任高彤,李甜甜,封仁乾,王 迪,蘇 瑞,亓秉超,張明明,李 妍*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科,西安 710032;2空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;*通訊作者,E-mail:profleeyan@163.com)

心血管疾病在全球范圍內(nèi)發(fā)病率一直居高不下,是全球疾病致死的首要原因,全球死亡患者中1/3死于心血管疾病,中國因心血管疾病死亡人數(shù)居世界第一位[1]?！吨袊难芙】蹬c疾病報(bào)告2021》指出,城鄉(xiāng)居民疾病死亡構(gòu)成比中,心血管疾病占據(jù)首位[2]。心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病共有的終末期表現(xiàn),心力衰竭位列成人中住院病因的首位,心衰患者5年生存率甚至低于前列腺癌患者和乳腺癌患者[3,4]。急性心肌梗死是近20年心力衰竭最常見的病因[5]。心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因[6,7]。隨著介入治療和藥物治療的不斷發(fā)展,心?；颊咦≡浩陂g和心梗后1年死亡率大大下降,但是心梗后心衰的發(fā)生率和死亡率依然很高[8-10]。探討心梗后心衰的發(fā)病機(jī)制,提出針對(duì)性的治療方法,對(duì)心梗后心衰的臨床治療具有重要意義。

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9)可以介導(dǎo)低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)受體的內(nèi)吞并使其降解,減少肝細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的回收降解,導(dǎo)致循環(huán)中LDL-C含量升高[11-13]。PCSK9的單克隆抗體依洛尤單抗能夠使冠心病患者在應(yīng)用他汀列類降脂藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低LDL-C達(dá)59%,使心血管不良事件下降13.7%[14]。隨著PCSK9研究進(jìn)展,PCSK9作用于脂代謝以外的多效性也得到了越來越多的證據(jù)支持。PCSK9能夠結(jié)合心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞類型,在心梗、動(dòng)脈粥樣硬化等多個(gè)病理生理過程中發(fā)揮重要作用[15]。例如,心梗后心肌組織PCSK9表達(dá)水平升高,升高的PCSK9促進(jìn)了心肌細(xì)胞的凋亡和自噬[16,17]。依洛尤單抗的臨床研究逐漸聚焦于急性心肌梗死患者等高危人群中依洛尤單抗用藥的啟用時(shí)機(jī)[18-20]。目前依洛尤單抗心梗前用藥的相關(guān)研究較少,因此,本研究旨在探討依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)小鼠心梗后心衰的保護(hù)作用,并探討其可能的非脂代謝依賴的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)野生型雄性C57BL/6J小鼠和1～3日齡SD大鼠乳鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心,所有小鼠均在恒溫恒濕動(dòng)物房中飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和操作都嚴(yán)格遵守空軍軍醫(yī)大學(xué)發(fā)布的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊。

1.2 主要試劑及儀器

PCSK9一抗購自美國Abcam公司;Caspase-9一抗購自中國愛博泰克生物科技有限公司;β-actin一抗、SIRT3一抗、羊抗兔二抗購自中國三鷹生物技術(shù)有限公司;ABP、BNP引物購自中國生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司;RNAiso試劑盒、PrimeScript RT試劑盒、TB-green購自日本TAKARA公司;si-SIRT3購自中國擎科生物科技有限公司;TUNEL試劑盒購自美國Bio-Rad公司;Annexin Ⅴ-PE/7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國索萊寶科技有限公司。酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司;RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司;蛋白印跡成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司;小鼠心臟功能超聲系統(tǒng)購自加拿大Visual Sonics公司;小鼠麻醉所用異氟烷購自中國一品制藥股份有限公司;鼠尾注射靜脈顯像儀購自中國卡爾文生物科技有限公司;依洛尤單抗溶液購自美國Amgen公司。

