李怡斯，陳麗詩(shī)，黃熙照，張珊珊，宋豐林

廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（中山 528458）

芹菜素（apigenin，APG）是一種廣泛存在于多種水果、蔬菜及茶葉中的天然黃酮類(lèi)化合物。研究證明芹菜素具有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成、抗腫瘤等作用[1]。在糖尿病大鼠模型中，芹菜素能通過(guò)抑制二肽基肽酶4（DPP-4）的活性，減輕胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激、保護(hù)胰島β細(xì)胞線粒體膜免受損傷等作用機(jī)制，降低糖尿病大鼠血糖水平[2-4]。

糖尿病是一種以血糖水平異常增高為主要特征的代謝性疾病，長(zhǎng)期持續(xù)高血糖是糖尿病患者慢性血管并發(fā)癥的主要原因[5]，并且會(huì)導(dǎo)致心臟、眼睛、腎臟和神經(jīng)等器官的病變[6]。長(zhǎng)期血糖升高對(duì)紅細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，還有毛細(xì)血管壁造成損傷，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜的硬度增強(qiáng)，不利于紅細(xì)胞的生理功能的發(fā)揮，尤其在微循環(huán)方面。紅細(xì)胞過(guò)多聚集導(dǎo)致全血黏度升高，使得血管微循環(huán)發(fā)生障礙，這是誘發(fā)糖尿病血管并發(fā)癥的主要原因。若長(zhǎng)期糖耐量減低和控制血糖不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致微血管并發(fā)癥的發(fā)生[7]。

糖尿病會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞的血紅蛋白和膜蛋白上出現(xiàn)不正常的糖化作用。高血糖擾亂了細(xì)胞的抗氧化防御體系，主要通過(guò)葡萄糖氧化、蛋白質(zhì)的非酶糖基化及糖化蛋白質(zhì)的氧化降解產(chǎn)生自由基的途徑。組織中糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）的產(chǎn)生和積累與糖尿病及其并發(fā)癥有關(guān)，AGEs與受體的結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)的改變和自由基的進(jìn)一步產(chǎn)生，改變蛋白質(zhì)和細(xì)胞的功能；血紅蛋白對(duì)葡萄糖損傷尤其敏感，并且會(huì)導(dǎo)致血紅素的完全破壞，高血糖導(dǎo)致的應(yīng)激可以產(chǎn)生活性氧族（reactive oxygen species，ROS），進(jìn)而改變血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[8]。

糖尿病治療的目標(biāo)是通過(guò)控制高血糖和代謝紊亂以消除糖尿病癥狀和防止出現(xiàn)并發(fā)癥[9]，因此，臨床治療主要以藥物控制血糖為主，以此來(lái)完成對(duì)患者血糖的有效控制，改善血糖指標(biāo)，降低并發(fā)癥發(fā)生率，取得良好的血糖控制效果[6]。試驗(yàn)通過(guò)在體外建立紅細(xì)胞高糖損傷模型，以芹菜素作為干預(yù)物進(jìn)行研究，通過(guò)紅細(xì)胞溶血率、糖化血紅蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）、丙二醛含量（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定來(lái)研究芹菜素對(duì)紅細(xì)胞高糖損傷的保護(hù)作用，并探討芹菜素可能的作用機(jī)制，為芹菜素用于防治2型糖尿病相關(guān)并發(fā)癥提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No.520-36-5，純度≥98%，中國(guó)阿拉丁公司）；糖化血紅蛋白（A056-1-1）、MDA測(cè)定試劑盒（A003-2）、GSH測(cè)定盒（A006-2-1）、CAT測(cè)定試劑盒（A007-1-1）、SOD測(cè)定試劑盒（均購(gòu)自南京建成生物工程研究所）；0.01 mol/L PBS緩沖液（南京建成生物工程研究所）；CM-H2DCFDA ROS熒光探針（美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅細(xì)胞懸液制備與干預(yù)

紅細(xì)胞懸液的制備：采集健康志愿者外周血，置于枸緣酸鈉抗凝管中，以28 ℃，3 000 r/min離心10min，去除血漿和中間白細(xì)胞層。用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌紅細(xì)胞3次，用PBS配成體積分?jǐn)?shù)1%，4%和40%的紅細(xì)胞懸液。

