付鎵榕，徐榮，郭剛軍，馬尚玄，鄒建云

云南省熱帶作物科學(xué)研究所（景洪 666100）

魔芋是天南星科（Araceae）魔芋屬（Amorphophallus）多年生草本植物。全球有魔芋220余種，其中我國(guó)就有25種，主要分布在西南和華南地區(qū)，云南省有15種魔芋資源，為魔芋資源最豐富的省份[1]。魔芋作為我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，有著悠久的歷史，涉及種植、食用及藥用，據(jù)《開(kāi)寶本草》和《本草綱目》中的記載，魔芋性寒、味平，有化痰、行瘀消腫的作用，可以治療跌打損傷、咳嗽、癰腫風(fēng)毒、瘧疾、積滯等疾病。在現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，魔芋對(duì)肝臟[2]、肥胖[3]、糖尿病[4]、炎癥性腸病[5]等方面均有治療作用。除食用和藥用價(jià)值外，魔芋葡甘露聚糖（Konjac Glucomannan，簡(jiǎn)稱KGM）還可作為天然高分子材料，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[6]。

目前，魔芋的化學(xué)成分的研究報(bào)道主要以脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維、葡甘聚糖、淀粉等為主[7-10]，由于KGM為主要成分且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，故其它成分的用途開(kāi)發(fā)較少，特別是對(duì)其藥用方面的開(kāi)發(fā)利用極少[11]。植物多酚具有防止心腦血管疾病[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化活性[14]等功效，而對(duì)于魔芋多酚的研究較少。只有對(duì)多酚的含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，才能對(duì)多酚提取技術(shù)、多酚產(chǎn)品的制備、功效等展開(kāi)研究。Folin-Ciocalteu比色法是目前多酚測(cè)定主要采用的方法，但不同樣品選用的檢測(cè)條件差異較大，比如碳酸鈉溶液的濃度及用量，顯色溫度也不同主要在30～50℃之間，顯色時(shí)間也從30到120 min不盡相同[15-18]。目前對(duì)魔芋多酚的定量測(cè)定方法優(yōu)化尚未見(jiàn)報(bào)道，因此很有必要對(duì)Folin-Ciocalteu比色法的測(cè)定條件進(jìn)行系統(tǒng)分析，以確定最優(yōu)的檢測(cè)條件。

文章通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法建立了Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定魔芋多酚含量的方法，并對(duì)該方法的穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、回收率進(jìn)行考察。通過(guò)研究為魔芋的成分分析提供理論依據(jù)，期望提升魔芋的綜合利用率增加魔芋的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用彌勒魔芋（云南省熱帶作物科學(xué)研究所試驗(yàn)基地）；福林酚試劑（Folin-Ciocalteu試劑）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸（3, 4,5-三羥基苯甲酸）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇等試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

BGZ-70電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；HHS恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；ME204E電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500VDE超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器公司）；T-UV1810紫外分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；114B粉碎機(jī)（永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.3 魔芋多酚的提取

將清水洗凈的魔芋球莖去皮切成3～5 mm薄片，于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中80 ℃烘至恒重，粉碎過(guò)篩制得魔芋粉，備用。參照尹娜等[19]的試驗(yàn)方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取魔芋粉5 g于100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇定容，超聲波提取30 min，靜置30 min后取50 mL上清液于容量瓶中，用蒸餾水定容至250 mL，制得多酚提取液，備用。

1.4 魔芋多酚測(cè)定條件的優(yōu)化

1.4.1 最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL魔芋多酚提取液和40 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，再分別加入1.0 mL福林酚試劑、5 mL蒸餾水、3 mL 5%的碳酸鈉溶液，在50 ℃水浴60 min，用分光光度計(jì)在400～1 000nm下進(jìn)行吸收光譜掃描，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

1.4.2 碳酸鈉溶液用量的確定

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，再分別加入1.0 mL福林酚試劑，然后分別加入1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5和5 mL 5%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，50 ℃水浴反應(yīng)60 min后在769 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以確定5%碳酸鈉溶液的最佳用量。