1.3 小鼠心肌梗死模型的建立和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

取6～8周齡的雄性C57BL/6J小鼠行心梗造模[21]。用異氟烷麻醉小鼠,于小鼠左側(cè)胸骨中線4～5肋間做一切口,將心臟從切口處擠出胸腔外,輕柔固定后于左心房下方1～2 mm處用6-0絲線行冠脈左前降支(LAD)結(jié)扎術(shù),結(jié)扎后肉眼可見LAD支配區(qū)域心肌組織變白。心臟還納于胸腔后縫合切口,小鼠心電圖和小鼠心臟超聲均提示心梗模型建立成功。

C57BL/6J小鼠被隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(sham組)、心梗組(MI組)和心梗+依洛尤單抗預(yù)處理組(MI+Evolo組),每組小鼠51只。sham組小鼠行完全相同的手術(shù)流程但未結(jié)扎冠脈,MI組小鼠行心梗手術(shù)并結(jié)扎冠脈,MI+Evolo組小鼠行心梗手術(shù)并結(jié)扎冠脈,且在手術(shù)前4 h尾靜脈注射依洛尤單抗溶液[22]。小鼠尾靜脈注射依洛尤單抗的操作方法:將小鼠放入小鼠固定器,置于鼠尾注射靜脈顯像儀上,用50 μl注射器吸取依洛尤單抗溶液,于鼠尾中上段沿鼠尾靜脈斜行進(jìn)針,輕柔推注依洛尤單抗溶液,靜脈腔內(nèi)血液被溶液沖壓消失即為尾靜脈注射成功。依洛尤單抗用藥劑量為10 mg/kg體質(zhì)量,給藥時(shí)間為手術(shù)前4 h[22]。

1.4 Western blot檢測PCSK9、SIRT3、cleaved Caspase-9的蛋白水平

用PBS清洗小鼠心肌組織3次,剪碎后用充分研磨。加入RIPA裂解液,充分裂解細(xì)胞,取上清液行BCA蛋白定量。蛋白提取全程于4 ℃低溫條件下進(jìn)行。原代心肌細(xì)胞提取蛋白先用PBS輕柔沖洗細(xì)胞,隨后直接添加RIPA裂解液,后續(xù)步驟與組織提取蛋白相同。根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整各樣本上樣體積,按照Western blot實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作,采用10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白,轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉常溫封閉PVDF膜60 min,TBST溶液漂洗,4 ℃條件PCSK9一抗1∶1 000、SIRT3一抗1∶1 000、cleaved Caspase-9一抗1∶1 000孵育過夜。TBST溶液漂洗PVDF膜3次。室溫下羊抗兔二抗1∶5 000孵育60 min,TBST溶液漂洗PVDF膜3次。A液、B液體積1∶1配制發(fā)光液,用化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶,用蛋白印跡成像系統(tǒng)記錄條帶,以β-actin為內(nèi)參蛋白進(jìn)行目的蛋白定量分析。

1.5 qRT-PCR法檢測心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)的mRNA水平

按照TAKARA公司RNAiso試劑盒實(shí)驗(yàn)操作流程,提取心肌組織和原代心肌細(xì)胞的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,最后用TB Green預(yù)混的TaqⅡ酶進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。檢測小鼠心梗后7,14,28 d心肌組織ANP、BNP的mRNA水平;檢測缺氧處理3,6,9 h原代心肌細(xì)胞ANP、BNP的mRNA水平。RT-PCR儀設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下:95 ℃ 30 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6 超聲心動(dòng)圖檢查

超聲心動(dòng)圖檢查前24 h,將小鼠胸前區(qū)域脫毛。用異氟烷持續(xù)吸入麻醉小鼠,將小鼠放置于恒溫操作板上,超聲探頭置于小鼠胸骨旁長軸切面,獲取M型超聲心動(dòng)圖。用超聲心動(dòng)儀配套軟件測算左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率、左心室內(nèi)徑。

1.7 心肌梗死及心肌細(xì)胞的凋亡檢測

心梗造模后7,14,28 d,分別在sham組、MI組和MI+Evolo組中隨機(jī)選取8只小鼠行心臟取材。用異氟烷麻醉小鼠,脫頸法處死,隨后開胸取心臟。將小鼠心臟用4%甲醛固定過夜,常規(guī)石蠟包埋,切片厚5 μm。心梗后7 d的心臟切片行TUNEL染色以觀察心肌細(xì)胞的凋亡情況,心梗后14,28 d的心臟切片行Masson染色以觀察心肌梗死面積。染色封片后使用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察并拍照,用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 小鼠心室肌組織轉(zhuǎn)錄組測序