紅細(xì)胞懸液分為對(duì)照組、高糖損傷模型組（模型組）、芹菜素不同劑量組（終濃度20，40和80 μmol/L），具體為：對(duì)照組，6 mmol/L葡萄糖干預(yù)；高糖損傷模型組，50 mmol/L葡萄糖干預(yù)；低劑量芹菜素干預(yù)組，50 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L芹菜素；中劑量芹菜素干預(yù)組，50 mmol/L葡萄糖+40 μmol/L芹菜素；高劑量芹菜素干預(yù)組：50 mmol/L葡萄糖+80 μmol/L芹菜素。芹菜素干預(yù)組的紅細(xì)胞懸液中分別加入不同劑量的芹菜素，使紅細(xì)胞與干預(yù)物充分混勻后于37 ℃孵育30 min。除對(duì)照組外，其他各組紅細(xì)胞中加入50 mmol/L葡萄糖，于37 ℃ 繼續(xù)孵育24 h。

1.2.2 紅細(xì)胞溶血率的測(cè)定

紅細(xì)胞受到氧化損傷會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞膜破裂，引發(fā)溶血反應(yīng)，胞內(nèi)血紅蛋白流出，致使培養(yǎng)的細(xì)胞懸液上清液呈現(xiàn)淡紅色或紅色。干預(yù)完成后的紅細(xì)胞懸液用PBS按照1∶4（V/V）進(jìn)行稀釋?zhuān)? 000 r/min離心5 min，取200 μL上層清液測(cè)定其在540 nm波長(zhǎng)下吸光度A。同時(shí)用預(yù)冷雙蒸水處理紅細(xì)胞培養(yǎng)液并置于冰上反應(yīng)5 min，作為100%溶血對(duì)照，測(cè)定全溶血對(duì)照紅細(xì)胞的吸光度A0，按式（1）計(jì)算各個(gè)試驗(yàn)組的紅細(xì)胞溶血率。

式中：A為添加不同濃度芹菜素的樣品測(cè)得的吸光度；A0為全溶血測(cè)得的吸光度。

1.2.3 糖化血紅蛋白（Glycated hemoglobin，GHb）的測(cè)定

GHb含量可以反映機(jī)體的血糖情況，在試驗(yàn)研究中可以反映紅細(xì)胞的損傷程度。試驗(yàn)將各試驗(yàn)組的紅細(xì)胞懸液上清與沉淀混勻，用雙蒸水按照1∶4（V/V）進(jìn)行混合制備溶血液，置于冰上5min使紅細(xì)胞完全破裂。根據(jù)試劑盒提供試驗(yàn)方法對(duì)GHb進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 MDA、GSH和ROS含量的測(cè)定

取干預(yù)后的40%紅細(xì)胞懸液，與預(yù)冷的雙蒸水按1∶4（V/V）混勻后，冰浴5 min使紅細(xì)胞充分溶血。按照MDA和GSH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。另取1%紅細(xì)胞懸液孵育完成后，加入終濃度10 μmol/L的ROS熒光探針CM-H2DCFDA，充分混勻后于37 ℃避光孵育30 min，以PBS洗滌3次，充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光探針，洗滌后的紅細(xì)胞用PBS重懸，于流式細(xì)胞儀中測(cè)定紅細(xì)胞ROS水平。

1.2.5 紅細(xì)胞抗氧化酶活性的測(cè)定

40%紅細(xì)胞溶液按照1.2方法進(jìn)行處理，孵育完成后加入預(yù)冷的雙蒸水使紅細(xì)胞完全裂解，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行紅細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜素降低紅細(xì)胞溶血率

紅細(xì)胞孵育完成后，檢測(cè)得到對(duì)照組紅細(xì)胞溶血率為8.91%±1.81%，模型組紅細(xì)胞溶血率較對(duì)照組明顯升高，達(dá)16.78%±1.90%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，芹菜素干預(yù)組紅細(xì)胞的溶血率均有降低，20，40和80 μmol/L組溶血率分別為15.45%±1.63%，13.63%±1.73%和12.41%±1.67%，其中40和80 μmol/L組與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 芹菜素對(duì)紅細(xì)胞溶血率的影響

2.2 芹菜素降低紅細(xì)胞GHb

如圖2所示，50 mmol/L葡萄糖孵育后，紅細(xì)胞GHb含量為7.53%±0.45%，與對(duì)照組（3.58%±0.41%）相比顯著升高（P＜0.05）。20，40和80 μmol/L芹菜素干預(yù)后，紅細(xì)胞GHb含量分別為6.89%±0.60%，6.30%±0.61%和5.18%±0.85%，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 芹菜素對(duì)紅細(xì)胞GHb的影響

2.3 芹菜素降低紅細(xì)胞MDA、ROS生成并提高GSH含量

如圖3（A）所示，與對(duì)照組相比，50 mmol/L葡萄糖孵育后紅細(xì)胞中的MDA含量顯著升高（P＜0.01），紅細(xì)胞中ROS平均熒光強(qiáng)度也較對(duì)照組明顯升高（圖3 C），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與葡萄糖損傷組相比，中、高劑量芹菜素干預(yù)均能有效降低高糖環(huán)境下紅細(xì)胞MDA和ROS的生成（P＜0.01）。

