劉 湉,王志鑫,母磊鑫,王凱赫,徐 廣,吉 莉,馬 群,喬延江

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 102488;*通訊作者,E-mail:maqun99@163.com;#共同通訊作者,E-mail:yjqiao@263.net)

沙漠嘎,菊科蒿屬植物差不嘎蒿(ArtemisiahalodendronTurcz.)的嫩枝葉,分布于我國東北、華北及西北地區(qū)廣闊的沙漠中[1]。沙漠嘎具有止咳平喘、祛風濕的功效,可用于感冒、慢性支氣管炎及風濕性疾病的治療[2],其藥理活性主要體現(xiàn)在抗炎、抗哮喘、祛痰止咳等方面[3-7]。前期研究表明沙漠嘎中主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、有機酸類等化學成分,其中黃酮類化合物為主要的藥效成分[4-9]。目前對沙漠嘎的化學成分及藥效作用機制的研究仍有待完善,為了闡明沙漠嘎的藥效物質基礎,為其質量控制方法及抗哮喘作用機制研究提供依據(jù),本文對沙漠嘎具抗哮喘活性有效部位進行了化學研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

KH-250型速控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,(國華電器有限公司);DZF-6050真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮化工儀器廠);電子天平BS-124S(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);LC-20AT島津高效液相色譜儀,分析型(日本島津公司,日本);Waters Prep 150高效液相色譜儀,制備型(美國waters公司,美國);超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀(Q-TOF6550)(美國安捷倫科技公司,美國),核磁共振儀(瑞士BRUKER公司,瑞士)。

1.2 材料與試劑

沙漠嘎藥材,采自內蒙古自治區(qū)通遼市,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為菊科蒿屬植物沙漠嘎的地上部分;娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);甲醇,乙腈,甲酸均為色譜純(賽默飛世爾科技公司,美國);95%乙醇,分析純(北京化工廠有限責任公司);氘代甲醇(美國劍橋CIL同位素標準品公司,美國)。

1.3 藥材分離部位的制備

將沙漠嘎藥材用85%乙醇溶液回流提取3次,每次2 h,合并3次提取液,濃縮,再用預處理后的大孔樹脂對粗提物進行純化,收集洗脫液,減壓濃縮,干燥,即得沙漠嘎制備物。

1.4 供試品溶液的制備

取沙漠嘎制備物250 mg,精密稱定,置于25 ml容量瓶中,加入適量甲醇溶解,超聲30 min,再加甲醇至刻度,定容,搖勻,過0.45 μm的微孔濾膜,即得。

1.5 分離純化

制備液相色譜的分離條件:采用YMC-Pack ODS-A制備色譜柱(5 μm,250 mm×20 mm);流動相為0.1%甲酸水-乙腈(70∶30),等度洗脫;流速為18 ml/min,流動相在使用前過0.45 μm的微孔濾膜后再超聲15 min;柱溫為室溫;進樣量為3 ml,檢測波長為270 nm。沙漠嘎有效部位的制備液相色譜圖見圖1,分別收集各色譜峰所對應的組分。

圖1 沙漠嘎有效部位的制備液相色譜圖

將收集到的各餾分溶液分別合并,濃縮干燥,用適量甲醇溶解,先采用分析型高效液相色譜儀摸索制備條件,然后再采用半制備柱YMC-Pack ODS-A色譜柱(5 μm,250 mm×10 mm)通過調節(jié)流動相的種類、比例與流速對不同組分建立不同制備液相色譜條件,進行二次分離制備,分別收集洗脫液,采用分析型高效液相色譜儀檢測純度后合并,濃縮干燥,得到純度較高的單體化合物,提取分離流程圖見圖2。

