孫小龍，徐懷德，米林鋒，毛敏，樊慧華，侯磊磊

1. 榆林市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（榆林 719000）；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（楊凌 712100）

近年來(lái)，研究得知亞硝胺類化合物（nitrosamines，NAms）是一種很強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)，廣泛存在于肉質(zhì)類食物、化妝品、啤酒、香煙等食品中，而通常在腌制肉的制作工藝中N-二甲基亞硝胺是由蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物二甲胺在與亞硝酸鹽經(jīng)過(guò)系列反應(yīng)生成[1-2]，是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，一般表現(xiàn)急性中毒癥狀，長(zhǎng)期食用會(huì)導(dǎo)致肝硬化，腎臟衰竭。腌制肉和醬鹵肉多含有N-亞硝胺[3-5]，其中又以N-二甲基亞硝胺檢出率最高[6]。GB 2762——2017《食品中污染物限量》中規(guī)定水產(chǎn)品中N-二甲基亞硝胺的限量值為4 μg/kg[7]，另一方面由于腌制肉制品中含量較低，且樣品基質(zhì)復(fù)雜，準(zhǔn)確檢測(cè)亞硝胺類化合物難度較大，因此建立快速、高效檢測(cè)N-二甲基亞硝胺檢測(cè)方法，對(duì)監(jiān)控食品安全和保障消費(fèi)者健康有極其重要意義[8]。

榆林羊雜碎是陜北傳統(tǒng)小吃的典型代表，有著渾厚的飲食文化底蘊(yùn)，更有廣泛的美食影響力，制作工藝上以羊肉湯料為主，添加薯?xiàng)l、豆條、粉條、香菜、調(diào)味料等多種食材，講究食材多樣，即食色香味滋形俱全，具有典型的地域飲食特征，包含了地方飲食的特色標(biāo)簽。國(guó)內(nèi)對(duì)亞硝胺類物質(zhì)檢測(cè)主要有氣相色譜法[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16-22]等，而對(duì)于羊雜碎中N-二甲基亞硝胺檢測(cè)則鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)榆林市特色食品羊雜碎中N-二甲基亞硝胺污染物通過(guò)采用QuEChERS-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），對(duì)比水蒸氣蒸餾-GC-MS聯(lián)用法建立測(cè)定羊雜碎中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的快速高效檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單、快速，凈化效果好，靈敏度更高，以期為當(dāng)?shù)靥厣称费螂s碎中N-亞硝胺類化合物的分析測(cè)試研究提供試驗(yàn)依據(jù)，積極探索滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊雜碎樣品（生產(chǎn)企業(yè)送檢樣品）；氯化鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；無(wú)水硫酸鎂（MgSO4-5H2O，密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸、乙腈、二氯甲烷和正己烷（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；NDMA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%，TGI公司）；PSA、C18（Agela Technologies）；DPC復(fù)合凈化柱、GCB（北京DIKMA公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

串聯(lián)質(zhì)譜儀（7890B-7000C，安捷倫）；分析天平（ME204，梅特勒）；多功能振蕩器（HY-4）；均質(zhì)器（HBM-400B）；全自動(dòng)平行濃縮儀（MV-5）；智能水蒸氣蒸餾儀（ST106-1RW+STER02）；渦旋振蕩器（MS-3型）；樣品粉碎機(jī)（FW-200）；實(shí)驗(yàn)室用水（經(jīng)Milli-Q凈化超純水）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

NDMA標(biāo)準(zhǔn)品用二氯甲烷配制成5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃冰箱避光保存，用不含NDMA羊雜碎處理后的基質(zhì)溶液將儲(chǔ)備液別稀釋至20，50，100，200，500和1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，避光保存。1%乙酸-乙腈提取溶液：取500 mL乙腈，加入冰乙酸5 mL，搖勻。

1.3.2 儀器分析參數(shù)

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度220 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃保持1 min；色譜柱流量1.2 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)器溫度280 ℃；不分流進(jìn)樣。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度230 ℃，輔助加熱器230 ℃。監(jiān)測(cè)測(cè)模式：選擇離子模式監(jiān)測(cè)（SIM），定性定量監(jiān)測(cè)離子42/43/44/74。

