李旺旺，李琳琳，梁斌，汪旭海，李恒明，龍門*

1. 生物與食品工程學(xué)院滁州學(xué)院（滁州 239000）；2. 安徽泓順源生物科技有限公司（滁州 239000）

市場上蜂蜜種類繁多，但消費者對蜂蜜產(chǎn)品的辨識度不夠，許多不法分子為牟取暴利，通過摻雜使假等手段制作假蜂蜜[1]。蜂蜜是以果糖和葡萄糖為主的多糖類物質(zhì)，其含量占蜂蜜的70%～80%[2]，因此在蜂蜜中混入類似的糖類物質(zhì)是常見的摻假手段。最初是在蜂蜜中摻入白糖水[3]，但此種摻假手段易被感官技術(shù)和理化檢測辨別出來，現(xiàn)在最常見的是在蜂蜜中摻入高果糖漿、淀粉糖漿等[4]。摻入糖漿的蜂蜜成分雖然與天然蜂蜜成分類似，但其營養(yǎng)價值截然不同，且消費者食用后，造成血糖升高可引發(fā)糖尿病、體重增加、血脂水平增加等[5]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉類、糖類或代糖類物質(zhì)[6]。

現(xiàn)階段，常采用感官檢驗法[7]、花粉分析法[8]和理化指標(biāo)測試法[9-11]進(jìn)行蜂蜜品質(zhì)分析。其中：感官檢驗法需要檢測人員擁有豐富的經(jīng)驗，且存在一定主觀性；花粉分析法雖操作簡單、耗時短、成本低，受外界環(huán)境影響大，存在較大不確定性，只能作為判斷蜂蜜真?zhèn)蔚某鹾Y手段；理化檢測耗時長、過程繁瑣、人為誤差大。近年來，隨著儀器分析的發(fā)展，有學(xué)者使用不同檢測技術(shù)對蜂蜜品質(zhì)進(jìn)行控制，以期規(guī)范蜂蜜市場秩序，主要包括液相色譜質(zhì)譜法[12-14]、氣相色譜法[15-16]、電子舌法[17]、穩(wěn)定同位素技術(shù)[18]和光譜法[19-20]，但這些檢測方法只在一定范圍內(nèi)適用，并且面對不斷提升的造假摻假技術(shù)，實際使用中更難以滿足市場監(jiān)管需求。

低場核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)是利用不同物質(zhì)的弛豫時間不同，同一物質(zhì)處于不同相態(tài)的弛豫時間也有區(qū)別以分辨不同物質(zhì)，是一種無損、快速的檢測方法，被廣泛應(yīng)用于食品安全檢測領(lǐng)域[21]。彭丹等[22]采用低場核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)，分別利用聚類分析和支持向量機對花生油摻入大豆油（玉米油）進(jìn)行鑒別，結(jié)果表明支持向量機相比于聚類分析可更好地實現(xiàn)對花生油真?zhèn)蔚蔫b別，該模型對摻偽花生油的正確識別率為100%；張美軍[23]通過低場核磁共振技術(shù)對不同產(chǎn)區(qū)五味子進(jìn)行自旋回波衰減信號（carr purcell meiboom gill sequence，CPMG）分析，結(jié)合最小二乘回歸法交叉驗證確定建立五味子樣品合適的水分與揮發(fā)油含量預(yù)測模型，從而實現(xiàn)五味子不同產(chǎn)地來源的區(qū)分；蓋圣美等[24]利用低場核磁共振及磁共振成像技術(shù)實現(xiàn)對注水肉糜的快速鑒別。

