㄑ糠只c小孢子發(fā)生早期,每3 d采樣;減數(shù)分裂期,每天采樣。帶回實(shí)驗(yàn)室后,放入冰箱4 ℃保存,備用。運(yùn)用常規(guī)切片制作方法制作石蠟切片,水洗。番紅固綠染色,制作中性樹(shù)膠封片,顯微鏡鏡檢,利用相機(jī)(日本尼康,NIKON DS-U 3)采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子葉球生長(zhǎng)、發(fā)育

經(jīng)試驗(yàn)觀測(cè)發(fā)現(xiàn),香榧在5月中下旬至6月初形成小孢子葉球(圖1 A),一般長(zhǎng)在一年生的嫩枝上,從葉腋中凸起,大小約2 mm。7月下旬至8月下旬,花枝上小孢子葉球開(kāi)始發(fā)育(圖1 B),頂端變圓,但仍被芽鱗緊裹,苞片與芽鱗界限明顯,但體積仍然很小,營(yíng)養(yǎng)芽頂端較尖;9—12月為小孢子葉球生長(zhǎng)旺盛期,鱗片分化結(jié)束,小孢子葉球中軸迅速伸長(zhǎng),在中軸由下而上分化小孢子葉原基(圖1 C、D)。至翌年2月中下旬,體積逐步增大,小孢子葉球從緊包的芽鱗中顯現(xiàn)(圖1 E)。3月中下旬至4月,小孢子葉球成熟,體積變化不明顯。小孢子葉球生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中,其顏色由淺綠色逐漸變?yōu)闇\黃色、黃褐色(圖1 F)。4月上、中旬發(fā)育為成熟花粉粒,花粉粒無(wú)氣囊,小孢子葉軸伸長(zhǎng),將成熟的小孢子囊推出,香榧開(kāi)始散粉(圖1 G)。

注:A為小孢子葉球初現(xiàn);B為小孢子葉球開(kāi)始發(fā)育;C、D為小孢子葉球生長(zhǎng)旺盛時(shí)期;E為小孢子葉球成熟時(shí)期;F和G為散粉期。

香榧雄球花發(fā)育周期可以分為花芽期、膨大現(xiàn)蕾期、變色期、成熟散粉期等幾個(gè)階段。 1) 花芽期:5月下旬至翌年2月上旬,由綠色芽鱗緊包的小孢子葉球,單生或頂生于當(dāng)年生新枝葉腋,苞片包被。形態(tài)上,這個(gè)時(shí)期的小孢子葉球只是體積的變大。 2) 膨大現(xiàn)蕾期:2月中、下旬至3月中下旬,小孢子葉球開(kāi)始生長(zhǎng),伸出苞片,膨大;小孢子葉球從緊包的芽鱗中顯現(xiàn),當(dāng)芽鱗松開(kāi)后,呈放射狀分布的花蕾(即小孢子葉)裸露,小孢子囊出現(xiàn),這一過(guò)程稱(chēng)之現(xiàn)蕾。 3) 變色期:3月下旬至4月上旬,小孢子囊仍然緊密相連,而顏色由綠變黃,小孢子葉呈深綠色。 4) 成熟散粉期:4月上、中旬,緊接變色期之后,小孢子球全部變?yōu)辄S色,小孢子葉相互分離,小孢子囊裂開(kāi),花粉完全成熟,隨即成熟散粉。小孢子球內(nèi)的小孢子囊開(kāi)裂,進(jìn)入散粉階段。散粉期間,根據(jù)散出的花粉量多少,也可細(xì)分為3個(gè)時(shí)段。a初粉期:黃色小孢子球全部顯露,個(gè)別小孢子囊開(kāi)裂,散出少量花粉。b盛粉期:全部小孢子囊裂口大開(kāi),散出大量花粉。c末粉期:花粉基本散盡,花枝上的小孢子葉球變?yōu)辄S褐色,呈枯萎狀態(tài)。