圖3 芹菜素對(duì)紅細(xì)胞MDA、ROS、GSH含量的影響

GSH在保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化損傷方面起著非常重要的作用。由圖3（B）可知，高糖孵育使紅細(xì)胞中GSH含量降低至0.79±0.30 nmol/mg Hb，與對(duì)照組（4.58±1.09 nmol/mg Hb）相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。20，40和80 μmol/L芹菜素干預(yù)后，紅細(xì)胞GSH含量分別為0.98±0.44，1.59±0.43和2.16±0.43 nmol/mg Hb，其中40和80 μmol/L芹菜素干預(yù)組與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.4 芹菜素提高紅細(xì)胞抗氧化酶活性

紅細(xì)胞中SOD、CAT、GSH-Px在細(xì)胞抗氧化中發(fā)揮重要作用。由圖4可知，與正常組相比，高糖損傷組紅細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px酶活性均受到明顯抑制（P＜0.05）。與葡萄糖損傷組相比，芹菜素干預(yù)后紅細(xì)胞中SOD的活性均顯著提高（P＜0.05）。40和80 μmol/L芹菜素干預(yù)后，紅細(xì)胞CAT活性分別升高至190.80±36.02和219.60±29.45 U/g Hb，與高糖損傷組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組紅細(xì)胞GSH-Px活性為81.90±5.37 U/g Hb，在高糖損傷組紅細(xì)胞中其活性降低至63.81±6.74 U/g Hb，芹菜素可提高GSH-Px活性，其中80 μmol/L芹菜素干預(yù)組紅細(xì)胞GSH-Px活性為74.00±5.57 U/g Hb，與高糖損傷組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 芹菜素對(duì)紅細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性的影響

3 討論

紅細(xì)胞（red blood cells，RBCs）形如雙凹圓盤(pán)，循環(huán)于全身組織器官并發(fā)揮氣體交換的重要生理功能。在這一過(guò)程中，RBCs不斷遭到ROS攻擊，導(dǎo)致其漸進(jìn)損傷和最終衰老，主要原因是RBCs的特殊結(jié)構(gòu)。紅細(xì)胞膜脂質(zhì)富含不飽和脂肪酸，而多不飽和脂肪酸含有雙鍵，持續(xù)暴露于高氧水平極易被過(guò)氧化。紅細(xì)胞總蛋白的95%為富含自由基反應(yīng)的催化劑Fe2+的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）。成熟紅細(xì)胞無(wú)線粒體等細(xì)胞器，無(wú)法通過(guò)線粒體來(lái)消除ROS，所以損傷后很難自我修復(fù)[10]。紅細(xì)胞的重要生理作用和特殊結(jié)構(gòu)，使其更易受氧化應(yīng)激損傷，因此其通常用作氧化應(yīng)激研究的理想細(xì)胞模型。如果血液中血糖過(guò)高，便會(huì)結(jié)合蛋白質(zhì)包裹住紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞粘結(jié)在一起，增高血液的黏稠度，進(jìn)而使血液循環(huán)減慢[7]。紅細(xì)胞損傷是糖尿病并發(fā)癥中的較為嚴(yán)重的一類(lèi)，因此，利用紅細(xì)胞進(jìn)行抗氧化研究具有關(guān)鍵作用。