N-M%乙醇洗脫液為先以N%乙醇洗脫,再以M%乙醇洗脫得到的洗脫液

2 結果

共從沙漠嘎中分離并鑒定6個純度較高的單體化合物,其中前5個化合物為首次從該植物分離得到,化合物Ⅰ～Ⅵ的結構見圖3。

圖3 化合物Ⅰ-Ⅵ的化學結構圖

2.1 化合物Ⅰ

化合物Ⅰ為淡黃色結晶(甲醇);UV(MeOH)λmax為270 nm。HR-EI-MSm/z[M-H]-:317.062 5,推斷其分子式為C16H14O7,不飽和度為10。1H-NMR譜中[δH:8.48]處單峰推測為羥基上的氫信號;[δH:6.84]和[δH:6.79]處兩個二重峰的偶合常數(shù)為8.23 Hz,推測分別為5′位和6′位的氫信號;[δH:4.93]和[δH:4.52]處兩個二重峰的偶合常數(shù)為11.34 Hz,推測分別為2位和3位氫信號,且2,3位氫原子互為反式構型;[δH:3.81]處的單峰積分面積對應3個氫,推測為7位甲氧基信號。13C-NMR譜中共觀察到16個碳信號,其中[δC:199.0]對應4位碳原子,[δC:147.2,146.4,129.8,121.0,116.1,115.9]位苯環(huán)上的碳信號,推測其分別對應4′,3′,1′,6′,2′,5′位的碳原子,[δC:73.8]對應3位碳原子,[δC:85.3]對應2位碳原子,[δC:56.4]為甲氧基上的碳信號。其1H-NMR、13C-NMR及分子量與文獻報道[10]基本一致,故將該化合物鑒定為3,5,3′,4′-四羥基-7-甲氧基二氫黃酮(帕得馬亭,padmatin)。

2.2 化合物Ⅱ

化合物Ⅱ為無色透明結晶(甲醇),UV(MeOH)λmax為210 nm和296 nm;HR-EI-MSm/z[M-H]-:216.112 1,推斷其分子式為C15H18O4,不飽和度為7。1H-NMR譜中[δH:7.59]與[δH:6.30]兩處雙峰的偶合常數(shù)均為15.98 Hz,推測為7位與8位氫信號,且7位與8位之間的雙鍵為反式構型;[δH:7.32]、[δH:7.28]與[δH:6.78]為苯環(huán)上的質子信號,分別對應2位、5位、6位氫信號;[δH:5.60]處的三重峰推測為2′位的雙鍵質子信號;[δH:3.97]與[δH:3.36]為2組亞甲基質子信號;[δH:1.76]處單峰為甲基信號。13C-NMR結合無畸變極化轉移技術(DEPT)、異核多量子相關譜(HSQC)、異核多鍵相關譜(HMBC)數(shù)據(jù)可知共有15個碳信號,包括10個烯碳(1個苯環(huán),2個雙鍵),1個羧基,2個甲基,2個亞甲基。13C-NMR譜圖中[δC:169.9]對應羧基上的碳信號;[δC:159.2,131.1,129.6,128.9,127.2,116.3]被推測為苯環(huán)的碳信號,分別對應4,2,3,6,1,5位的碳原子,其中[δC:131.1,128.9,116.3]在DEPT 90譜圖中有對應峰,證明其所對應的碳與一個氫原子相連,所以分別為2,6,5位的碳原子信號;[δC:68.9]與[δC:28.9]在DEPT 135譜圖中為倒峰,可知二者對應兩個亞甲基上的碳信號;[δC:52.1]為甲氧基上的碳信號;[δC:13.9]對應甲基上的碳信號。

1H-1H-COSY(同核位移相關譜)數(shù)據(jù)顯示H-7/H-8、H-5/H-6、H-1′/H-2′相關(見圖4)。HMBC數(shù)據(jù)顯示H-2、H-5、H-5′與C-1′(δC:28.9)相關,說明苯環(huán)與一個亞甲基相連;H-1′、H-4′、H-5′與C-2′(δC:124.6)、C-3′(δC:137.1)相關,說明亞甲基與雙鍵相連;H-5與C-7(δC:147.0)相關,H-7、H-OCH3與C-8(δC:114.7)相關,H-6、H-7與C-1(δC:127.2)相關(見圖5),說明苯環(huán)與雙鍵相連。