小孢子葉球由9～20個(gè)、呈放射狀排列在中軸上的小孢子葉組成,外被苞片(圖2 A)。小孢子葉包含3～4個(gè)小孢子囊,排列在小孢子葉尖端(圖2 B)。

香榧小孢子葉球生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中,其外部的物候形態(tài)表征與內(nèi)部花粉發(fā)育是相互對(duì)應(yīng)進(jìn)行的。

2.2 小孢子發(fā)生

香榧小孢子發(fā)生的過(guò)程如圖3所示。小孢子葉球原基發(fā)生在5月中下旬至6月上旬,小孢子葉球中軸及其基部的鱗片分化時(shí)期(圖3 A)。從此時(shí)起到8月上、中旬(圖3 B),鱗片分化結(jié)束,小孢子葉球中軸快速伸長(zhǎng),在中軸上由下而上分化小孢子葉原基,最初為一團(tuán)圓形、細(xì)胞質(zhì)很濃的分裂細(xì)胞。9月上、中旬小孢子葉原基迅速分化成小孢子葉,并于小孢子葉基部外側(cè)形成乳突狀花粉囊,其中充滿體型大、細(xì)胞質(zhì)濃的造胞組織。9月下旬至10月上中旬造胞組織進(jìn)行有絲分裂,形成大量花粉母細(xì)胞。10月下旬,花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂,進(jìn)入四分體初期(圖3 C),直到次年2月中、下旬均處于四分體時(shí)期(圖3 D;圖4),此時(shí),花粉囊呈長(zhǎng)橢圓形,絨氈層及1個(gè)小孢子葉的3～4個(gè)花粉囊清晰可見(jiàn)(圖5)。次年3月底,四分體分離,形成單核花粉(圖3 E、圖3 F),4月上旬,小孢子葉球開(kāi)放,二核花粉粒全部形成,此時(shí)花粉囊的絨氈層已被大部分吸收,只留下藥室的外壁。

圖3 小孢子發(fā)生

注:A為四面體形四分體。

注:A為著生于小孢子葉頂端的小孢子囊(個(gè)數(shù)不等,3～4個(gè))。

2.3 小孢子的形態(tài)觀察

從香榧小孢子的電鏡掃描圖像可以得出,成熟花粉單粒,近球形,直徑為22～27 μm,褶皺成三歧狀隆起,表面具有稀疏、大小不一的細(xì)瘤,無(wú)溝孔、無(wú)氣囊(圖6 Ⅰ～Ⅱ)。采集的同一地點(diǎn)不同單株類(lèi)型小孢子在表觀上無(wú)明顯差異,表明一種植物花粉形態(tài)具有很強(qiáng)遺傳保守性。

圖6 小孢子的形態(tài)觀察

顯微結(jié)構(gòu):香榧成熟花粉呈橢圓形或圓形,有一個(gè)假萌發(fā)孔,顯微鏡下能看到兩層壁,外壁厚,內(nèi)壁薄(圖6Ⅲ)。成熟花粉中含有少量淀粉,具二核(圖6 ⅢA);敗育花粉淀粉含量更多,花粉壁薄,僅具單核(圖6 ⅢB)。

2.4 大孢子葉球的形態(tài)觀察

如圖7所示,大孢子葉球生長(zhǎng)發(fā)育完成時(shí),傳粉滴出現(xiàn),即雌球花發(fā)育成熟可以授粉。傳粉滴膨大至飽滿球形時(shí)為大孢子葉球的最佳授粉狀態(tài)。若授粉時(shí)溫度低于14 ℃,傳粉滴會(huì)回縮,待授粉區(qū)域溫度回升,傳粉滴會(huì)再次吐露。