有研究結(jié)果指出，氧化應(yīng)激是引發(fā)2型糖尿病和加重病情的重要因素[11]。機(jī)體內(nèi)存在固有的清除和抑制自由基反應(yīng)的體系，正常情況下保持氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生ROS和抗氧化能力存在內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。氧化應(yīng)激是指ROS和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）在機(jī)體內(nèi)堆積過(guò)多，與抗氧化防御系統(tǒng)的清除之間失衡導(dǎo)致ROS和RNS過(guò)量產(chǎn)生，造成機(jī)體核酸和組織細(xì)胞及蛋白等大分子物質(zhì)的損傷[12]。長(zhǎng)期高血糖可通過(guò)線粒體電子傳遞鏈[13]、葡萄糖多元醇通路[14]和自氧化等途徑增加機(jī)體內(nèi)的ROS與RNS含量，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激。機(jī)體抗氧化的初級(jí)防御系統(tǒng)是由酶類(lèi)和非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮清除和抑制自由基作用所構(gòu)成。酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)是體內(nèi)的第一道抗氧化防線。線粒體電子傳遞鏈主要涉及酶復(fù)合物Ⅰ～Ⅳ、細(xì)胞色素c和輔酶Q，在酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ中會(huì)持續(xù)產(chǎn)生少量的超氧產(chǎn)物，包括超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基，而SOD、CAT和GPx會(huì)對(duì)超氧產(chǎn)物進(jìn)行催化將其轉(zhuǎn)化成水和氧氣。但如果在高血糖或者肥胖的情況下，超氧產(chǎn)物就會(huì)出現(xiàn)大幅增加的現(xiàn)象，當(dāng)其清除速率不及產(chǎn)生速率時(shí)便會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激[15]。體內(nèi)第二道防線是非酶類(lèi)抗氧化系統(tǒng)，它由小分子抗氧化物質(zhì)組成，包括水溶性抗氧化劑GSH、蛋白抗氧化劑膽紅素、脂溶性抗氧化劑維生素E、低分子化合物尿酸鹽、植物化學(xué)物質(zhì)、內(nèi)源性褪黑素等。SOD、CAT和GSH等可將機(jī)體內(nèi)多余的自由基清除，從而維持機(jī)體的氧化還原平衡[15-16]。因此，試驗(yàn)測(cè)定SOD、CAT、GSH-Px的活性和GSH含量，結(jié)果表明紅細(xì)胞經(jīng)高濃度芹菜素（80 μmol/L）干預(yù)后，紅細(xì)胞中SOD、GSH-Px、GSH活性或含量均顯著提高，但是CAT和GSH-Px活性不能恢復(fù)到對(duì)照組的正常水平，提示芹菜素可能通過(guò)提高紅細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性發(fā)揮抗氧化作用。

紅細(xì)胞膜脂質(zhì)中不飽和高級(jí)脂肪酸被氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA，MDA是具有很強(qiáng)生物毒性的羰基化合物，極易與細(xì)胞膜磷脂、蛋白質(zhì)等發(fā)生羰——氨交聯(lián)反應(yīng)，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和生理功能的喪失，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。MDA作為細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，是自由基致細(xì)胞損傷的標(biāo)記物之一，能直接地反映體內(nèi)自由基水平及脂質(zhì)過(guò)氧化程度[17-18]。有研究表明，氧化應(yīng)激條件下，紅細(xì)胞中MDA的含量明顯增加[19-20]，這與試驗(yàn)結(jié)果相吻合。芹菜素能在一定程度上顯著降低MDA的含量，提示芹菜素可能抑制血紅蛋白的氧化和不飽和高級(jí)脂肪酸的氧化，發(fā)揮對(duì)紅細(xì)胞的保護(hù)作用，且能夠保護(hù)紅細(xì)胞免受自由基的損傷。

糖尿病患者的抗氧化能力降低，且其體內(nèi)血漿和紅細(xì)胞中過(guò)氧化產(chǎn)物的水平較正常人高。ROS是生物有氧代謝過(guò)程中的一種中間產(chǎn)物，對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸具有潛在的氧化損傷能力[21-22]，當(dāng)體內(nèi)的抗氧化酶系（SOD、CAT和GSH-Px等）無(wú)法將其及時(shí)清除時(shí)，ROS便會(huì)因累積過(guò)多而對(duì)細(xì)胞和組織造成破壞，加重細(xì)胞損傷[19,23-25]。ROS可引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化使細(xì)胞膜通透性提高和功能的缺陷，誘發(fā)DNA損傷導(dǎo)致突變和死亡，富含巰基的蛋白質(zhì)交聯(lián)和硫化，致使非彈性老化蛋白的產(chǎn)生，特別是存在于細(xì)胞外基質(zhì)的膠原。試驗(yàn)表明，芹菜素能有效降低ROS的產(chǎn)生，從而減輕自由基和活性氧對(duì)紅細(xì)胞的破壞，起到抗氧化作用。

4 結(jié)論

結(jié)果顯示：芹菜素能夠抑制高濃度葡萄糖氧化損傷引起的紅細(xì)胞溶血，降低紅細(xì)胞中GHb、MDA和ROS的含量，提高紅細(xì)胞中GSH-Px、SOD、CAT活性和GSH含量，提示芹菜素可能通過(guò)提高紅細(xì)胞內(nèi)抗氧防御化能力對(duì)高濃度葡萄糖導(dǎo)致的紅細(xì)胞氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用。綜上，芹菜素可能對(duì)糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生具有一定預(yù)防保護(hù)作用，表明其作為食品功能性成分，在膳食預(yù)防和緩解糖尿病并發(fā)癥方面有廣闊的應(yīng)用遠(yuǎn)景，可對(duì)膳食防治糖尿病提供理論與方法指導(dǎo)。