符麗梅,廖 欣,熊暮珺

(郴州市第一人民醫(yī)院血液內(nèi)科,郴州 423000)

獲得性血友病A(acquired hemophilia A, AHA)是一種循環(huán)血中存在抗凝血因子Ⅷ(FⅧ)的自身抗體導(dǎo)致凝血功能障礙的自身免疫性疾病,該病的發(fā)病率較低,多見(jiàn)于老年人,其次為產(chǎn)后婦女,兒童群體罕見(jiàn)[1]。AHA無(wú)明顯誘因,起病突然、病情兇險(xiǎn),可危及生命,其致命性出血的發(fā)生率約為9%～31%[2]。通過(guò)多年的調(diào)查分析及相關(guān)研究,目前已證明AHA的發(fā)病與多種基礎(chǔ)疾病相關(guān),包括自身免疫性疾病、妊娠、惡性腫瘤、藥物等,但仍有至少50%的AHA患者無(wú)法確定基礎(chǔ)疾病[3]。因此,探究AHA發(fā)生可能相關(guān)的因素是預(yù)防、診斷和治療該疾病的重要手段。微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一系列不具有蛋白編碼功能的短鏈(18～22 bp)RNA分子,可穩(wěn)定存在于包括血液在內(nèi)的多種體液環(huán)境中。目前,在人類多種疾病中發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的miRNAs,為疾病的診斷和治療提供了新工具[4]。然而,尚未有研究針對(duì)AHA疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的miRNAs進(jìn)行挖掘和探究。

本研究收集了13例AHA患者的臨床資料,旨在通過(guò)微列陣芯片技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)建立AHA患者血清中miRNA差異表達(dá)譜,篩選潛在功能miRNAs,從miRNAs水平為探究AHA病理機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究回顧性分析研究自2017年至2022年郴州市第一人民醫(yī)院收治的13例AHA患者,患者平均年齡為(74.73±8.06)歲,男性5例,女性8例。患者納入標(biāo)準(zhǔn)包括:①臨床診斷、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)以及影像學(xué)信息符合AHA的診斷標(biāo)準(zhǔn);②患者臨床資料齊全;③無(wú)AHA家族遺傳史;④入院前無(wú)AHA病史,無(wú)大出血或出血不止的病史;⑤臨床病癥包括皮膚瘀血斑、組織血腫、術(shù)后血流不止和凝血時(shí)間長(zhǎng)等。納入同期接受健康體檢的志愿者13例作為健康對(duì)照(提供凝血檢測(cè)結(jié)果),所有對(duì)照無(wú)AHA病史、家族遺傳史,且凝血功能正常。AHA患者與健康對(duì)照在年齡和性別方面無(wú)顯著差異(P>0.05)。所有參試者知情同意對(duì)臨床樣本和資料的分析,且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(BZAST-2016KYKTPJ-18)。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

檢查指標(biāo)包括AHA患者活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、FⅧ的活性(FⅧ:C)和FⅧ抑制物滴度(FⅧ:Ab),具體方法如下。將全血與抗凝劑枸櫞酸鈉按照9∶1分離乏血小板血漿,使用APTT試劑、乏Ⅷ因子血漿、氯化鈣試劑在Sysmex公司的CA-7000型全自動(dòng)血液凝固儀檢測(cè)患者APTT和FⅧ:C結(jié)果。

使用Bethesda法測(cè)定患者FⅧ:Ab,使用Bethesda單位(Bu)計(jì)量。能使血漿中的FⅧ:C降低50%的抑制物活性稱為一個(gè)Bethesda單位。每毫升血漿中FⅧ:Ab的Bethesda單位數(shù)=受檢血漿稀釋度×Bethesda單位。

1.3 微列陣芯片分析篩選差異表達(dá)miRNAs

使用TRIzol試劑(北京百泰克生物,中國(guó))提取3例AHA和3例健康對(duì)照血清樣本中的總RNA,利用聚乙二醇沉淀法分離miRNAs。利用NanoDrop2000超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)分離的miRNAs的純度,觀察A260/A280比值、計(jì)算RNA溶液濃度。使用微列陣芯片分析提取的miRNAs,首先將符合要求的miRNAs與雜交液于95 ℃孵育2 min,之后加入微列陣芯片裝置,與探針于56 ℃孵育過(guò)夜,清洗芯片后使用LuxScan 10K-A雙通道激光掃描儀掃描芯片,使用LuxScan 3.0和SAM 2.1軟件對(duì)掃描結(jié)果和數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。分析結(jié)果基于表達(dá)差異倍數(shù)>2及P<0.05,篩選差異表達(dá)的miRNAs。