熒光光譜分析技術(shù)的原理是利用樣品中熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光效應(yīng)，這些熒光物質(zhì)可以是源自于食品樣品內(nèi)部，即由樣品自身成分產(chǎn)生熒光效應(yīng)，被稱為內(nèi)源性熒光物質(zhì)（autofluorescence）[25]。蜂蜜含有大量的熒光團(tuán)，如多酚、少量蛋白質(zhì)、肽、氨基酸（色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）[26-27]。這些熒光物質(zhì)可以在一定的激發(fā)波長范圍內(nèi)發(fā)出熒光。因此，熒光光譜法適用于鑒定蜂蜜的真實性。試驗以純油菜蜜為研究對象，利用LF-NMR技術(shù)和三維同步熒光技術(shù)（threedimensional total synchronous fluorescence spectroscopy，3D-SFS）結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對摻假比例0～100%的油菜蜜進(jìn)行檢測，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立蜂蜜摻假判別模型，實現(xiàn)對糖漿摻假油菜蜜的有效識別，為蜂蜜的鑒別和質(zhì)量監(jiān)控提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

純油菜蜜（產(chǎn)地分別為江蘇、內(nèi)蒙古呼倫貝爾市海拉爾區(qū)安徽、四川，安徽泓順源生物科技有限公司）；麥芽糖漿80B、果葡糖漿F60、全蔗糖糖漿（廣西梧州樂哈哈食品工業(yè)有限公司）；3D-SFS檢測時使用1 cm×1 cm石英比色皿。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MesoMR23-060V-I核磁共振分析儀（上海紐邁電子科技有限公司）；Cary Eclipse型熒光分光光度計（美國安捷倫科技公司）；PL203型電子天平（英國梅特勒-托利多儀器有限公司）；HHS-11-4電熱恒溫水浴鍋（常州恒隆儀器有限公司）；HYQ-3111渦旋混勻器（上海珂淮儀器有限公司）；DHG-9101-OSA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 樣品制備

將3種糖漿與4個產(chǎn)地油菜蜜按照不同比例進(jìn)行混合設(shè)置試驗組。糖漿與蜂蜜的總質(zhì)量固定為10 g，摻假比例按照0～100%進(jìn)行設(shè)置，糖漿增量5%，共設(shè)置21個梯度；稱取目標(biāo)梯度的蜂蜜，按照摻假比例再稱取對應(yīng)質(zhì)量的糖漿混合，使用渦旋混勻器以300 r/min轉(zhuǎn)速混勻1 min，使糖漿與蜂蜜充分混合，置于45 ℃恒溫水浴鍋中45 min去除水泡，形成由3個純植物糖漿樣品、4個純蜂蜜樣品、19×12個摻假蜂蜜樣品組成的235個樣品，形成樣品組。

1.3.2 蜂蜜水分檢測

將稱量瓶洗凈烘干，稱量其質(zhì)量，記為m1，往稱量瓶中加入5 g海砂，將其置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥1 h，取出后將其置于放有有效干燥劑的干燥器內(nèi)冷卻0.5 h，稱量其質(zhì)量，重復(fù)干燥及冷卻操作直至稱量結(jié)果恒重（前后2次質(zhì)量差不超過0.000 2 g）。向稱量好海砂的稱量瓶中稱取2 g（稱量結(jié)果精確至0.000 1g）樣品，記為m2。輕微搖動稱量瓶使樣品與海砂充分混勻。混勻后置于沸水浴上蒸干。蒸干后置于105℃恒溫干燥箱中4 h。取出后置于放有有效干燥劑的干燥器中冷卻0.5 h，取出后對其質(zhì)量進(jìn)行稱量，稱量完成后置于恒溫干燥箱中干燥1 h，干燥結(jié)束后取出，置于干燥器中冷卻0.5 h，對其質(zhì)量再次進(jìn)行稱量，若前后稱量結(jié)果不超過0.000 2 g則達(dá)到恒重，若未能達(dá)到恒重，則重復(fù)干燥及冷卻操作直至其達(dá)到恒重，最后一次的稱量結(jié)果記為m3。樣品水分按式（1）計算。

式中：M為樣品水分，g/100 g；m1為稱量瓶質(zhì)量，g；m2為稱量瓶（含海砂）質(zhì)量與樣品干燥前質(zhì)量，g；m3為稱量瓶（含海砂）質(zhì)量與樣品干燥后質(zhì)量，g。