注:Ⅰ為3月22日生長(zhǎng)狀態(tài);A為假種皮;B為珠被;C為珠心;Ⅱ?yàn)?月17日生長(zhǎng)狀態(tài)。

3 小結(jié)與討論

對(duì)貴州引種后的香榧雄球花(小孢子葉球)發(fā)育周期有了較清晰的認(rèn)識(shí),對(duì)雄花各個(gè)生長(zhǎng)階段的外部形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)有較準(zhǔn)確的掌握:當(dāng)年5月中下旬,一年生嫩枝上形成小孢子葉球原基,以造孢組織即鱗片緊緊包裹的形態(tài)越冬。在花芽發(fā)育過(guò)程中如遇不良?xì)夂驐l件,若越冬期間遭遇凍害等不良?xì)夂蛴绊?則易導(dǎo)致花粉敗育,敗育花粉可達(dá)40%以上[6]。9—12月小孢子葉球生長(zhǎng)旺盛期,小孢子葉球中軸迅速伸長(zhǎng),肉眼可見(jiàn)體積逐步增大,至翌年2月中下旬,小孢子母細(xì)胞開(kāi)始分化,小孢子葉球從緊包的芽鱗中顯現(xiàn)。3月中下旬至4月初,小孢子葉球成熟,體積變化不明顯。結(jié)合小孢子葉球內(nèi)外結(jié)構(gòu)分析,僅通過(guò)外部形態(tài)觀測(cè)即可了解香榧雄球花成熟時(shí)間[12]。

小孢子葉球生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中,其外觀顏色從嫩綠色變至黃褐色。4月上、中旬發(fā)育為成熟花粉粒,花粉粒無(wú)氣囊,小孢子葉軸伸長(zhǎng)、增粗,將成熟的小孢子囊推出,花粉成熟,小孢子葉球開(kāi)始散粉。香榧雄球花整個(gè)生長(zhǎng)、發(fā)育周期持續(xù)11個(gè)月左右。

通過(guò)對(duì)小孢子葉球外部形態(tài)與小孢子發(fā)育進(jìn)程的對(duì)應(yīng)關(guān)系展開(kāi)研究,認(rèn)為貴州引入地的香榧小孢子葉球原基早于原產(chǎn)地浙江等地出現(xiàn)。四分體多呈四面體結(jié)構(gòu)。多年對(duì)香榧花粉采集時(shí)期的研究發(fā)現(xiàn),花粉成熟后散粉時(shí)間很短,尤其是氣溫高、晴天會(huì)促進(jìn)小孢子囊散粉。因此,花粉采集時(shí)間取決于小孢子葉球的顏色及開(kāi)裂程度,天氣好時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間采收,以備人工授粉使用。

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)觀測(cè)可知,香榧雄球花早雌花2～7 d開(kāi)裂散粉,待到雌花進(jìn)入最佳授粉的盛花狀態(tài)時(shí),雄球花已經(jīng)進(jìn)入末花期,花粉活性減弱、花粉量大大減少,從而降低授粉率。再者貴州省處于香榧產(chǎn)業(yè)發(fā)展初期,主要側(cè)重產(chǎn)業(yè)的規(guī)模、香榧成年母樹(shù)的產(chǎn)量以及栽種后所帶來(lái)的綜合效益,故香榧從業(yè)者在種植香榧時(shí)極易出現(xiàn)雄株少雌株多的局面,雌雄株配置比例不當(dāng),使得授粉用花粉數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能自給。由此,需要人工干預(yù)輔助授粉,進(jìn)而提高香榧授粉率和坐果率。

觀測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn),成熟花粉遇水或以水作為溶劑的液體,其內(nèi)壁能迅速膨脹,在赤道區(qū)膨脹更顯著,幾秒鐘內(nèi),外壁在中間一處破裂,并迅速脫離花粉。在脫離過(guò)程中,外壁收縮成突起,常被誤認(rèn)為是花粉發(fā)芽。下一步將對(duì)香榧有性生殖中雄配子體發(fā)育等展開(kāi)研究。