圖4 化合物Ⅱ的1H-1H-COSY譜圖

圖5 化合物Ⅱ的1H-1H-COSY與HMBC中的主要相關關系

在NOESY譜(二維核奧弗豪澤增強譜)中,照射2′-H(δH:5.60)時4′-H(δH:3.97)、1′-H(δH:3.36)、2-H(δH:7.32)信號有增益;照射4′-H(δH:3.97)時2′-H(δH:5.60)、5′-H(δH:1.76)信號有增益;照射5′-H(δH:1.76)時4′-H(δH:3.97)、1′-H(δH:3.36)信號有增益。因此可證明2′位CH與4′位CH2-OH空間距離較近,二者處于雙鍵同側,即C-2′與C-3′之間的雙鍵為反式構型(E)。

綜合以上信息,將化合物Ⅱ鑒定為甲基-3-(4′-羥苯基)香豆酸,其1H-NMR、13C-NMR及分子量與文獻報道[11,12]基本一致。

2.3 化合物Ⅲ

化合物Ⅲ為白色粉末(甲醇),UV(MeOH)λmax為270 nm,HR-EI-MSm/z[M-H]-:301.071 0,推斷其分子式為C16H14O6,不飽和度為10。在1H-NMR譜中[δH:7.36,6.84,6.09,6.04]代表苯環(huán)上的氫信號,推測[δH:7.36]為2′位、6′位的質子信號;[δH:6.84]為3′位、5′位的質子信號;[δH:6.09]與[δH:6.04]分別為8位、6位的質子信號;[δH:3.81]處的單峰對應甲基上的3個氫原子。在13C-NMR譜中,[δC:199.1]對應4位碳原子,[δC:170.0]為在7位與甲氧基相連的碳原子的信號,[δC:129.2]為3′位、5′位的碳原子信號,[δC:116.2]為2′位、6′位的碳原子信號,[δC:56.4]為甲氧基上的碳信號。綜合以上數(shù)據(jù),將化合物Ⅲ鑒定為3,5,4′-三羥基-7-甲氧基黃酮,其1H-NMR、13C-NMR及分子量與文獻報道[13]基本一致。

2.4 化合物Ⅳ

化合物Ⅳ為淡黃色粉末(甲醇),UV(MeOH)λmax為270 nm,HR-EI-MSm/z[M-H]-:331.081 4,推斷其分子式為C17H16O7,不飽和度為10。在1H-NMR譜中,[δH:7.12,6.98,6.84]分別對應苯環(huán)上2′位、6′位和5′位的氫信號;[δH:6.09]與[δH:6.05]兩處的雙峰分別為6位、8位的質子信號;[δH:3.89]與[δH:3.81]兩處的單峰分別位甲氧基上的質子信號。在13C-NMR譜共觀察到17個碳信號,其中[δC:199.1]對應4位碳原子,[δC:149.0,148.5,129.7,122.3,116.0,112.5]推測為苯環(huán)上的碳信號,分別對應4′,3′,1′,6′,5′,2′位的碳原子;[δC:102.7]對應10位碳原子,[δC:56.5]和[δC:56.4]分別為3′位與7位甲氧基上的碳原子信號。綜合以上數(shù)據(jù),將化合物Ⅳ鑒定為3,5,4′-三羥基-7,3′-二甲氧基黃酮,其1H-NMR、13C-NMR及分子量與文獻報道[13]基本一致。

2.5 化合物Ⅴ

化合物Ⅴ為黃白色固體(甲醇),UV(MeOH)λmax為216 nm和296 nm,HR-EI-MSm/z[M-H]-:315.158 7,推斷其分子式為C19H24O4,不飽和度為8。在1H-NMR譜中,[δH:7.40]與[δH:6.30]處的雙峰分別為7位、8位的質子信號,且兩處雙峰的耦合常數(shù)均為15.76 Hz,因此7位碳與8位碳之間的雙鍵為反式構型(E)。[δH3.97,3.37,3.29]代表亞甲基上的質子信號,故推測其分別對應4′位、1′位和1′′位上的氫信號;[δH:1.76]與[δH:1.71]兩處的單峰為甲基質子信號,分別對應5′位、4′′位和5′′位上的氫信號。在13C-NMR譜中觀察到18個碳信號,[δC:155.2,131.1,129.7,128.0,127.9]推測為苯環(huán)上的碳信號,分別對應4位,5位,1位,3位,6位,2位碳,[δC:26.0,17.9,13.9]為甲基上的碳信號,分別對應4″位,5″位,5′位碳。采用核Overhauser效應法,照射2′-H(δH:5.59)、4′-H(δH:3.97)、5′-H(δH:1.76),無信號增強;照射1′-H(δH:3.38)時5′-H(δH:1.76)信號有增益,故推測2′位與3′位之間的雙鍵為反式構型(E)。