1.3.3 試樣方法

1.3.3.1 QuEChERS前處理

隨機(jī)選擇企業(yè)送檢包裝羊雜碎樣品，切碎混勻，用均質(zhì)器成勻漿，稱取20 g樣品加入10.0 mL乙腈（含有1%冰乙酸），渦旋振蕩2 min加入無(wú)水MgSO4和氯化鈉，渦旋振蕩2 min，按6 000 r/min離心5 min后，吸取5 mL上層清液，加入復(fù)合凈化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）凈化，收集凈化液，在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下再離心5 min后，氮吹至近干，乙腈定容至1.0 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，上機(jī)測(cè)樣。

1.3.3.2 水蒸氣蒸餾法前處理

參考GB 5009.26——2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測(cè)定》羊雜碎樣品粉碎均勻后稱取200 g于1 L蒸餾瓶中，分別加入100 mL水和50 g氯化鈉于樣品瓶中，加入10粒玻璃球，連接全自動(dòng)水蒸氣蒸餾儀蒸餾，放入冰水浴中，收集液管沒(méi)入二氯甲烷液面以下。開(kāi)啟蒸餾裝置，收集冷凝液，冷凝液液面上升至400 mL位置后，關(guān)閉加熱裝置，停止蒸餾。蒸餾餾出液加入20 g氯化鈉和3 mL硫酸，攪拌至完全溶解，移至500 mL分液漏斗，轉(zhuǎn)移下層液，二氯甲烷多次提取，合并下層液。用10 g無(wú)水硫酸鈉將將萃取液脫水后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，采取40 ℃水浴濃縮方式濃縮至5 mL，定容至2.0 mL，上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱選擇

對(duì)比不同極性色譜柱如非極性柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、中等極性柱DB-35（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、強(qiáng)極性柱DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 μm）對(duì)NDMA分離的影響。結(jié)果表明：選用非極性柱HP-5MS時(shí)，NDMA色譜峰受溶劑峰影響大，且有色譜峰展寬的現(xiàn)象，存在明顯拖尾現(xiàn)象；中等極性柱DB-35測(cè)定時(shí)，峰展寬現(xiàn)象明顯；選用強(qiáng)極性柱DB-WAXETR時(shí)，色譜峰尖銳，分離度好。因?yàn)閬喯醢贩肿咏Y(jié)構(gòu)具有強(qiáng)極性和強(qiáng)揮發(fā)性，強(qiáng)極性柱DB-WAXETR測(cè)定NDMA實(shí)現(xiàn)較好的很分離效果。因此選用DB-WAXETR作為色譜柱。

2.2 萃取率比較

分析3種樣品前處理過(guò)程對(duì)NDMA萃取效率的影響，試驗(yàn)采用加標(biāo)回收率對(duì)不同前處理萃取效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別以加標(biāo)水平0.5，1.0，2.0和4.0 μg/kg計(jì)算2種前處理方式的萃取率水平，按式（1）計(jì)算。

式中：CS為NDMA實(shí)際檢測(cè)含量，μg/kg；CA為空白樣品中NDMA含量，μg/kg；Ca為NDMA添加量，μg/kg。

結(jié)果表明（圖1），羊雜碎中不同加標(biāo)含量NDMA在2種前處理過(guò)程回收率差別明顯，QuEChERS前處理NDMA回收率在67.5%～87.5%之間，而采用水蒸氣蒸餾法處理樣品NDMA回收率在60.2%～80.9%之間，說(shuō)明羊雜碎樣品經(jīng)水蒸氣蒸餾提取過(guò)程N(yùn)DMA損失相對(duì)較多，回收率相較QuEChERS前處理較低，因此試驗(yàn)前處理選用QuEChERS方法。

圖1 不同前處理過(guò)程對(duì)NDMA萃取效率的影響

2.3 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

GB 5009.26——2016檢測(cè)方法中水蒸氣蒸餾法操作繁瑣，稱樣量較大，耗時(shí)長(zhǎng)，適用性不強(qiáng)，蒸餾過(guò)程操作溫度高，萃取過(guò)程大量使用二氯甲烷等有機(jī)試劑，易使被測(cè)物質(zhì)亞硝胺損失。張偉偉等[21]采用水蒸氣蒸餾法提取食品中N-二甲基亞硝胺，經(jīng)二氯甲烷提取，樣品添加回收率在84.5%～101%之間，而QuEChERS前處理方便快捷，又可避免上述水蒸氣操作弊端，因此采用QuEChERS對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