心梗建模后3 d,分別在sham組、MI組和MI+Evolo組中隨機(jī)選取3只小鼠,取各小鼠心室肌組織,Trizol法提取小鼠心室肌總RNA,進(jìn)行質(zhì)量控制,檢測RNA完整性,富集mRNA。使用美國Illumina生物技術(shù)公司RNA-seq樣本制備試劑盒(mRNA-Seq sample preparation kit),嚴(yán)格按照試劑盒說明書構(gòu)建cDNA文庫。進(jìn)行Illumina Novaseq 6000、PE150測序,對(duì)照小鼠的基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組信息,將測序出的reads進(jìn)行注釋、定量和分析。

1.9 原代心肌細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

將1～3日齡SD大鼠乳鼠在75%酒精中充分浸泡,乳鼠體表消毒后置于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)內(nèi),摘取乳鼠心臟,置于無菌PBS中,清洗血液,充分剪碎乳鼠心臟,置于無菌玻璃瓶中。加入1 mg/ml的Ⅰ型膠原酶5 ml,移液槍輕柔吹打混勻剪碎的心肌組織,用高壓滅菌過的瓶蓋密封玻璃瓶,在37 ℃孵箱中消化心肌組織5 min,輕柔吸取上層消化液,加入盛有含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的5 ml離心管中以終止消化。重復(fù)消化5～6次直至心肌組織消化完畢。收集消化后所得細(xì)胞混懸液,800 r/min室溫下離心5 min,棄上清后所得沉淀即為原代心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。用添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀后種植于小培養(yǎng)瓶,37 ℃孵箱中靜置2 h,使成纖維細(xì)胞貼壁,此時(shí)原代心肌細(xì)胞未貼壁而處于懸浮狀態(tài)。最后,將小培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至6孔板培養(yǎng)48 h,原代心肌細(xì)胞即可充分貼壁。

原代心肌細(xì)胞分為4組:對(duì)照組(Con組)、缺氧組(hypoxia組)、缺氧+依洛尤單抗預(yù)處理組(hypoxia+Evolo組)和缺氧+依洛尤單抗預(yù)處理+SIRT3干擾組(hypoxia+Evolo+si-SIRT3組)。Con組細(xì)胞未進(jìn)行任何處理;缺氧組細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo組細(xì)胞缺氧前5 min培養(yǎng)基中添加依洛尤單抗溶液,給藥濃度為100 μg/ml[22],隨后將細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中缺氧3 h;hypoxia+Evolo+si-SIRT3組細(xì)胞缺氧前48 h用si-RNA轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞并在缺氧前5 min培養(yǎng)基中添加依洛尤單抗溶液,隨后將細(xì)胞置于缺氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中缺氧3 h。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)樣本。si-RNA轉(zhuǎn)染原代心肌細(xì)胞的操作方法:取貼壁的原代心肌細(xì)胞。提前準(zhǔn)備2個(gè)試管,1個(gè)試管的培養(yǎng)基中包含si-RNA轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTMRNAiMAX,另1個(gè)試管的培養(yǎng)基中包含si-RNA,將兩個(gè)試管內(nèi)容物輕柔混合均勻,在室溫下孵育5 min,隨后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。si-RNA共轉(zhuǎn)染48 h,其后可行細(xì)胞干預(yù)。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測原代心肌細(xì)胞凋亡

使用胰酶將貼壁的原代心肌細(xì)胞消化至細(xì)胞懸液,等體積細(xì)胞培養(yǎng)基中和胰酶,離心獲得細(xì)胞團(tuán)塊。PBS重懸細(xì)胞,使用Annexin Ⅴ-PE/7AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作流程染色,用流式細(xì)胞儀獲得數(shù)據(jù)并定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