1H-1H-COSY數(shù)據(jù)顯示H-7/H-8、H-1′/H-2′、H-1″/H-2″相關(見圖6)。HMBC數(shù)據(jù)顯示H-2、H-6、H-1′、H-1″與C-4(δC:155.0)相關,說明苯環(huán)與2個亞甲基相連;H-2、H-6與C-7(δC:143.0)相關,說明苯環(huán)還與一個雙鍵相連;H-7、H-8與C-9(δC:170.0)相關(見圖7),說明連著苯環(huán)的雙鍵還與羧基相連。

圖6 化合物Ⅴ的1H-1H-COSY譜圖

圖7 化合物Ⅴ的1H-1H-COSY與HMBC中的主要相關關系

綜合以上數(shù)據(jù),將化合物Ⅴ鑒定為茵陳蒿香豆酸A,其1H-NMR、13C-NMR及分子量與文獻報道[14]基本一致。

2.6 化合物Ⅵ

化合物Ⅵ為淡黃色固體(甲醇),UV(MeOH)λmax為269 nm;結合1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù),確定其分子式為C16H14O6,不飽和度為10。在1H-NMR譜中,[δH:6.05]與[δH:6.03]處的雙峰分別為6位、8位的質子信號;[δH:3.13、2.74]代表亞甲基上的質子信號,故推測其對應3位的氫信號;[δH:3.80]處的單峰為甲氧基上的質子信號。在13C-NMR譜中觀察到16個碳信號,其中[δC:147.0,146.6,131.7,119.3,116.3]推測為苯環(huán)上的碳信號,分別對應4′位、3′位、1′位、6′位、5′位、2′位碳;[δC:169.6]為與甲氧基相連的碳的信號,對應7位碳;[δC:56.3]為甲氧基上的碳信號。綜合以上數(shù)據(jù),將化合物Ⅵ鑒定為圣草酚-7-甲醚,其1H-NMR、13C-NMR信息與文獻報道[15]基本一致。

3 討論

高效制備液相色譜法適用于分離復雜的中藥組分中的有效成分,尤其適用于對目標成分的分離富集。本研究在采用高效制備液相分離之前先采用柱層析方法對樣品進行了處理,同時也結合了反相ODS柱層析法富集不同組分樣品,實驗結果表明高效制備液相色譜法結合ODS柱層析法能更好地提高制備效率,更快地獲得目標成分。

在實驗中考察了樣品的進樣量對高效制備液相色譜分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)樣品的進樣體積對色譜峰的分離效果存在一定影響,針對不同的色譜柱,可通過適當調節(jié)樣品濃度,適當減少進樣體積來得到最佳分離效果,提高制備效率。本研究在確定制備液相的色譜條件之前先通過分析型液相色譜優(yōu)化流動相條件,再通過線性放大原理放大至制備色譜過程,進而確立制備液相的色譜條件,在提高效率的同時也可以減少樣品與流動相的損失,降低實驗成本。

本研究從沙漠嘎中分離得到6個化合物,分別鑒定為帕得馬亭、甲基-3-(4′-羥苯基)香豆酸、3,5,4′-三羥基-7-甲氧基黃酮、3,5,4′-三羥基-7,3′-二甲氧基黃酮、茵陳蒿香豆酸A和圣草酚-7-甲醚,其中前5個化合物為首次從該植物分離得到,可基于本研究分離鑒定出的化學成分進一步開展沙漠嘎抗哮喘藥效作用機制研究,包括活性成分的篩選、藥效模型的驗證等,研究結果也可為沙漠嘎多指標質量控制方法的建立提供參考,為沙漠嘎的進一步研究與臨床開發(fā)應用奠定了基礎。