1.4 熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)樣本中miRNAs表達(dá)量

使用TRIzol試劑提取剩余10例AHA和10例健康對(duì)照血清樣本的總RNA。NanoDrop2000檢測(cè)RNA純度和濃度后,利用RevertAidFirstStrand cDNA synthesis Kit將收集的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Green PCR反應(yīng)混合物以及7300實(shí)時(shí)PCR體系進(jìn)行qPCR,以U6作為miRNA的反應(yīng)內(nèi)參,檢測(cè)結(jié)果利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或方差分析,非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn);采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析潛在功能miRNAs與FⅧ:Ab的相關(guān)性。以上統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

AHA患者(n=13)和健康對(duì)照(n=13)的一般資料比較見(jiàn)表1,兩組在年齡和性別方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

表1 參試者一般臨床資料比較

2.2 AHA患者血清中差異表達(dá)的miRNAs

分析芯片結(jié)果顯示,與健康對(duì)照比較,AHA患者血清中存在23個(gè)差異miRNAs(見(jiàn)表2)。利用R繪制差異表達(dá)miRNAs的火山圖(見(jiàn)圖1),繪制miRNAs差異表達(dá)的熱圖(見(jiàn)圖2),差異表達(dá)miRNAs包含了16個(gè)上調(diào)的miRNAs和7個(gè)下調(diào)的miRNAs。

紅色點(diǎn):顯著高表達(dá);綠色點(diǎn):顯著低表達(dá)

表2 AHA患者與健康對(duì)照血清中差異表達(dá)的miRNAs

2.3 miRNAs差異表達(dá)水平的驗(yàn)證結(jié)果

在10組參試者中驗(yàn)證芯片篩選出23個(gè)差異表達(dá)miRNAs,結(jié)果表明,與健康對(duì)照血清分析結(jié)果相比,AHA患者血清中miR-206、miR-144-5p、miR-374b-5p和miR-432-3p表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001),miR-92a-3p表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.001,見(jiàn)圖3)。

2.4 miRNAs與FⅧ:Ab的相關(guān)性分析結(jié)果

將篩選到的潛在功能miRNAs與AHA患者的FⅧ:Ab水平作相關(guān)性分析,用以初步探究miRNAs與AHA疾病進(jìn)展的關(guān)聯(lián)。相關(guān)性分析結(jié)果表明,miR-206(r=0.726,P=0.017)和miR-374b-5p(r=0.657,P=0.039)與FⅧ:Ab顯著正相關(guān),而miR-92a-3p則與FⅧ:Ab呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.730,P=0.015,見(jiàn)圖4)。

2.5 miRNAs與AHA患者基礎(chǔ)病的關(guān)聯(lián)分析

鑒于AHA的發(fā)生與基礎(chǔ)病密切相關(guān),本研究進(jìn)一步探究了miRNAs與患者基礎(chǔ)病的關(guān)聯(lián)。其中,10例AHA患者中有2例風(fēng)濕性疾病、1例產(chǎn)后并發(fā)癥、1例惡性腫瘤。分析結(jié)果表明,在患有基礎(chǔ)病的AHA患者中,miR-206和miR-92a-3p的水平與無(wú)顯著基礎(chǔ)病的患者相比表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 miRNAs與AHA患者基礎(chǔ)病的關(guān)聯(lián)

3 討論

AHA屬于罕見(jiàn)疾病,但其發(fā)病突然、病情進(jìn)展迅速使得該疾病成為一種備受關(guān)注的凝血功能障礙疾病。該疾病主要是由于患者體內(nèi)產(chǎn)生抗FⅧ的自身抗體,致使FⅧI:C降低,導(dǎo)致類似血友病A的出血癥狀,屬于自身免疫性疾病[5]。目前,對(duì)于AHA的病因尚不明確,約占一半的患者伴有自身免疫性疾病、腫瘤、妊娠等基礎(chǔ)疾病或條件,但另外至少一半的患者至今找不到明確的基礎(chǔ)病。對(duì)于AHA疾病發(fā)生和發(fā)展相關(guān)病理機(jī)制的有限理解,嚴(yán)重限制了該疾病診斷和治療手段的發(fā)展。因此,有必要探究AHA病理過(guò)程中的關(guān)鍵分子,從而為疾病的預(yù)防和治療提供新思路。miRNAs是一系列不具有蛋白編碼功能,但是可參與調(diào)控各類病理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子[6]。人類多種疾病中均建立了miRNAs差異表達(dá)譜,從而促進(jìn)了對(duì)疾病進(jìn)展功能分子的探究和應(yīng)用。基于改善和發(fā)展AHA預(yù)防和治療方法的需求,本研究旨在利用微列陣芯片技術(shù)挖掘AHA潛在功能miRNAs。