看完信，阿強(qiáng)覺得好笑，以為是誰的惡作劇，但也沒有掉以輕心，出門進(jìn)門都小心翼翼。三天過去了，家里一樣?xùn)|西也沒有少，阿強(qiáng)逐漸放松了警惕。第四天，阿強(qiáng)在家休息，忽然聽到一個(gè)女子的驚叫聲從門外傳來：“來人呀，快抓流氓呀！”

2 結(jié)果

2.1 心梗后小鼠心肌組織中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平變化

心梗后7,14,28 d小鼠心肌組織中PCSK9表達(dá)水平明顯升高,SIRT3表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05,圖1)。心梗后14 d PCSK9表達(dá)增加最為顯著,心梗后28 d PCSK9表達(dá)水平相較心梗后14 d有所下降。與sham組相比,MI組小鼠心肌組織中ANP、BNP mRNA水平均升高(P<0.05,見圖1)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.2 缺氧處理的原代心肌細(xì)胞中PCSK9,SIRT3,ANP,BNP水平變化

在缺氧處理3,6,9 h的原代心肌細(xì)胞中,PCSK9表達(dá)水平明顯升高,SIRT3表達(dá)水平明顯下降(P<0.05,見圖2),與心梗后小鼠心肌組織中PCSK9、SIRT3表達(dá)變化情況保持一致。缺氧處理組原代心肌細(xì)胞中ANP、BNP mRNA水平明顯高于Con組(P<0.05,見圖2)。

與Con組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.3 依洛尤單抗預(yù)處理改善小鼠心梗后心臟收縮功能

心梗后28 d,超聲結(jié)果顯示MI組小鼠心臟收縮功能明顯下降,表現(xiàn)為MI組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率低于sham組(P<0.05),收縮期左室內(nèi)徑高于sham組(P<0.05,見圖3)。相比于MI組,MI+Evolo組小鼠心臟收縮功能有所改善,表現(xiàn)為MI+Evolo組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率高于MI組(P<0.05,圖3),收縮期左室內(nèi)徑低于MI組小鼠(P<0.05,見圖3)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 依洛尤單抗預(yù)處理減少小鼠心梗后心臟梗死面積

心梗后14,28 d,Masson染色結(jié)果顯示MI組小鼠心臟梗死面積明顯高于sham組小鼠(P<0.05);而相比于MI組,MI+Evolo組小鼠心臟梗死面積明顯下降(P<0.05,見圖4)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.5 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中SIRT家族轉(zhuǎn)錄水平變化

分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,Sirtuins家族中可見SIRT3、SIRT5、SIRT7在sham組和MI組之間的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化,其中,只有SIRT3在MI組和MI+Evolo組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與sham組比較,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05

2.6 依洛尤單抗預(yù)處理減少心梗小鼠心肌細(xì)胞凋亡

心梗后7 d,TUNEL檢測結(jié)果顯示,MI組小鼠心肌細(xì)胞凋亡相較于sham組明顯增加,具體表現(xiàn)為心梗小鼠心肌組織TUENL染色細(xì)胞核陽性率升高(P<0.05,見圖6)。依洛尤單抗預(yù)處理降低了心肌細(xì)胞的凋亡水平,具體表現(xiàn)為小鼠心肌組織TUENL染色細(xì)胞核陽性率下調(diào)(P<0.05,見圖6)。

圖6 依洛尤單抗預(yù)處理減少心梗小鼠心肌細(xì)胞凋亡(n=8)

2.7 依洛尤單抗預(yù)處理通過上調(diào)SIRT3水平減少心梗小鼠心肌細(xì)胞凋亡

心梗后7 d的Western blot結(jié)果顯示,相較于sham組,MI組小鼠心肌組織中PCSK9表達(dá)明顯升高,SIRT3表達(dá)明顯降低,cleaved Caspase-9表達(dá)明顯升高,提示MI組小鼠心肌細(xì)胞凋亡增加。依洛尤單抗預(yù)處理下調(diào)了心梗小鼠心肌組織中PCSK9的表達(dá)量,上調(diào)了SIRT3的表達(dá)量,并降低了心肌細(xì)胞的凋亡水平,具體表現(xiàn)為cleaved Caspase-9水平下降(P<0.05,見圖7)。