1.4.3 福林酚試劑用量的確定

分別準(zhǔn)確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，再分別加入0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75和2 mL福林酚試劑，然后分別加入5%碳酸鈉溶液3 mL，蒸餾水定容至10 mL，50 ℃水浴反應(yīng)60 min后在769 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以確定福林酚試劑的最佳用量。

1.4.4 反應(yīng)溫度與時(shí)間的確定

準(zhǔn)確移取1.0 mL魔芋多酚提取液到10 mL容量瓶?jī)?nèi)，再依次加入1.25 mL福林酚試劑，3 mL 5%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL后分別置于25，30，35，40，45，50，55，60，65和70 ℃水浴反應(yīng)，測(cè)定其分別反應(yīng)20，40，60，80，100和120 min后在769 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，以確定最佳反應(yīng)溫度與時(shí)間。

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素的基礎(chǔ)上，選擇5%碳酸鈉用量、福林酚試劑添加量、反應(yīng)溫度3個(gè)因素，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平與編碼值

1.5 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

1.5.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3小節(jié)中制備的樣品提取液，按照1.4.5小節(jié)響應(yīng)面試驗(yàn)確定的最佳測(cè)定條件進(jìn)行反應(yīng)，靜置0，1，

2，3，4和5 h后再次測(cè)量其吸光度，計(jì)算出每次測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法在靜置一定時(shí)間后的穩(wěn)定性。

1.5.2 精密性試驗(yàn)

采用試驗(yàn)確定的最佳測(cè)定條件對(duì)同一魔芋樣品提取液進(jìn)行10次多酚含量測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的精密度。

1.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取5份同一魔芋樣品，按照1.3.1小節(jié)中的方法制備提取液，用試驗(yàn)確定的最佳測(cè)定條件測(cè)定吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的重現(xiàn)性。

1.5.4 沒(méi)食子酸加標(biāo)回收試驗(yàn)

取6份已知多酚含量的魔芋提取液，分別加入不同質(zhì)量的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照試驗(yàn)確定的最佳測(cè)定條件測(cè)定其多酚含量，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，評(píng)價(jià)該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。

1.6 樣品多酚含量的測(cè)定

1.6.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取10 mg沒(méi)食子酸，用蒸餾水溶解，并定容至100 mL，得到100 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 mL到10mL容量瓶中，蒸餾水定容，得到?jīng)]食子酸的質(zhì)量濃度分別為10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 μg/mL。

分別取1 mL各濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，依次加入福林酚試劑1.2 mL，5%的碳酸鈉溶液2.75 mL，蒸餾水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸餾水做參比，在769 nm下測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），反應(yīng)體系中沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），建立的回歸方程為。

1.6.2 樣品的測(cè)定

準(zhǔn)確取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.2mL 1 mol/L福林酚試劑，然后加入2.75 mL 5%的碳酸鈉溶液，蒸餾水定容至10 mL，62 ℃水浴60 min，以蒸餾水做參比，在769 nm下測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到魔芋提取液的多酚含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、分析；使用Origin 2021對(duì)進(jìn)行作圖；用Design-Expert 13統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

在堿性環(huán)境中多酚類化合物被鎢鉬酸氧化，而鎢鉬酸被還原（使W6+變?yōu)閃5+）生成藍(lán)色的化合物，藍(lán)色的深淺程度代表著多酚類化合物的含量[20]。將顯色反應(yīng)后的沒(méi)食子酸溶液和魔芋試樣溶液分別用紫外分光光度計(jì)于400～1 000 nm波長(zhǎng)進(jìn)行光譜掃描，選出最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果如圖1所示，769 nm處為沒(méi)食子酸和魔芋試樣溶液的最大吸收峰，因此選擇769 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的吸收光譜