2.3.1 提取溶劑優(yōu)化

研究表明試驗(yàn)過(guò)程中提取溶劑極性不同會(huì)對(duì)NDMA含量的檢測(cè)產(chǎn)生較大影響，因此在羊雜碎樣品前處理過(guò)程選擇合適的提取溶劑。將二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯和乙腈（1%乙酸）作為提取溶劑進(jìn)行提取效率比價(jià)，結(jié)果表明（圖2）：正己烷、二氯甲烷對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的提取率一般，平均回收率為72.1%；由于正己烷和二氯甲烷為親油性，但極性相較乙酸乙酯和乙腈偏弱，同時(shí)乙酸乙酯為親油性同時(shí)有一定的親水性，對(duì)NDMA提取效果好于上述兩種提取溶劑，且回收率均較高，但提取的雜質(zhì)較多，極易溶解大分子物質(zhì)如蛋白和油脂類等物質(zhì)，圖譜上雜峰較多，干擾較為明顯，由于NDMA含有胺基結(jié)構(gòu)，屬于親核型化合物，所以在萃取體系中加入一定比例乙酸有利于目標(biāo)物萃取，同時(shí)1%乙酸的加入掩蔽了色譜系統(tǒng)的活性，峰形和響應(yīng)明顯提高。因此試驗(yàn)采用（1%乙酸）乙腈作為檢測(cè)羊雜碎NDMA的提取溶劑，50ng/mL NDMATIC圖見(jiàn)圖3，50ng/mLNDMA特征離子圖見(jiàn)圖4，NDMA特征離子豐度圖見(jiàn)圖5。

圖2 不同提取溶劑對(duì)NDMA回收率的影響

圖3 NDMA TIC圖（50 ng/mL）

圖4 NDMA特征離子圖（50 ng/mL）

圖5 NDMA特征離子豐度圖

2.3.2 鹽析和脫水劑的選擇

由于提取溶劑乙腈微溶于水，因此該提取液中體系存在少量水分導(dǎo)致后期分離難等問(wèn)題，通過(guò)對(duì)比MgSO4和NaCl不同配比（4∶1，3∶2，2∶3和1∶4，W/W）對(duì)NDMA提取效率高低的影響，圖6表明，無(wú)水MgSO4和NaCl添加量配比4∶1（W/W）時(shí)分離效果更好，NDMA回收率達(dá)79.3%，明顯高于其他MgSO4和NaCl例比，說(shuō)明該配比NaCl通過(guò)鹽析分層作用使得水溶性雜質(zhì)降低，避免提取液中干擾基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)無(wú)水MgSO4可較快除去提取溶劑中的水分及鹽析后的水相層，因此本試驗(yàn)鹽析過(guò)程采用4 g無(wú)水MgSO4和1 g NaCl添加量。

圖6 不同MgSO4和NaCl配比對(duì)NDMA萃取效率的影響2.3.3 吸附和凈化劑的選擇

羊雜碎以羊雜為主料，湯料中富含脂肪、蛋白等干擾物質(zhì)，不同的吸附和凈化劑會(huì)對(duì)NDMA含量的檢測(cè)產(chǎn)生較大影響。而QuEChERS方法常用的吸附劑為C18、PSA、GCB等，其中大多用于植物源性食品，對(duì)于含油脂較高樣品去除能力一般，試驗(yàn)對(duì)比C18、PSA、GCB及復(fù)合凈化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）除油脂的效果，由于DPC特殊結(jié)構(gòu)對(duì)脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈具有非常強(qiáng)的選擇吸附性，既可以除掉基質(zhì)干擾物的同時(shí)也不會(huì)吸附目標(biāo)物而造成檢測(cè)結(jié)果的偏差。對(duì)比發(fā)現(xiàn)DPC相較PSA和C18等吸附劑去除油脂效果較好。同時(shí)，針對(duì)羊雜碎中油脂較多的特點(diǎn)，為進(jìn)一步去除樣品中的油脂，試驗(yàn)前采用在-20 ℃冰箱冷凍提前冷凍1 h。試驗(yàn)對(duì)4種固相萃取柱C18、PSA、GCB及復(fù)合凈化小柱DPC的凈化效果進(jìn)行比較。通過(guò)樣品加標(biāo)試驗(yàn)，比較每種萃取柱分別對(duì)NDMA回收率以確定最佳的固相萃取柱。由表1可知，DPC的凈化效果最好，回收率可達(dá)85.6%。這是因?yàn)檠螂s碎中尤其是湯料羊雜中含有大量油脂和脂肪酸，DPC對(duì)于脂質(zhì)中C5及以上的碳鏈吸附性較強(qiáng)，去除油脂和脂肪酸效果較好，因此試驗(yàn)采用迪馬公司的混合吸附劑DPC對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