在既往血友病的功能miRNAs研究中,一些表達(dá)差異的miRNAs被陸續(xù)報(bào)道。miR-5581-3p和miR-542-3p在血友病患者血清中表達(dá)水平顯著上調(diào),被證明是F8基因的上游靶向miRNAs,可通過(guò)靶向F8抑制FⅧ蛋白的合成,從而促進(jìn)血友病的發(fā)生和發(fā)展[7]。2015年的一項(xiàng)研究建立了血友病患者的差異表達(dá)miRNAs譜,發(fā)現(xiàn)mIR-1246作為F8疾病的調(diào)控子參與血友病的病理進(jìn)程[8]。以上研究均證明miRNAs在血友病的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而,目前尚未有研究探究miRNAs與AHA的潛在關(guān)聯(lián)。基于此,本研究建立了AHA血清差異表達(dá)miRNAs譜,并挖掘出23個(gè)差異表達(dá)miRNAs。并在進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中,基于10例AHA患者的血清樣本,證明了這23個(gè)miRNAs中有4個(gè)miRNAs(miR-206、miR-144-5p、miR-374b-5p、miR-432-3p)在AHA患者血清中較健康對(duì)照顯著高表達(dá),另有1個(gè)miRNAs(miR-92a-3p)在AHA患者血清中低表達(dá)。

分析這5個(gè)差異表達(dá)miRNAs與FⅧ抑制物滴度FⅧ:Ab的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-374b-5p與FⅧ:Ab顯著正相關(guān),而miR-92a-3p與FⅧ:Ab呈顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明這3個(gè)miRNAs可能參與AHA疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。從AHA的病因來(lái)看,約一半患者存在基礎(chǔ)病,本研究中的13例患者包括風(fēng)濕性疾病3例、惡性腫瘤2例、產(chǎn)后并發(fā)癥和術(shù)后大出血各1例。本研究比較了攜帶基礎(chǔ)病的AHA患者與無(wú)明顯基礎(chǔ)病患者間miRNAs的差異,發(fā)現(xiàn)miR-206和miR-92a-3p水平表現(xiàn)出顯著差異。miR-206具有調(diào)控免疫功能的潛能,在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程中具有調(diào)控Th17/Treg失衡的能力[9]。此外,miR-206在AHA發(fā)生的關(guān)鍵基礎(chǔ)病惡性腫瘤中也發(fā)揮重要的作用。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-206表達(dá)水平顯著下調(diào),具有抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的抑癌作用[10]。在膀胱癌中,miR-206同樣具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的功能[11]。對(duì)于miR-92a-3p,既往研究發(fā)現(xiàn)其在風(fēng)濕類疾病中可通過(guò)干擾成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的細(xì)胞功能參與疾病進(jìn)展[12]。此外,在人類惡性腫瘤疾病中,miR-432-3p、miR-374b-5p和miR-144-5p均具有調(diào)控腫瘤進(jìn)展的作用[13-15]。以上研究均說(shuō)明篩選到的差異表達(dá)miRNAs具有一定水平的生物學(xué)調(diào)控功能,與AHA發(fā)生的基礎(chǔ)病或許存在關(guān)系。

本研究的5個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNAs中,未能發(fā)現(xiàn)miR-144-5p、miR-432-3p與FⅧ:Ab的相關(guān)性,但由于分析僅在10例樣本中開(kāi)展,結(jié)果準(zhǔn)確性可能受小樣本量的限制。此外,雖然證明了2個(gè)miRNAs與基礎(chǔ)疾病的關(guān)聯(lián),目前尚不明確miRNAs的差異表達(dá)是基礎(chǔ)病因造成還是AHA發(fā)生直接導(dǎo)致。因此,未來(lái)的研究需要擴(kuò)大樣本量,從而驗(yàn)證和探究差異表達(dá)miRNAs的潛在功能。

綜上所述,本研究基于AHA患者血清建立了miRNAs差異表達(dá)譜,并在10組AHA患者和健康對(duì)照血清中進(jìn)行了驗(yàn)證和篩選,得到5個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,為后續(xù)AHA功能分子的研究提供了素材和依據(jù)。此外,對(duì)于差異表達(dá)的miRNAs的研究,還可以參考患者基礎(chǔ)病的情況,在進(jìn)一步探究疾病病因關(guān)聯(lián)的同時(shí),揭示miRNAs與AHA疾病發(fā)生和發(fā)展的密切相關(guān)性。總之,研究結(jié)果將為AHA的預(yù)防、診斷和治療提供新的分子候選物。