2.1.2 碳酸鈉溶液用量的確定

多酚類化合物與福林酚試劑中的鎢鉬酸反應(yīng)必須在堿性條件才可以顯色，碳酸鈉溶液是顯色反應(yīng)中的支持介質(zhì)，碳酸鈉溶液加入量的多少將影響反應(yīng)體系中堿性的強(qiáng)弱，對(duì)顯色反應(yīng)有很大的影響。碳酸鈉溶液過(guò)量會(huì)析出晶體，使吸光度降低[21]。加入不同量5%碳酸鈉溶液對(duì)吸光度的影響如圖2所示，隨著碳酸鈉溶液用量的增加，反應(yīng)液的吸光度總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)碳酸鈉溶液用量為3 mL時(shí)，反應(yīng)液的吸光度最大，故碳酸鈉的用量選擇為2.5～3.5 mL較為合適。

圖2 碳酸鈉用量對(duì)吸光度的影響

2.1.3 福林酚試劑用量的確定

福林酚試劑用量決定著多酚化合物是否完全氧化，對(duì)顯色反應(yīng)有直接影響。不同的福林酚試劑加入量對(duì)吸光度的影響如圖3所示，福林酚試劑用量在0.25～1.25 mL的范圍內(nèi)，隨著用量的增大，反應(yīng)液的吸光度逐漸增大，當(dāng)福林酚試劑用量大于1.25 mL，反應(yīng)液的吸光度急劇下降后趨于平緩。吳澎等[21]在櫻桃酒中總酚含量測(cè)定中發(fā)現(xiàn)福林酚試劑用量過(guò)大會(huì)使溶液呈現(xiàn)淡綠色引起吸光度出現(xiàn)下降，作者認(rèn)為當(dāng)顯色劑過(guò)量后反應(yīng)體系將呈現(xiàn)出顯色劑本身的顏色。為確保測(cè)定方法的靈敏度高，選擇的福林酚試劑用量為

圖3 FC試劑用量對(duì)吸光度的影響

1～1.5 mL。

2.1.4 反應(yīng)溫度與時(shí)間的確定

提取液中的多酚化合物與加入的福林酚試劑反應(yīng)需要一定的溫度及時(shí)間。不同反應(yīng)溫度在不同反應(yīng)時(shí)間的吸光度如圖4所示，在25～45 ℃條件下反應(yīng)，吸光度隨顯色時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，無(wú)相對(duì)穩(wěn)定時(shí)間；75 ℃條件下反應(yīng)60 min后，吸光度隨水浴時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，說(shuō)明溫度高能加快顯色進(jìn)程，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系的穩(wěn)定性較差，50～70 ℃條件下反應(yīng)，顯色60 min后，體系吸光度變化很小，表明顯色反應(yīng)基本完全，顯色體系穩(wěn)定性很好，其中65 ℃條件下顯色后吸光度較高且穩(wěn)定性好，故選擇的反應(yīng)溫度范圍為60～70 ℃，確定60 min作為反應(yīng)時(shí)間。

圖4 反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果與方差分析

利用Design Expert 13軟件對(duì)三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到回歸模型方程：吸光度（Y）=-2.24+0.17A-1.35B+0.096C+0.26AB-0.004 3AC+0.015BC-0.038A2-0.13B2-0.000 76C2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)表3分析可知，二次回歸模型的F=196.19（P＜0.01），表明該模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)表示模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項(xiàng)差異不顯著（P＞0.05），試驗(yàn)理論和實(shí)際值偏差很小，得到的回歸模型能夠很好地的預(yù)測(cè)響應(yīng)值。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臎Q定系數(shù)R2=0.996 1，說(shuō)明魔芋多酚含量的測(cè)定結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果具有良好的一致性，校正系數(shù)0.991 0也進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可靠性。通過(guò)回歸方程中F值判斷各因素對(duì)魔芋中多酚檢測(cè)的影響主次順序?yàn)镃＞B＞A。通過(guò)回歸模型方差分析得到模型的一次項(xiàng)中碳酸鈉用量、福林酚試劑用量、反應(yīng)溫度對(duì)魔芋中多酚的測(cè)定結(jié)果影響均為極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)中AB、AC、BC對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)中A2、B2、C2對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響均為極顯著（P＜0.01）。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面3D曲面圖的形狀反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，結(jié)果如圖5～圖7所示。對(duì)魔芋中多酚含量測(cè)定的交互項(xiàng)進(jìn)行考察，響應(yīng)面圖可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)中設(shè)置的試驗(yàn)因素對(duì)魔芋中多酚含量測(cè)定的交互作用[22]，響應(yīng)面的坡度越陡，說(shuō)明該因素對(duì)魔芋中多酚含量測(cè)定的影響越大[23-24]；反之則表明該因素對(duì)魔芋中多酚含量測(cè)定的影響越小[21,25]。在交互項(xiàng)對(duì)測(cè)定濃度的影響中，碳酸鈉用量與福林酚試劑用量、碳酸鈉用量與反應(yīng)溫度、福林酚試劑用量與反應(yīng)溫度的交互作用均顯著，這與方差分析的結(jié)果相符。