1.3.3 LF-NMR檢測

樣品的預(yù)處理：將235個摻假蜂蜜樣品從冰箱中取出，置于45 ℃恒溫水浴鍋中恒溫加熱45 min。

核磁共振分析儀的參數(shù)設(shè)置：序列設(shè)置為QCPMG，譜寬（SW）100，中心頻率416 796.321 Hz，測試溫度32 ℃，脈沖寬度（p1）11 μs，延遲時間（d1）1 s，掃描次數(shù)（ns）8。

1.3.4 3D-SFS檢測

掃描模式設(shè)置為同步模式，數(shù)據(jù)模式為熒光，激發(fā)波長200 nm，起始波長250 nm，終止波長850 nm，激發(fā)狹縫5 nm，發(fā)射狹縫5 nm，激發(fā)終止波長750nm，激發(fā)波長增量5 nm，掃描速度中等。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖漿摻入比例與蜂蜜水分的關(guān)系

由圖1～圖3可以看出：四川、海拉爾與安徽3個產(chǎn)地油菜蜜摻假樣品的水分與蔗糖糖漿的摻入比例存在明顯線性關(guān)系，3個產(chǎn)地的油菜蜜摻假樣品的水分均隨著蔗糖糖漿摻入比例的增加而增加，而江蘇產(chǎn)地的油菜蜜摻假樣品與蔗糖糖漿的摻入比例并不存在明顯線性關(guān)系；摻入麥芽糖漿的油菜蜜樣品的水分與摻入比例均存在明顯線性關(guān)系，4個產(chǎn)地油菜蜜摻假樣品的水分隨著麥芽糖漿摻入比例的提高而下降，同時表明麥芽糖漿導(dǎo)致的這種趨勢走向與油菜蜜的來源地之間無明顯關(guān)系；四川與海拉爾2個產(chǎn)地油菜蜜的水分與摻入果葡糖漿的比例無線性關(guān)系，而江蘇與安徽產(chǎn)地油菜蜜的水分與摻入果葡糖漿的比例表現(xiàn)出弱正相關(guān)關(guān)系，隨著果葡糖漿摻入比例的提高，這2個產(chǎn)地油菜蜜摻假樣品的水分增加，說明果葡糖漿的摻入量是影響江蘇與安徽2個產(chǎn)地油菜蜜水分的因素但不是主要影響因素。

圖1 4個產(chǎn)地油菜蜜的水分與蔗糖糖漿比例的線性關(guān)系圖

圖2 4個產(chǎn)地油菜蜜的水分與麥芽糖漿比例的線性關(guān)系圖

圖3 4個產(chǎn)地油菜蜜的水分與果葡糖漿比例的線性關(guān)系圖

2.2 LF-NMR采集的樣品數(shù)據(jù)分析

采用Levenberg-Marquardt，選取160個摻假蜂蜜樣品作為訓(xùn)練集，34個摻假蜂蜜樣品作為驗證集，34個摻假蜂蜜樣品作為測試集，隱含神經(jīng)元數(shù)量默認(rèn)為10，經(jīng)訓(xùn)練得到圖4。訓(xùn)練集、驗證集、測試集及綜合集的R值分別為0.799 24，0.367 57，0.396 236與0.691 8，R值越接近1說明擬合程度越好，從綜合訓(xùn)練結(jié)果圖來看，訓(xùn)練集、驗證集、測試集與綜合集的數(shù)據(jù)的擬合效果都差強人意，因此此模型不適合用作判別摻入植物糖漿的蜂蜜。

圖4 核磁共振測數(shù)據(jù)所做的蜂蜜摻假判別模型圖

2.3 3D-SFS樣品數(shù)據(jù)分析

2.3.1 特征發(fā)射波長差Δλ的選取

通過對3種純糖漿、4個產(chǎn)地純蜂蜜與4個產(chǎn)地?fù)饺?種糖漿50%比例的蜂蜜的三維同步熒光圖發(fā)現(xiàn)，發(fā)射波長差Δλ=80 nm時，其熒光強度變化差異最大。根據(jù)圖5可以發(fā)現(xiàn)，在激發(fā)波長Ex=250～450 nm附近的熒光強度（R.U）變化差異非常明顯，說明樣品中熒光物質(zhì)的差異在此處最為明顯。