與sham組比較,*P<0.05,**P<0.01;與MI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.8 依洛尤單抗預(yù)處理通過上調(diào)SIRT3水平減少缺氧處理的原代心肌細(xì)胞凋亡

缺氧處理3 h,原代心肌細(xì)胞Western blot結(jié)果和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,與Con組相比,缺氧組原代心肌細(xì)胞的PCSK9表達(dá)明顯升高,SIRT3表達(dá)明顯下降,cleaved Caspase-9表達(dá)明顯升高且心肌細(xì)胞凋亡率明顯上升(P<0.05,見圖8),提示缺氧組原代心肌細(xì)胞凋亡增加。依洛尤單抗預(yù)處理下調(diào)了缺氧處理的原代心肌細(xì)胞中PCSK9表達(dá)量,上調(diào)了SIRT3表達(dá)量,并降低了原代心肌細(xì)胞的凋亡水平,具體表現(xiàn)為cleaved Caspase-9表達(dá)下調(diào)、心肌細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05,見圖8)。

2.9 si-SIRT3可逆轉(zhuǎn)依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用

為了驗(yàn)證依洛尤單抗是否通過SIRT3改善心梗小鼠心臟收縮功能,本研究分離原代心肌細(xì)胞并用si-SIRT3干擾SIRT3的表達(dá)進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。原代心肌細(xì)胞缺氧處理3 h,結(jié)果顯示,相比于Con組,缺氧組原代心肌細(xì)胞中PCSK9表達(dá)上升,SIRT3表達(dá)下降,cleaved Caspase-9表達(dá)升高(P<0.05,見圖9),提示缺氧引起原代心肌細(xì)胞凋亡增加。依洛尤單抗預(yù)處理明顯下調(diào)了缺氧處理的原代心肌細(xì)胞中PCSK9表達(dá)量,上調(diào)了SIRT3表達(dá)量,減少了缺氧引起的原代心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05,見圖9)。相較于hypoxia+Evolo組,hypoxia+Evolo+si-SIRT3組原代心肌細(xì)胞PCSK9表達(dá)量未見明顯變化,SIRT3表達(dá)量明顯降低,同時(shí)cleaved Caspase-9表達(dá)升高(P<0.05,見圖9)。結(jié)果表明,si-SIRT3可以逆轉(zhuǎn)依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)缺氧原代心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。

與Con組比較,**P<0.01;與缺氧組比較,##P<0.01;與hypoxia+Evolo組比較,&&P<0.01

3 討論

心肌梗死發(fā)生后,冠脈血流的突然中斷或減少引起心肌細(xì)胞死亡或功能障礙[23]。心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化是不良心肌重塑的重要病理特征,也是導(dǎo)致心力衰竭的主要原因[6,7]。心肌梗死后心力衰竭以缺氧引起心肌細(xì)胞死亡和存活心肌細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙為主要特征[23,24]。因此,本研究聚焦于減少心梗后心肌細(xì)胞凋亡和改善心梗后心臟收縮功能,針對(duì)性提出了治療方案。

近年來研究表明,PCSK9具備不依賴于LDL受體的多效性作用,相應(yīng)的,PCSK9單抗同樣具備降脂作用以外的多效性。PCSK9單抗能夠改善血管內(nèi)皮功能、緩解血管壁炎癥、減少心梗后梗死面積[22,25,26]。本研究首先明確了小鼠心梗后心肌組織中PCSK9表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)心梗后小鼠心肌組織中PCSK9蛋白表達(dá)明顯增加。據(jù)此,本研究采用臨床廣泛應(yīng)用的依洛尤單抗行小鼠心梗前預(yù)處理,以探討依洛尤單抗對(duì)心梗小鼠心肌組織中PCSK9表達(dá)的作用,以及對(duì)心梗小鼠心臟功能和心臟梗死面積的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,依洛尤單抗預(yù)處理后,心梗小鼠心肌組織中PCSK9蛋白表達(dá)下調(diào),心臟收縮功能改善,心臟梗死面積減小。該結(jié)果與既往研究保持一致[17,22]。