圖5 碳酸鈉用量和福林酚試劑用量響應(yīng)面

圖6 碳酸鈉用量和反應(yīng)溫度響應(yīng)面

圖7 福林酚用量和反應(yīng)溫度響應(yīng)面

2.2.3 最佳測(cè)定條件的確認(rèn)

利用Design Expert 13軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，最佳測(cè)定條件為5%碳酸鈉溶液用量2.756 mL、福林酚試劑用量1.205 mL、反應(yīng)溫度62.44 ℃。在此條件下，預(yù)估的吸光度為0.430。參照分析得出的最佳測(cè)定條件，在實(shí)際操作中稍作調(diào)整：5%碳酸鈉溶液用量2.75 mL、福林酚試劑用量1.20 mL、水浴反應(yīng)溫度62 ℃，進(jìn)行5次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，所測(cè)得的吸光度平均值為0.419±0.001，驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果與分析得出的預(yù)估值相近，吻合度達(dá)97.35%，說(shuō)明該模型具有很好的預(yù)測(cè)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.3 測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的魔芋多酚提取液，按照最佳測(cè)定條件進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，在與顯示劑反應(yīng)完全后避光放置，不同時(shí)間后測(cè)定吸光度見(jiàn)表4。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度有緩慢上升的趨勢(shì)，但幅度不大，相對(duì)偏差為2.13%，說(shuō)明該方法在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.2 精密性試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳測(cè)定條件進(jìn)行精密性驗(yàn)證試驗(yàn)，對(duì)同一個(gè)提取液樣品進(jìn)行10次測(cè)定，結(jié)果如表5所示。相對(duì)偏差為0.75%，說(shuō)明該方法具有較高的精密度，能滿足魔芋多酚的測(cè)定要求。

表5 精密性試驗(yàn)

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取5份魔芋多酚提取液，用響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳測(cè)定條件測(cè)定其多酚含量，結(jié)果見(jiàn)表6。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%，說(shuō)明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在6份1 mL的魔芋多酚提取液中分別加入10，20，30，40，50和60 μg的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，按照響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳測(cè)定條件進(jìn)行3次檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，加標(biāo)回收試驗(yàn)的回收率最高為101.22%，最低為97.99%，平均回收率為100.07%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.20%。進(jìn)一步證明了該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

魔芋中多酚檢測(cè)中反應(yīng)溫度對(duì)魔芋中多酚測(cè)定的影響最大，其次為福林酚試劑用量，碳酸鈉用量的影響最小。參照響應(yīng)面分析結(jié)果，將實(shí)際測(cè)定條件稍作調(diào)整，確定的測(cè)定條件為5%碳酸鈉溶液用量2.75 mL、福林酚試劑用量1.20 mL、反應(yīng)溫度62 ℃，待其反應(yīng)60 min后在波長(zhǎng)769 nm處測(cè)定吸光度。測(cè)定方法評(píng)價(jià)結(jié)果表明該檢測(cè)方法操作過(guò)程簡(jiǎn)單、便捷，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，精密度、回收率高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為魔芋研究提供試驗(yàn)參考。