表1 種固相萃取小柱凈化效果比較

2.4 基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）影響

檢測(cè)過(guò)程由于樣品基質(zhì)、前處理過(guò)程、色譜分離效果等差異影響，檢測(cè)中產(chǎn)生對(duì)待測(cè)化合物離子增強(qiáng)或抑制的基質(zhì)效應(yīng)，進(jìn)而嚴(yán)重影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。GC-MS/MS為減弱待測(cè)目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)的影響，主要解決方法主要為通過(guò)向不含待測(cè)物即陰性樣品處理液中添加待測(cè)物與接近濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)作為對(duì)比，確定較為準(zhǔn)確的檢測(cè)范圍，盡量避免檢測(cè)過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性影響[23]，由于試驗(yàn)前處理采用QuEChERS方法簡(jiǎn)單高效，因此試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)液做校準(zhǔn)曲線消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，利用相對(duì)響應(yīng)值法，根據(jù)入式（2）計(jì)算羊雜碎NDMA中的ME。

式中：ME為基質(zhì)效應(yīng)；Ac為某一濃度水平空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)吸光度；Am為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)吸光度。

考察羊雜碎不同濃度下NDMA基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱，按1.3.4.1方法進(jìn)行前處理并配制質(zhì)量濃度20，50，

100，200和500 ng/mL的NDMA純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液和空白羊雜碎基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)測(cè)定NDMA在上述2種溶液的響應(yīng)值比較，若二者響應(yīng)比值ME大于115%則表現(xiàn)較明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，若ME小于85%則基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，ME介于85%～115%則無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。圖7表明，羊雜碎中NDMA測(cè)定過(guò)程存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)干擾，濃度越小，羊雜碎基質(zhì)中NDMA表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，質(zhì)量濃度100 ng/mL時(shí)，ME為109.3%，且隨著濃度的增加，基質(zhì)效應(yīng)逐漸減弱，NDMA質(zhì)量濃度達(dá)到200 ng/mL以上時(shí)，不表現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)。說(shuō)明羊雜碎中不同濃度NDMA在同基質(zhì)中具有不同的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)，同時(shí)也表明基質(zhì)效應(yīng)與濃度具有一定關(guān)系，隨著濃度的增加，羊雜碎中NDMA基質(zhì)效應(yīng)逐漸減弱。因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)能減小基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

圖7 羊雜碎基質(zhì)中不同濃度NDMA基質(zhì)效應(yīng)比較

2.5 方法評(píng)價(jià)

2.5.1 線性范圍及檢出限

稱取6份空白羊雜碎樣品，按照上述方法處理，用20，50，100，200，500和1 000 ng/mL質(zhì)量濃度的空白羊雜碎樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液為基準(zhǔn)，線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。以信噪比為（rSN=3或10）分別計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），見(jiàn)圖8和表2。

表2 羊雜碎中NDMA回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限

圖8 羊雜碎中NDMA回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.5.2 回收率及精密度

隨機(jī)選擇羊雜碎樣品，在1.0，2.0和5.0 μg/kg 3個(gè)水平下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率范圍為78.6%～89.0%，見(jiàn)表3。

表3 羊雜碎中NDMA不同添加水平下回收率和精密度結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

采用所建立的方法對(duì)企業(yè)送檢16個(gè)羊雜碎樣品進(jìn)行檢測(cè)，在所有樣品中均檢出NDMA殘留，含量為0.94～8.36 μg/kg，表明榆林市羊雜碎中在存在NDMA殘留，但含量基本小于限量要求。該檢測(cè)方法可滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測(cè)需求。

3 結(jié)論

采用QuEChERS-GC-MS聯(lián)用法建立測(cè)定榆林特色食品羊雜碎中NDMA的快速高效檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速，凈化效果好，靈敏更高度，可滿足羊雜碎中NDMA的高效檢測(cè)需求，也為監(jiān)管部門對(duì)于羊雜碎中亞硝胺類污染物檢測(cè)提供有力技術(shù)支撐，具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。