圖5 發(fā)射波長差Δλ=80 nm時安徽、江蘇、海拉爾與四川4種產(chǎn)地的油菜蜜與麥芽、蔗糖與果葡3種糖漿的熒光強度變化圖

2.3.2 主成分分析

根據(jù)選取的特征發(fā)射波長Δλ=80 nm對3種純糖漿與4種純蜂蜜樣品的三維同步熒光數(shù)據(jù)在此波長時的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，得到圖6，提取的第一主成分、第二主成分與第三主成分對數(shù)據(jù)的信息描述分別為75.67%，19.72%與4.13%，三者累加的數(shù)據(jù)信息表述量為99.52%，說明3個主成分包含原數(shù)據(jù)的99.52%。蜂蜜與糖漿之間可以明顯區(qū)分開，4種蜂蜜聚集在一起而3種糖漿則分散開，說明所選擇的發(fā)射波長差Δλ=80 nm可作為用于判別摻入植物糖漿的蜂蜜的特征發(fā)射波長。

圖6 3種純糖漿與4種純蜂蜜樣品的三維同步熒光主成分分析圖

2.3.3 利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立蜂蜜摻假判別模型

數(shù)據(jù)的訓(xùn)練算法采用Levenberg-Marquardt，選取160個摻假蜂蜜樣品作為訓(xùn)練集，34個摻假蜂蜜樣品作為驗證集，34個摻假蜂蜜樣品作為測試集，隱含神經(jīng)元數(shù)量默認(rèn)為10，經(jīng)訓(xùn)練得到圖7。訓(xùn)練集、驗證集、測試集及綜合集的R值分別為1，0.946 54，0.974 86與0.946 54，R值越接近1說明，擬合程度越好，綜合訓(xùn)練結(jié)果圖來看，訓(xùn)練集、驗證集、測試集與綜合集對數(shù)據(jù)的擬合效果較好，因此模型可用作判別摻入植物糖漿的蜂蜜。

圖7 三維同步熒光檢測數(shù)據(jù)所做的蜂蜜摻假判別模型圖

3 結(jié)論

通過建立散點圖分析油菜蜜摻假樣品與植物糖漿摻入量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，麥芽糖漿的水分與油菜蜜的水分有著明顯差異，且麥芽糖漿在蜂蜜中的摻入量與油菜蜜的水分變化呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，且這種線性變化趨勢受蜂蜜的來源地影響很小，因此在檢測摻入麥芽糖漿的蜂蜜時可將水分作為一個有效的檢測指標(biāo)。摻入蔗糖糖漿的油菜蜜的水分與糖漿摻入量之間的關(guān)系受到蜂蜜來源地的影響，無明顯線性關(guān)系。摻入果葡糖漿油菜蜜的水分與糖漿摻入量之間無線性關(guān)系，其水分受其他因素的影響。因此，鑒別摻入植物糖漿的蜂蜜時，水分只能作為參考指標(biāo)，準(zhǔn)確鑒定則需依靠其他有效的鑒別方法。

對蜂蜜和摻假蜂蜜（植物糖漿+油菜蜜）的LFNMR和3D-SFS采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)探索區(qū)植物糖漿摻假蜂蜜可行性。從LF-NMR數(shù)據(jù)建立的模型擬合結(jié)果來看，該模型的適用性不強。從3D-SFS的數(shù)據(jù)建立的模型擬合結(jié)果來看，其在識別摻入植物糖漿蜂蜜時適用性好。摻入植物糖漿后，油菜蜂蜜的熒光物質(zhì)強度變化有明顯規(guī)律，在發(fā)射波長Δλ=80 nm，激發(fā)波長Ex=250～450 nm時，其變化最為明顯，通過主成分分析對此特征發(fā)射波長差的適用性做了進(jìn)一步驗證，綜上所述3D-SFS可簡單、快速地用于未知蜂蜜的植物糖漿摻假鑒別，為規(guī)范蜂蜜市場提供有利依據(jù)。