依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)小鼠心梗后心衰改善作用的具體機(jī)制尚未完全清楚,本研究取小鼠心室肌組織行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),MI組相較于sham組,Sirtuins家族中可見SIRT3、SIRT5、SIRT7的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯變化,其中,只有SIRT3在MI組和MI+Evolo組兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以sham組小鼠為參照,MI組和MI+Evolo組小鼠心肌組織中SIRT3表達(dá)均下調(diào),但是,MI+Evolo組小鼠比MI組小鼠心肌組織中SIRT3下降幅度小,SIRT3表達(dá)量為MI組的2倍左右,提示依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)心梗小鼠心臟收縮功能的改善作用可能為SIRT3依賴的。

Sirtuins家族為NAD依賴性的組蛋白去乙?；?屬于第三類組蛋白去乙?；?在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)、衰老等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用。SIRT3定位于線粒體膜上,通過對(duì)賴氨酸可逆性去乙?；?廣泛參與線粒體功能、生物合成、糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激和凋亡等多種生理過程的調(diào)節(jié)[27]。既往研究表明,SIRT3與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。SIRT3通過作用于超氧化物歧化酶2(SOD2)、異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)等底物顯著增強(qiáng)細(xì)胞清除胞內(nèi)ROS的能力[28,29],并通過作用于Opa1、Ku70、環(huán)孢素D等底物抑制細(xì)胞凋亡[30-32]。此外,在心衰的發(fā)病過程中,SIRT3也發(fā)揮著重要作用。心衰小鼠心肌組織中SIRT3表達(dá)水平下降[33]。上調(diào)SIRT3可通過抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路而抑制心肌纖維化,延緩心臟重塑,改善心臟功能[34]。近年來,SIRT3被視為心衰治療的重要靶點(diǎn)[35]。本研究結(jié)果顯示,心梗小鼠心肌組織中SIRT3蛋白表達(dá)下降,心肌細(xì)胞凋亡增加。依洛尤單抗預(yù)處理上調(diào)了心梗小鼠心肌組織中SIRT3表達(dá)水平,并降低了心梗小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平。原代心肌細(xì)胞缺氧前給予依洛尤單抗預(yù)處理,上調(diào)了缺氧原代心肌細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)量,緩解了缺氧誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞凋亡。為了明確依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)小鼠心梗后收縮功能的改善是否通過SIRT3而發(fā)揮作用,在體外原代心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,用si-SIRT3抑制原代心肌細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)后,再行原代心肌細(xì)胞缺氧前依洛尤單抗預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,抑制原代心肌細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)后,逆轉(zhuǎn)了依洛尤單抗預(yù)處理減少缺氧原代心肌細(xì)胞凋亡的作用。

本研究存在一定的局限性。其一,心梗后心衰的病理生理機(jī)制十分復(fù)雜,依洛尤單抗預(yù)處理可能通過作用于其他分子發(fā)揮其心梗后心功能改善作用,但至少在本研究中證實(shí)其部分作用是通過激活SIRT3發(fā)揮的;其二,依洛尤單抗預(yù)處理通過何種方式上調(diào)SIRT3表達(dá)及其具體的分子調(diào)控機(jī)制尚未明確,課題組正在進(jìn)行相關(guān)研究。

總而言之,本研究證明,依洛尤單抗在心梗手術(shù)前預(yù)處理可以改善小鼠心梗后心臟收縮功能,降低小鼠心梗后心臟梗死面積,并通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了新的作用機(jī)制,依洛尤單抗預(yù)處理對(duì)小鼠心梗后心衰的緩解作用很可能是通過激活SIRT3表達(dá)、降低心肌細(xì)胞凋亡水平而發(fā)揮的。本研究為臨床急性心?；颊邞?yīng)用依洛尤單抗的安全性和有效性提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù),也為臨床急性心?；颊咴缙趩⒂靡缆逵葐慰固峁┝藢?shí)驗(yàn)參照。